趙 丹，安 杰，劉 倩，李 力，朱清華

子癇前期又稱為先兆子癇，指妊娠期出現(xiàn)血壓升高和尿蛋白增加，如果在輕度子癇前期病情控制不理想，就會發(fā)展成為重度子癇前期，出現(xiàn)肝臟損傷、心力衰竭、胎兒發(fā)育受限、腎功能異常等[1-3]。子癇前期的發(fā)生可能與母體、胎盤、胎兒等多種因素具有相關性[4]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類長度>200 nt的非編碼RNA，在表觀遺傳學、轉錄調(diào)控及轉錄后調(diào)控方面發(fā)揮重要作用[5]。有研究表明，lncRNA可能參與子癇前期的發(fā)生和發(fā)展[6]。本研究探討lncRNA RPAIN在子癇前期患者胎盤組織中的表達及對滋養(yǎng)細胞增殖和侵襲的影響及相關機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑：胎盤滋養(yǎng)細胞株HTR-8/SVneo購自中科院上海細胞庫；胎牛血清、PRIM1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；MTT試劑購自北京索萊寶生物科技有限公司；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自賽默飛世爾科技有限公司；PCR引物購自上海生工生物工程有限公司；Transwell小室購自美國Corning公司；Matrigel膠購自美國BD公司；BCA蛋白測定試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司；Wnt/β-catenin信號通路特異性抑制劑ICG001購自美國Selleck公司；基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、Wnt5a、β-catenin、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和β-actin單克隆抗體及辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗均購自北京中杉金橋生物科技有限公司；si-NC、si-RPAIN購自廣州市銳博生物科技有限公司。

1.1.2組織標本：選取2018年8月—2019年12月在我院剖宮產(chǎn)分娩的30例子癇前期作為試驗組，排除多胎及生殖器官畸形，妊娠期糖尿病、原發(fā)高血壓病、慢性腎炎等。同期選取30例剖宮產(chǎn)分娩的正常妊娠孕婦作為對照組。試驗組和對照組孕婦均為單胎且剖宮產(chǎn)分娩。取胎盤母體面距臍帶附著處2～3 cm的胎盤組織標本，避開機化灶、鈣化灶、出血灶。兩組年齡、孕周、孕次等一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準執(zhí)行，患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2細胞培養(yǎng)和分組 HTR-8/SVneo細胞使用含10%胎牛血清的PRIM1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細胞增殖狀態(tài)，若細胞增殖良好，融合度達80%～90%時進行傳代。將HTR-8/SVneo細胞分為NC組、si-NC組和si-RPAIN組。NC組為空白對照，si-NC組和si-RPAIN組為分別轉染si-NC和si-RPAIN的HTR-8/SVneo細胞，轉染過程嚴格按照Lipofectamine2000說明書操作，培養(yǎng)48 h后收集細胞檢測轉染效果，合格后進行后續(xù)實驗；在轉染si-RPAIN的HTR-8/SVneo細胞中加入ICG001處理，作為ICG001處理組。

1.3RT-qPCR檢測RPAIN表達水平 試驗組和對照組的胎盤組織使用0.9%氯化鈉注射液沖洗干凈，置于液氮中凍存。將凍存的胎盤組織取出，使用Trizol試劑提取細胞總RNA，逆轉錄試劑盒逆轉錄為cDNA，PrimeScript RT Master Mix試劑盒進行Realtime PCR擴增反應，SYBR? Premix Ex TaqTM試劑盒進行PCR。反應條件為95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)；60 ℃延長5 min。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算RPAIN相對表達量。RPAIN上游引物：5'-CGCTCCCTGTACAAACTGGT-3'，下游引物：5'-GCCATAGTTTCATGGCAGGC-3'；β-actin上游引物：5'-GACTCATGACCACAGTCCATGC-3'，下游引物：5'-AGAGGCAGGGATGATGTTCTG-3'。

1.4MTT法檢測細胞增殖能力 各組細胞培養(yǎng)48 h，以2.5×105/ml接種于96孔板，每孔100 μl，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后每孔加入MTT試劑20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清液，每孔加入DMSO 150 μl，室溫孵育5 min，用酶標儀檢測實驗孔在450 nm的光密度(OD)值。

1.5流式細胞術檢測細胞凋亡率 各組細胞培養(yǎng)48 h后用預冷的PBS漂洗2次，與500 μl的結合緩沖液混勻。先加入10 μl的Annexin V-FITC，再加入5 μl的PI，混勻后避光孵育10 min。用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.6Transwell實驗檢測細胞侵襲能力 各組細胞培養(yǎng)48 h，用稀釋的基質(zhì)膠包被Transwell上室膜進行侵襲實驗。每組取1×104個HTR-8/SVneo細胞接種于Transwell上室，加入200 μl無血清培養(yǎng)基。下室加入500 μl含10%胎牛血清的細胞培養(yǎng)基作為誘導劑。培養(yǎng)箱孵育24 h，棉簽除去基質(zhì)膠和未過膜細胞。用4%多聚甲醛溶液固定侵襲過膜的細胞，結晶紫染色15 min。顯微鏡觀察細胞，隨機選取5個視野計數(shù)，計算平均數(shù)表示細胞侵襲數(shù)。

1.7Western blot檢測蛋白表達 各組細胞培養(yǎng)48 h，裂解細胞提取總蛋白，BCA蛋白測定試劑盒檢測蛋白質(zhì)濃度。采用SDS-PAGE凝膠電泳分離等量的蛋白，并利用濕法轉膜儀轉移至PVDF膜，封閉液封閉，加入MMP-9、Wnt5a、β-catenin和VEGF一抗(稀釋比例均為1∶1000)，4 ℃孵育過夜。然后加入二抗(稀釋比例均為1∶5000)，孵育2 h，顯影，定影，應用Quantity One軟件測定各組蛋白條帶的灰度值，以目的條帶和β-actin條帶的比值作為蛋白表達水平。

2 結果

2.1胎盤組織RPAIN表達水平比較 對照組胎盤組織RPAIN表達水平為1.00±0.10，試驗組為3.82±0.34。與對照組比較，試驗組胎盤組織RPAIN表達水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2.2沉默RPAIN對HTR-8/SVneo細胞增殖的影響 si-NC組RPAIN表達水平、OD值與NC組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與si-NC組比較，si-RPAIN組RPAIN表達水平明顯降低，OD值明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 3組HTR-8/SVneo細胞RPAIN表達水平和OD值的比較

2.3沉默RPAIN對HTR-8/SVneo細胞凋亡的影響 NC組、si-NC組和si-RPAIN組細胞凋亡率分別為(16.88±2.39)%、(17.26±2.52)%和(8.12±1.08)%。si-NC組細胞凋亡率與NC組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與si-NC組比較，si-RPAIN組細胞凋亡率明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖1。

2.4沉默RPAIN對HTR-8/SVneo細胞侵襲的影響 si-NC組細胞侵襲數(shù)、MMP-9蛋白表達水平與NC組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與si-NC組比較，si-RPAIN組細胞侵襲數(shù)明顯增加，MMP-9蛋白表達水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖2，表2。

表2 3組HTR-8/SVneo細胞侵襲數(shù)和MMP-9蛋白表達比較

2.5沉默RPAIN對HTR-8/SVneo細胞Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白表達的影響 si-NC組細胞Wnt5a、β-catenin、VEGF蛋白表達水平與NC組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與si-NC組比較，si-RPAIN組Wnt5a、β-catenin、VEGF蛋白表達水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表3，圖3。

表3 3組HTR-8/SVneo細胞Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白表達比較

2.6ICG001逆轉沉默RPAIN對HTR-8/SVneo細胞增殖和侵襲的影響 與si-RPAIN組比較，ICG001處理組OD值、MMP-9、Wnt5a、β-catenin、VEGF蛋白表達水平明顯降低，細胞凋亡率明顯升高，細胞侵襲數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表4。

表4 si-RPAIN組和ICG001處理組HTR-8/SVneo細胞增殖和侵襲指標比較

3 討論

子癇前期是妊娠期常見的疾病，是導致孕婦和胎兒死亡的重要原因之一[7]。子癇前期的發(fā)病機制可能與胎盤發(fā)育受損有關，進而引起內(nèi)皮功能障礙、全身炎癥反應、氧化應激等一系列病理過程[8-9]。有證據(jù)揭示，lncRNA RPAIN在子癇前期胎盤組織中呈高表達，在疾病的發(fā)展過程中發(fā)揮關鍵調(diào)控作用[10]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，試驗組胎盤組織RPAIN表達水平明顯升高，與上述研究結果一致。

研究表明，lncRNA通過影響滋養(yǎng)細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲，參與子癇前期的發(fā)生與進展[11]。陳小斌和喬寵[12]研究表明，lncRNA TINCR在胎盤組織和滋養(yǎng)細胞中表達水平明顯升高，還能抑制HTR-8/SVneo細胞的增殖、遷移和浸潤。陳芳榮等[13]研究表明，lncRNA KCNQ1OT1能負調(diào)控miR-146a-3p的表達，促進滋養(yǎng)細胞的增殖、遷移和侵襲。陳國慶[14]研究表明，重度子癇前期患者胎盤組織中l(wèi)ncRNA DANCR表達量減少，并影響滋養(yǎng)細胞的生物學行為。彭迎春等[15]研究表明，lncRNA-SNHG5通過調(diào)控miR-155表達，影響滋養(yǎng)細胞增殖能力。以上研究均表明子癇前期的發(fā)生、進展與lncRNA密切相關。本研究通過轉染si-RPAIN沉默HTR-8/SVneo細胞中RPAIN的表達，結果發(fā)現(xiàn)，沉默RPAIN后HTR-8/SVneo細胞OD值和MMP-9蛋白表達明顯升高，細胞侵襲數(shù)明顯增加，細胞凋亡率明顯降低。表明沉默RPAIN能夠促進HTR-8/SVneo細胞的增殖和侵襲能力，并抑制細胞凋亡。

β-catenin信號通路參與人體的多種正常生理過程。高度保守的Wnt信號通路能夠調(diào)控人體的生長發(fā)育、疾病、衰老、死亡等生命過程[16]。馬云鵬[17]研究發(fā)現(xiàn)，sFRP5能夠抑制滋養(yǎng)細胞、內(nèi)皮細胞的侵襲和遷移能力，其抑制作用通過Wnt/β-catenin信號通路介導，并進一步參與子癇前期的發(fā)生與發(fā)展。研究證實，Wnt/β-catenin信號通路能對重度子癇前期患者胎盤滋養(yǎng)層細胞的侵襲和增殖產(chǎn)生影響[18-19]。還有研究顯示，SATB1通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路使滋養(yǎng)細胞的侵襲力減弱，最終導致子癇前期的發(fā)生[20]。有學者發(fā)現(xiàn)，miR-152通過Wnt1/β-catenin信號通路參與子癇前期發(fā)病過程[21]。本研究結果顯示，與si-NC組比較，si-RPAIN組Wnt5a、β-catenin、VEGF蛋白表達水平明顯升高。為進一步探究沉默RPAIN是否通過Wnt/β-catenin信號通路影響HTR-8/SVneo細胞的增殖和侵襲，本實驗在沉默RPAIN的HTR-8/SVneo細胞中添加Wnt/β-catenin信號通路特異性抑制劑ICG001，結果發(fā)現(xiàn)，ICG001能夠有效逆轉沉默RPAIN對HTR-8/SVneo細胞增殖和侵襲的促進作用。以上研究數(shù)據(jù)表明，沉默RPAIN能夠通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進HTR-8/SVneo細胞的增殖和侵襲。

綜上所述，RPAIN在子癇前期患者胎盤組織中的表達升高，沉默RPAIN能夠通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進滋養(yǎng)細胞增殖和侵襲，進而參與子癇前期的發(fā)病。