趙軍

摘? ? 要：本試驗以MS為基本培養(yǎng)基，采用1.5 mg/L、1.7 mg/L、2.1 mg/L、2.4 mg/L 4種不同濃度的細胞分裂素6-BA對銀杏莖段進行叢生芽的誘導。結(jié)果表明，當IBA固定為0.2 mg/L時，6-BA取1.7 mg/L誘導率最高，達93.3%。同時發(fā)現(xiàn)4月中旬取材的污染率最低，為最佳取材時間。

關鍵詞：銀杏;莖段;6-BA ;叢生芽

文章編號：1005-2690（2021）20-0013-02? ? ? ?中國圖書分類號：S792.95? ? ? ?文獻標志碼：B

銀杏是最古老的孑遺植物，裸子植物屬銀杏科現(xiàn)存唯一的種類，被我國列為二級保護植物。銀杏生長在水熱條件比較優(yōu)越的亞熱帶季風區(qū)，適合于pH值為5～6的黃壤或黃棕壤，在第四紀冰川后，僅留于中國，后傳入日本、韓國、加拿大等國家，目前主要分布在中國的溫帶和亞熱帶氣候區(qū)，遍及我國22個?。ㄗ灾螀^(qū)），其中主要在四川、貴州等省份，較為珍稀[1]。

銀杏樹俊俏雄奇，葉呈扇型似鵝掌，奇特古雅，對煙塵、二氧化硫有特別的抵抗力，抗污能力強，適應性強，可做農(nóng)田防護林、護路林;銀杏葉可入藥，從銀杏葉中能夠提取150多種化合物，如銀杏黃酮、雙黃酮和銀杏內(nèi)酯對心腦血管疾病具有獨特功效[2-4]。

隨著銀杏利用價值的進一步開發(fā)，銀杏種植已經(jīng)成為一項經(jīng)濟生態(tài)效益雙高的產(chǎn)業(yè)，一些優(yōu)良品種已大面積推廣。但銀杏是雌雄異株植物，以傳統(tǒng)種子、扦插、嫁接進行繁殖效率較低，生產(chǎn)周期長，不能滿足市場需求。利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)進行銀杏快繁，可以提高成活率，并保持品種原有的優(yōu)良性狀[5]。

目前對銀杏的組織培養(yǎng)已有一定的研究，自20世紀30年代以來國內(nèi)外學者先后開展了銀杏胚胎培養(yǎng)、細胞培養(yǎng)、器官培養(yǎng)等研究。銀杏組織快繁培養(yǎng)多以莖段為外植體誘導出叢生芽，如陳穎、曹福亮發(fā)現(xiàn)莖段可誘導出叢生芽，張祖榮用莖段培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)6-BA為2.0 mg/L時叢生芽誘導率達81%。多數(shù)莖段培養(yǎng)生長素范圍為0.2～0.5 mg/L，而細胞分裂素取值范圍比較大。本試驗分別取1.5 mg/L、1.7 mg/、2.1 mg/L、2.4 mg/L 4個水平的6-BA濃度，探討當IBA=0.2 mg/L時不同的6-BA濃度對銀杏莖段叢生芽誘導的影響，同時探討不同的取材時間對銀杏組織培養(yǎng)污染的影響，以期滿足市場的各種需求。

1? ?試驗材料與方法

材料取自于四川宜賓職業(yè)技術(shù)學院內(nèi)無病蟲害幼嫩健壯的銀杏枝條。

1.1? ?不同6-BA濃度設計

將銀杏幼嫩莖段在清水中洗凈，于自來水下沖洗30 min，瀝干水分，在超凈工作臺上用75%的酒精消毒，再用0.1%升汞消毒，無菌水沖洗后將莖段切割成1.0～1.5 cm帶腋芽的小段，接種在以MS+IBA0.2 mg/L為基本培養(yǎng)基，添加有4種不同濃度6-BA的誘導培養(yǎng)基上，pH值調(diào)至5.8。共計4個處理480瓶，設計見表1。

1.2? ?取材時間對污染影響設計

銀杏一般在3月下旬至4月上旬萌動展葉，4—5月為進行組織培養(yǎng)較適宜取材時間。為探究取材時間對污染的影響，在4月1日、4月15日、5月1日、5月15日取銀杏莖段進行相同的消毒處理，接種于MS培養(yǎng)基上，共計4個處理480瓶，設計見表2。

以上均置于（25±2） ℃，每天以1 000～2 000 lx光照12 h后進行培養(yǎng)。接種后觀察生長狀況、叢生芽誘導情況、高度、污染、褐變情況。

誘導率=未污染叢生芽個數(shù)/未污染接種外植體個數(shù)×100%? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? （1）

污染率=污染瓶數(shù)/接種瓶數(shù)×100%? ? ? ? ? ? ? ?（2）

褐變率=未污染褐變瓶數(shù)/未污染接種外植體數(shù)×100%? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? （3）

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?不同6-BA濃度對叢生芽的誘導

接種7 d后外植體開始有生長跡象，出現(xiàn)嫩綠色的生長點，15 d左右莖段開始伸長，由黃綠變?yōu)榇渚G，腋芽開始萌動變綠，周圍幼嫩苞片慢慢散開呈星狀，中心生長點凸起。試驗20 d后1號處理開始出現(xiàn)翠綠呈五星狀的不定芽，其周圍的葉片開始向四周生展。35 d后統(tǒng)計結(jié)果見表3。

試驗發(fā)現(xiàn)，在IBA用量恒定時，不同濃度的6-BA對銀杏叢生芽的誘導有較大影響，隨著6-BA濃度升高，叢生芽誘導開始增加。當6-BA為1.7 mg/L時，叢生芽誘導率達93.3%，但6-BA濃度再增大誘導率會出現(xiàn)下降，6-BA2.4 mg/L時叢生芽誘導率最低為23.3%。

6-BA濃度變化對叢生芽長勢有一定影響，隨著6-BA濃度增大，叢生芽從翠綠變嫩綠，當6-BA為2.4 mg/L時叢生芽有玻璃化趨勢。統(tǒng)計分析說明，當IBA=0.2 mg/L時，試驗范圍內(nèi)6-BA濃度1.7 mg/L叢生芽生長最好，極顯著優(yōu)于處理1、3、4。試驗中6-BA濃度變化對銀杏再生體系的褐變和高度沒有影響。

2.2? ?不同取材時間的污染影響

試驗的污染多在接種培養(yǎng)2～5 d后開始出現(xiàn)，表現(xiàn)為培養(yǎng)基表面出現(xiàn)黏狀細菌菌斑和黑色、灰色毛狀真菌菌斑，培養(yǎng)15 d后的污染情況結(jié)果見表4。

結(jié)果顯示，4月15日取材時污染率最小為5.00%，5月15日污染率最大為44.16%。統(tǒng)計分析表明，4月15日取材極顯著優(yōu)于其余各取材時間。

3? ?討論

3.1? ?6-BA對叢生芽的誘導

叢生芽是由植物器官和愈傷組織發(fā)育出來的群體叢生芽苗，試驗以銀杏莖段離體培養(yǎng)誘導叢生芽，其中使用了生長素IBA（吲哚丁酸）和細胞分裂素 6-BA（6-芐基腺嘌呤）兩種激素。在植物組織培養(yǎng)中生長素和細胞分裂素是重要的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，具有誘導分化作用，完整植株的形態(tài)建成就是它們共同作用調(diào)控的，兩種激素配合使用時其比值能調(diào)節(jié)分化方向。

在本次試驗中生長素IBA不變?yōu)?.2 mg/L時，6-BA為1.7 mg/L時叢生芽誘導率達93.31%，叢生芽翠綠健壯，說明當生長素保持恒定不變時，增加細胞分裂素的濃度有利于芽的分化，但過高試管苗有玻璃化趨勢。

3.2? ?不同取材時間對污染情況的影響

污染是指在植物組織培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基或培養(yǎng)材料上滋生細菌、真菌等微生物，出現(xiàn)培養(yǎng)材料不能正常生長發(fā)育的現(xiàn)象。造成污染的原因主要是培養(yǎng)基和器具滅菌不徹底、接種操作不規(guī)范等，同時外植體帶菌是造成污染的重要原因，外植體是否染菌、染菌多少與取材時間有很大關系。試驗結(jié)果表明，在規(guī)范操作的情況下，銀杏離體培養(yǎng)污染率與取材時間有很大關系，在銀杏可以取材的時間范圍內(nèi)，以4月15日為最優(yōu)，隨著取材時間向后推移污染率逐漸增大。

3.3? ?褐變問題

褐變是由于植物體內(nèi)的酚類化合物被多酚類氧化酶催化，使酚類化合物被氧化成褐色的醌類化合物而形成的。有資料顯示，銀杏細胞離體培養(yǎng)褐變嚴重，本次銀杏莖段離體培養(yǎng)試驗無褐變現(xiàn)象，這可能與銀杏取材時間較早取材部位較嫩、酚類次生代謝物累積較少有關。

4? ?結(jié)論

以帶腋芽的銀杏幼嫩莖段為外植體，在MS+IBA

0.2 mg/L的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，梯度添加1.5～2.4 mg/L的6-BA，在試驗范圍內(nèi)以6-BA1.7 mg/L叢生芽誘導率最高，達93.3%，為最適濃度。

參考文獻：

[1]曹福亮.中國銀杏志[M].北京：中國林業(yè)出版社，2007.

[2]陳穎，曹福亮.銀杏組培快繁和體胚發(fā)生技術(shù)研究進展[J].林業(yè)科技開發(fā)，2006（6）：201-204.

[3]張祖榮.銀杏組培繁殖及黃酮糖苷的產(chǎn)生[J].四川林業(yè)科技，2003（2）：213-215.

[4]郭長祿，陳力耕，胡西琴，等.銀杏組織培養(yǎng)及其利用研究進展[J].果樹學報，2003（5）：399-403.

[5]邵莉.植物生長調(diào)節(jié)劑利用手冊[M].北京：金盾出版社，2004.