張 鉞 尤留超 朱潁琨 莘 余 呂尚揆 裴淼毓 傅宏慶 沈留紅*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院/動(dòng)物疫病與人類(lèi)健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/奶牛疾病研究中心，成都 611130；2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300)

奶牛胎盤(pán)是奶牛養(yǎng)殖中的副產(chǎn)物，未得到有效利用，且處理不當(dāng)易造成環(huán)境污染和生物安全風(fēng)險(xiǎn)。而胎盤(pán)含大量肽類(lèi)、多糖類(lèi)、激素、脂質(zhì)和礦物質(zhì)等生物活性物質(zhì)[1]，多肽類(lèi)物質(zhì)可能是其主要活性成分，具有促免疫、抗氧化、促進(jìn)組織恢復(fù)和抗腫瘤等作用[2-4]。因此，從奶牛胎盤(pán)中提取活性多肽成分有利于新型肽類(lèi)藥物開(kāi)發(fā)，進(jìn)而促進(jìn)奶牛胎盤(pán)合理利用，減少因胎盤(pán)丟棄造成環(huán)境污染。

目前從動(dòng)植物成分中制備活性多肽的方法主要有直接分離法、超聲波破碎法和酶解法等。直接分離法要求嚴(yán)格、成本高，常用于確定的單個(gè)或幾個(gè)多肽研究[5]，無(wú)法對(duì)大量多肽樣本進(jìn)行篩選；超聲破碎法操作簡(jiǎn)便、省時(shí)省力、提取率高[6]，但其主要提取胎盤(pán)組織中可溶性蛋白和多肽，無(wú)法提取組織中不溶性蛋白，而胎盤(pán)不溶性蛋白質(zhì)亦可產(chǎn)生具有生物活性的多肽；而酶解法是制備成分種類(lèi)單一、作用方式較為確定的胎盤(pán)生物活性多肽有效方法，具有條件溫和、過(guò)程可控、成本較低等優(yōu)點(diǎn)[7]，能夠?qū)⒉蝗苄缘鞍酌附鉃樾『头肿恿恳子谖盏亩嚯?，更利于?duì)其活性成分研究。目前酶解動(dòng)植物組織制備多肽的酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶等[8]，不同蛋白酶酶解產(chǎn)物生物活性存在差異[9]。常采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-Diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine，DPPH)法、普魯士藍(lán)法和菲啰嗪法等測(cè)定多肽抗氧化活性，但上述方法與生物體內(nèi)活性氧產(chǎn)生和猝滅并無(wú)直接關(guān)聯(lián)，因此生物相關(guān)性低，只能評(píng)估體外抗氧化活性，不能進(jìn)一步分析抗氧化活性多肽序列。而液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(Liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/M)被廣泛用于功能性蛋白和多肽研究，如檢測(cè)紅酒中致敏蛋白[10]、大麥麥芽評(píng)估[11]及魚(yú)類(lèi)鑒定[12]等，可從原料中鑒定和分析大量蛋白及多肽序列，利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步研究多肽序列[13]。此外，LC-MS/MS技術(shù)識(shí)別的肽段數(shù)量，可決定蛋白質(zhì)組學(xué)敏感性和特異性[14]。目前尚未見(jiàn)奶牛胎盤(pán)抗氧化活性多肽序列及其制備抗氧化活性多肽蛋白酶選擇的相關(guān)研究。

因此，本研究旨在胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解奶牛胎盤(pán)獲得具有最優(yōu)還原活性和提取率多肽的基礎(chǔ)上[15-16]，利用LC-MS/M技術(shù)對(duì)酶解產(chǎn)物定性和定量分析，探究奶牛胎盤(pán)各種酶酶解產(chǎn)物間差異及對(duì)蛋白組學(xué)影響，并通過(guò)BIOPEP數(shù)據(jù)庫(kù)(http:∥www.uwm.edu.pl/biochemia/biopep/start_biopep.php)預(yù)測(cè)不同酶解產(chǎn)物抗氧化活性，發(fā)掘具有潛在抗氧化活性多肽，為奶牛胎盤(pán)蛋白組學(xué)研究對(duì)酶的選擇和奶牛胎盤(pán)抗氧化活性多肽的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選擇某規(guī)?；膛?chǎng)半封閉統(tǒng)一舍飼、2～4胎、體況良好、妊娠足月、自然分娩脫落的健康中國(guó)荷斯坦奶牛新鮮胎盤(pán)組織，其自然脫落后立即用生理鹽水清洗，除去胎盤(pán)內(nèi)殘留血液及污物，至胎盤(pán)子葉呈粉紅色后，于-20 ℃冷凍保存。

1.2 主要試劑和儀器

胰蛋白酶(Trypsin，250 U/mg，批號(hào)920T041)，胃蛋白酶(Pepsin，250 U/mg，批號(hào)810H021)，木瓜蛋白酶(Papain，800 U/mg，批號(hào)621G025)，北京索萊寶科技有限公司生物；0.1%甲酸水溶液、0.1%甲酸乙腈水溶液(乙腈84%)、自配。上樣柱(Thermo Scientific Acclaim PepMap100,100 μm×2 cm,nanoViper C18)，分析柱(Thermo scientific EASY column,10 cm，ID 75 μm,3 μm,C18-A2)，LYOQUEST 冷凍干燥機(jī)(阿自倍爾泰事達(dá))；SorvallTMLegendTMXT冷凍離心機(jī)(Thermo scientific)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1樣品制備和分組

參照胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解奶牛胎盤(pán)制備酶解產(chǎn)物最優(yōu)條件[15-16]：胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶的反應(yīng)時(shí)間分別為5.80、4.70和5.49 h，底物體積分?jǐn)?shù)分別為34.96%、34.03%和35.74%，酶底比分別為3.33%、3.66%和3.92%，每種蛋白酶重復(fù)3次，分別記為胰蛋白酶組(Trypsin)、胃蛋白酶組(Pepsin)和木瓜蛋白酶組(Papain)。

1.3.2LC-MS/MS分析

采用納升流速的HPLC液相系統(tǒng)Easy nLC進(jìn)行樣品分離。緩沖液A液為0.1%甲酸水溶液，B液為0.1%甲酸乙腈水溶液(乙腈為84%)。色譜柱以95%的A液平衡，樣品由自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)入上樣柱，經(jīng)過(guò)分析柱分離，流速為300 nL/min。

樣品經(jīng)色譜分離后用Q-Exactive質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。檢測(cè)方式為正離子，母離子掃描范圍300～1 800 m/z，一級(jí)質(zhì)譜分辨率70 000 at 200 m/z，AGC target為1e6，Maximum IT為50 ms，動(dòng)態(tài)排除時(shí)間為60 s。多肽和多肽碎片質(zhì)量電荷比按下列方法采集：每次全掃描后采集20個(gè)碎片圖譜(MS2 scan)，MS2 Activation Type為HCD，Isolation window為2 m/z，二級(jí)質(zhì)譜分辨率17 500 at 200 m/z，Normalized Collision Energy為30 eV，Underfill為0.1%。

1.3.3蛋白質(zhì)和肽段鑒定及定量分析

將質(zhì)譜分析原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入Max Quant軟件，基于Uniprot_Bos_taurus數(shù)據(jù)庫(kù)(https:∥www.uniprot.org)進(jìn)行蛋白質(zhì)和肽段鑒定及定量分析。部分相關(guān)參數(shù)設(shè)定：裂解酶，Trypsin/Papain/Pepsin；允許的最大漏切位點(diǎn)數(shù)，2；可信肽段的篩選標(biāo)準(zhǔn)(Peptide false discovery rate，Peptide FDR)，≤0.01；一級(jí)離子質(zhì)量容差，6 ppm；二級(jí)離子質(zhì)量容差，20 ppm；固定修飾，脲甲基化；可變修飾，氧化。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，單因素方差分析和鄧肯多極差檢驗(yàn)組間差異，P<0.01為差異極顯著，P<0.05為差異顯著。使用GraphPad Prism 8.0繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物質(zhì)譜及蛋白鑒定分析

質(zhì)譜分析顯示胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物鑒定多肽的峰值均出現(xiàn)在質(zhì)荷比(m/z)400以下，且波形相似，最大峰值在303～305 m/z，表明此質(zhì)譜分析準(zhǔn)確和生物學(xué)重復(fù)均一。

胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物蛋白鑒定結(jié)果見(jiàn)圖1，去除重復(fù)后，三組蛋白酶分別鑒定出541、136和86個(gè)蛋白。胰蛋白酶酶解產(chǎn)物鑒定蛋白數(shù)極顯著高于其余2種酶(P<0.01)，胃蛋白酶顯著高于木瓜蛋白酶(P<0.05)。

**P<0.01表示差異極顯著，*P<0.05表示差異顯著。下同。**P<0.01 indicates extremely significant differences,*P<0.05 indicates significant difference. The same below.圖1 胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物鑒定蛋白數(shù)量Fig.1 Numbers of identified proteins in trypsin, pepsin and papain hydrolysates

胰蛋白酶酶解產(chǎn)物鑒定蛋白中330種蛋白(61.11%)的分子量在10～60 ku，85種蛋白(15.74%)分子量超過(guò)100 ku(圖2(a))；大多數(shù)蛋白(471個(gè)，87.22%)由從1～10個(gè)多肽鑒定出，平均值為5.98個(gè)多肽(圖2(b))；序列覆蓋率大于25%的蛋白有103個(gè)(19.07%)，247個(gè)(45.74%)大于10%(圖2(c))。胃蛋白酶酶解產(chǎn)物分子量在10～60 ku的蛋白共92種(67.65%)，27種蛋白(21.26%)分子量超過(guò)100 ku(21.26%)(圖2(d))；92個(gè)蛋白67.65%)由從1～10個(gè)多肽鑒定出，平均值為14.46個(gè)多肽(圖2(e))；序列覆蓋率大于25%的蛋白有45個(gè)(32.85%)，86個(gè)(62.77%)大于10%(圖2(f))。木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量、肽段數(shù)量、和序列覆蓋分布見(jiàn)圖2：48種蛋白(55.81%)分子量在10～60 ku，15種蛋白(17.44%)分子量超過(guò)100 ku(圖2(g))；74個(gè)蛋白(86.05%)由從1～10個(gè)多肽鑒定出，平均值為 8.88 個(gè)多肽(圖2(h))；序列覆蓋率大于25%的蛋白有17個(gè)(19.77%)，36個(gè)(41.86%)大于10%(圖2(i))。

(a)～(c)胰蛋白酶；(d)～(f)胃蛋白酶；(g)～(i)木瓜蛋白酶(a)-(c) Trypsin； (d)-(f) Pepsin； (g)-(i) Papain圖2 胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解蛋白的相對(duì)分子量、肽段組成和蛋白片段覆蓋率Fig.2 Molecular weight, peptide counts and protein sequence coverage of identified proteins in trypsin, pepsin and papain hydrolysates

2.2 胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物肽段鑒定及分析

胰蛋白酶，胃蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物蛋白鑒定結(jié)果見(jiàn)圖3，去除重復(fù)共鑒定出2 766、1 170和128個(gè)肽段。胰蛋白酶鑒定肽段數(shù)極顯著高于其余2種酶(P<0.01)，胃蛋白顯著高于木瓜蛋白酶(P<0.05)。

圖3 胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物鑒定肽段數(shù)Fig.3 Numbers of identified peptides in trypsin, pepsin and papain hydrolysates

胰蛋白酶酶解產(chǎn)物2 463種(89.05%)肽段相對(duì)分子量小于3 000 u，257種肽段相對(duì)分子量小于1 000 u(圖4(a))，其中255種長(zhǎng)度在十肽及以下；肽段長(zhǎng)度在十肽及以下有654種(圖4(d))。胃蛋白酶酶解產(chǎn)物所有肽段對(duì)分子量均在3 000 u以下，106種肽段相對(duì)分子量小于1000 u(圖4(b))，其中95種長(zhǎng)度在十肽及以下；肽段長(zhǎng)度在十肽及以下有247種(圖4(e))。木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物所有肽段對(duì)分子量均在3 000 u以下，相對(duì)分子量小于1 000 u 有10種(圖4(c))，且其長(zhǎng)度均在十肽及以下；有30種肽段長(zhǎng)度在十肽及以下(圖4(f))。

2.3 胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物鑒定肽段的抗氧化活性預(yù)測(cè)

胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物鑒定肽段利用BIO-PEP數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行匹配，未發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)含的抗氧化活性多肽。相對(duì)分子質(zhì)量小于3 000 u 的肽段具有較強(qiáng)抗氧化作用[17]，而小于1 000 u 的抗氧化多肽往往活性最強(qiáng)[18]，胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物鑒定多肽相對(duì)分子質(zhì)量小于1 000 u分別有257種、106種和10種，而這些肽段絕大部分(255種、95種、10種)長(zhǎng)度小于或等于10個(gè)多肽，因此，使用BIO-PEP數(shù)據(jù)庫(kù)可對(duì)十肽及以下多肽進(jìn)行抗氧化活性預(yù)測(cè)。

(a)(d)胰蛋白酶;(b)(e)胃蛋白酶;(c)(f)木瓜蛋白酶(a)(d) Trypsin; (b)(e) Pepsin; (c) (f)Papain圖4 胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物鑒定肽段的相對(duì)分子質(zhì)量((a)～(c))和肽段長(zhǎng)度((d)～(f))Fig.4 Mass of peptide and length of peptide of identified peptides in trypsin, pepsin and papain hydrolysates

胰蛋白酶酶解產(chǎn)物共有16種七肽，57種八肽，82種九肽和101種十肽具有潛在抗氧化活性，共256種，占十肽及以下肽段(654種)的39.14%(圖5)。其共同特征為：具有谷氨酸-亮氨酸(Glutamic-Leucine，EL)、亮氨酸-酪氨酸(Leucine-Tyrosine，LY)、甲硫氨酸-甲硫氨酸(Methionine-Methionine，MM)、亮氨酸-賴(lài)氨酸(Leucine-Lysine，LK)、異亮氨酸-精氨酸(Isoleucine-Arginine，IR)、甲硫氨酸-酪氨酸(Methionine-Tyrosine，MY)或纈氨酸-酪氨酸(Valine-Tyrosine，VY)殘基等結(jié)構(gòu)。胃蛋白酶酶解產(chǎn)物共有8種八肽，15種九肽和58種十肽具有潛在抗氧化活性，共81種，占十肽及以下肽段(247種)的32.80%(圖5)。其共同特征為：具有組氨酸-亮氨酸(Histidine-Leucine，HL)、LK、蘇氨酸-酪氨酸(Threonine-Tyrosine，TY)、組氨酸-組氨酸(Histidine- Histidine，HH)或EL殘基等結(jié)構(gòu)。木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物共有6種八肽，4種九肽和6種十肽具有潛在抗氧化活性，共16種，占十肽及以下肽段(30種)的53.33%(圖5)。其共同特征為：具有LK、IR或EL等結(jié)構(gòu)。

“十肽”表示肽段長(zhǎng)度為10個(gè)氨基酸且具有抗氧化活性的多肽，縱坐標(biāo)表示“十肽”及以下肽段比例，以此類(lèi)推?！癉ecapeptide” refers to a peptide with length of 10 amino acids and antioxidant activity. Y axis indicates the proportion of “ten decapeptide” and below, and so on.圖5 胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物十肽及以下肽段抗氧化活性預(yù)測(cè)Fig.5 Antioxidant activity prediction of decapeptides and below in trypsin, pepsin and papain hydrolysates

3 討 論

3.1 胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物中蛋白和肽段差異分析

獲得多肽水平上的信息在蛋白組學(xué)中需追溯到原始蛋白質(zhì)，單一蛋白質(zhì)時(shí)比較容易，但在蛋白組成復(fù)雜時(shí)會(huì)變得困難。有研究指出，因分析中肽段太短或太長(zhǎng)而丟失，不同蛋白質(zhì)共有肽段的出現(xiàn)阻礙了蛋白質(zhì)推斷，導(dǎo)致一組蛋白質(zhì)的鑒定，而不是單一蛋白質(zhì)的鑒定[23]，因而會(huì)阻礙蛋白的鑒定和定量。而工作酶(即消化蛋白所用水解酶)不同是造成肽段信息不同的主要原因之一，也是影響蛋白組學(xué)結(jié)果重要因素。胰蛋白酶是目前蛋白組學(xué)研究中最常用工作酶之一，具有高度特異性，酶解位點(diǎn)為堿性氨基酸精氨酸和賴(lài)氨酸-COOH端[24]，但缺乏精氨酸和賴(lài)氨酸殘基的蛋白不能被胰蛋白酶水解，此外其最適pH接近中性，部分蛋白在此pH下溶解度小，也不能被水解。因此，胰蛋白酶存在一定局限性。胃蛋白酶特異性水解位點(diǎn)可以是芳香族氨基酸，也可是其他疏水性氨基酸NH2端和COOH端[25]，特異性不高，但其在酸性環(huán)境中活性最強(qiáng)，而部分蛋白在酸性環(huán)境的溶解度較大，利于胃蛋白酶消化。木瓜蛋白酶具有廣泛特異性，廣泛應(yīng)用于活性多肽制備[26]，酶解位點(diǎn)為賴(lài)氨酸、精氨酸和甘氨酸NH2端和COOH端。上述3種蛋白酶不同特點(diǎn)造成酶解產(chǎn)物間差異。Zhang等[27]使用胰蛋白酶酶解對(duì)蝦獲得575種蛋白和2 677個(gè)肽段；Wen等[28]對(duì)比單獨(dú)使用胃蛋白酶或胃蛋白酶后分析發(fā)現(xiàn)，使用胰蛋白酶對(duì)豬肉、牛肉、雞肉和魚(yú)肉勻漿酶解產(chǎn)物差異，發(fā)現(xiàn)經(jīng)胃蛋白酶酶解后從豬肉、牛肉、雞肉和魚(yú)肉分別鑒定出101、140、175和32種多肽，經(jīng)胃蛋白酶和胰蛋白酶酶解后分別鑒定出72、59、92和28種多肽，表明經(jīng)胰蛋白酶進(jìn)一步消化后各物種酶解產(chǎn)物蛋白數(shù)量差異不顯著，胃蛋白酶對(duì)肉類(lèi)的酶解能力較強(qiáng)。Ha等[29]使用木瓜蛋白酶從脫脂奶粉中提取分離出308個(gè)多肽，其中56個(gè)具有潛在抗氧化活性，結(jié)果表明木瓜蛋白酶可應(yīng)用于抗氧化活性多肽研究。Jung等[30]認(rèn)為胰蛋白酶和胃蛋白酶對(duì)豬胎盤(pán)具有良好水解效率，而牛胎盤(pán)酶解產(chǎn)物研究相關(guān)信息較少。

本研究使用胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶研究奶牛胎盤(pán)酶解產(chǎn)物差異，獲取相關(guān)信息，鑒定蛋白中獨(dú)特多肽數(shù)量胰蛋白酶最多，胃蛋白酶次之，木瓜蛋白酶最少，結(jié)果表明胰蛋白酶是鑒定蛋白最可靠的蛋白酶。且胰蛋白酶酶解產(chǎn)物鑒定肽段中81.52% 相對(duì)分子量在1 000～3 000 u，83.84%長(zhǎng)度在20個(gè)氨基酸以內(nèi)，大部分肽段能與蛋白準(zhǔn)確對(duì)應(yīng)，胃蛋白酶和木瓜蛋白酶鑒定肽段均在3 000 u以內(nèi)，分別有97.35%和80.47%長(zhǎng)度在20個(gè)氨基酸內(nèi)，均符合蛋白組學(xué)鑒定要求。蛋白質(zhì)檢測(cè)的可靠性隨蛋白質(zhì)組中獨(dú)特多肽數(shù)量增加而提高[31]，然而，鑒定蛋白覆蓋率越廣則檢測(cè)準(zhǔn)確率越高[31]，本研究中胰蛋白酶和木瓜蛋白酶鑒定蛋白覆蓋率要明顯優(yōu)于木瓜蛋白酶，且木瓜蛋白酶鑒定蛋白質(zhì)量分布較差，在140～200 ku間存在缺失，說(shuō)明木瓜蛋白酶用于蛋白質(zhì)組學(xué)準(zhǔn)確率較差?？赡茉蚴悄竟系鞍酌柑禺愋缘?，酶切位點(diǎn)廣泛，酶解胎盤(pán)所獲肽段長(zhǎng)度小于5個(gè)氨基酸，而5個(gè)氨基酸以下組成的多肽分子量高和電荷高，LC-MS/MS質(zhì)譜技術(shù)檢出率極低[32]，但肽段長(zhǎng)度較短的多肽往往活性較高，因此木瓜蛋白酶可用于研究小分子活性多肽。

3.2 胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物抗氧化活性差異分析

肽的抗氧化活性與序列中氨基酸組成、排列順序、分子量大小、肽鍵及肽的空間結(jié)構(gòu)有關(guān)[33]。通常認(rèn)為具有供氫或供電子能力的氨基酸殘基(如Tyr、Trp、Cys、Met和His等)具有清除自由基的能力[27,34]，疏水性氨基酸殘基可增強(qiáng)肽抑制脂質(zhì)過(guò)氧化能力[35]，而酸性和堿性氨基酸殘基具有螯合金屬離子的能力[36]。此外，Gly和Pro等氨基酸也對(duì)肽的抗氧化活性具有一定作用。而天然抗氧化活性多肽生物學(xué)作用較多且來(lái)源廣泛，但從奶牛胎盤(pán)中提取抗氧化活性多肽鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)BIO-PEP數(shù)據(jù)庫(kù)匹配和測(cè)算，分析了不同蛋白酶酶解奶牛胎盤(pán)產(chǎn)物的抗氧化活性：胰蛋白酶組中GVVGPQGAR強(qiáng)度最高，由牛和小鼠膠原蛋白α-2(I)鏈的P02465蛋白水解產(chǎn)生，與豬膠原蛋白酶解物具有較高相似性，其QGAR殘基使其產(chǎn)生抗氧化活性[18]；NDEELNK強(qiáng)度次高，由構(gòu)成組蛋白H2A的F2Z4 J1蛋白水解產(chǎn)生，其中EL殘基為其抗氧化活性來(lái)源[19]；強(qiáng)度第三位的GPSGPQGIR同樣來(lái)源于P02465蛋白，其IR使其可能具有抗氧化活性[20]。胃蛋白酶酶解產(chǎn)物中YYAPFDGILG強(qiáng)度最高，來(lái)源于組成牛胃蛋白酶A的A0A3Q1LZC9蛋白，其YYA殘基為抗氧化活性來(lái)源[21]；EKIWHHSF強(qiáng)度次高，來(lái)源于組成肌動(dòng)蛋白的G8 JKX4蛋白，其WHH殘基為抗氧化活性來(lái)源；強(qiáng)度第三位的PARHQTHGSL由組成硫酸乙酰肝素蛋白聚糖2的F1MER7蛋白水解產(chǎn)生，其RHQ殘基使其具有抗氧化活性[19]。木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物中REEYLLLK強(qiáng)度最高，由包含GTPase活化蛋白2的IQ模體(IQGAP2)的F1MTR1蛋白水解產(chǎn)生，其活性來(lái)源為YLL殘基[22]和LK殘基[20]；KGNYLILK次高，來(lái)源于血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子的A0A3Q1MHJ9蛋白，其活性來(lái)源為L(zhǎng)K殘基[19]；RNDEELNK強(qiáng)度第三，為組成組蛋白H2AFJ的Q3ZBX9蛋白水解產(chǎn)物，其活性來(lái)源為EL殘基。

胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解奶牛胎盤(pán)組織有潛在抗氧化活性多肽共同特征分別是含有EL、LY、MM、LK、IR、MY、VY等殘基，HL、LK、TY、HH、EL等殘基和LK、IR、EL等殘基，上述殘基中含有Y、M、H和K等具有自由基清除能力的氨基酸，L、I和V等疏水性氨基酸，酸性氨基酸E和堿性氨基酸K、R、H。上述氨基酸殘基與資料研究報(bào)道一致[34-36]，可能是奶牛胎盤(pán)酶解產(chǎn)物抗氧化活性的來(lái)源。另外，本研究表明，胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物十肽及以下具有潛在抗氧化能力的肽段分別占十肽及以下肽段總量39.14%、32.80%和53.33%，木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物的潛在抗氧化能力最強(qiáng)，結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明了木瓜蛋白酶具有廣泛特異性[26]，更適用于奶牛胎盤(pán)活性多肽制備。

4 結(jié) 論

通過(guò)利用LC-MS/M技術(shù)對(duì)酶解產(chǎn)物定性和定量分析，胰蛋白酶在蛋白質(zhì)組學(xué)中可靠性和準(zhǔn)確率均高于胃蛋白酶，而木瓜蛋白酶最差；木瓜蛋白酶對(duì)奶牛胎盤(pán)酶解更徹底，其酶解產(chǎn)物十肽以下具有潛在抗氧化能力肽段占比最高，潛在抗氧化活性最強(qiáng)；奶牛胎盤(pán)酶解產(chǎn)物抗氧化活性多來(lái)源于EL、LY、MM、LK、IR、MY、VY、HL、TY、HH等氨基酸殘基。研究結(jié)果為奶牛胎盤(pán)蛋白組學(xué)選擇蛋白酶和提取奶牛胎盤(pán)抗氧化活性多肽提供理論基礎(chǔ)，促進(jìn)奶牛胎盤(pán)開(kāi)發(fā)利用。