范衛(wèi)鋒，王秋燕，李皓翔，鄒園生，梅全喜，錢正明*

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510011；2.宜昌山城水都冬蟲夏草有限公司，湖北 宜昌443300；3.深圳市寶安純中醫(yī)治療醫(yī)院，廣東 深圳 518102)

冬蟲夏草是我國傳統(tǒng)名貴中藥，已有一千多年的藥用歷史，為麥角菌科真菌冬蟲夏草菌Cordycepssinensis(BerK.) Sacc.寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座和幼蟲尸體的干燥復(fù)合體，具有補(bǔ)腎益肺、止血化痰的功效，臨床上用于腎虛精虧、陽痿遺精、腰膝酸痛、久咳虛喘、勞嗽咯血等[1]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“腎精”是生命的本原性物質(zhì)，貫穿人體生長(zhǎng)、發(fā)育、壯實(shí)、生殖、衰老、死亡各個(gè)階段，能養(yǎng)骨、充髓、健腦、化血、生氣，生成生殖之精和御邪抗病的正氣[2]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)腎精與免疫、遺傳、神經(jīng)、內(nèi)分泌、生殖、造血等有關(guān)[3，4]，腎精虧虛易導(dǎo)致免疫功能下降、兒童發(fā)育不良、骨質(zhì)酥松、不孕不育、老年病等[5]。冬蟲夏草具有補(bǔ)腎益精的功效，臨床上運(yùn)用冬蟲夏草治療少精不育癥，提高精子質(zhì)量，減緩慢性腎功能衰竭進(jìn)程[6，7]，但其補(bǔ)腎的物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機(jī)制尚不清楚。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析冬蟲夏草治療腎精虧虛證的成分和作用機(jī)制，以期進(jìn)一步為臨床上應(yīng)用提供生物學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 冬蟲夏草主要活性化合物的篩選

本研究依托TCMSP、CNKI、PuBmed檢索冬蟲夏草的主要活性化合物，以口服吸收利用度(OB)≥30%，藥物類藥性(DL)≥0.18為指標(biāo)篩選，篩選后得到冬蟲夏草的有效成分。

1.2 冬蟲夏草預(yù)防腎精虧虛靶點(diǎn)的收集和預(yù)測(cè)

利用TCMSP、Drugbank、Stitch、Swiss target prediction查詢冬蟲夏草的靶點(diǎn)信息；檢索GeneCard、OMIM數(shù)據(jù)庫，以“kidney essence deficiency”為關(guān)鍵詞，選擇物種為Homo sapiens，檢索與腎精虧虛相關(guān)的基因；通過R軟件包對(duì)冬蟲夏草活性成分作用的靶點(diǎn)和腎精虧虛靶點(diǎn)取交集并繪制韋恩圖，獲得共同靶點(diǎn)基因。

1.3 冬蟲夏草活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的建立

用Cytoscape 3.7.2軟件進(jìn)行可視化處理，建立冬蟲夏草活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 冬蟲夏草PPI 網(wǎng)絡(luò)圖和頻次分布圖的構(gòu)建

將篩選出的共同靶點(diǎn)基因?qū)隨tring數(shù)據(jù)庫，將蛋白種類定義為Homo sapiens進(jìn)行篩選，最低要求交互分?jǐn)?shù)設(shè)置為中等(0.4)，獲得蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖(PPI)，并使用R 3.6.2軟件包統(tǒng)計(jì)共同靶點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的相互作用的頻次，并繪制條形圖展示前19位關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.5 GO和KEGG通路富集分析

采用R 3.6.2的org.Hs.eg.db程序包將藥物與基因的交集靶點(diǎn)名轉(zhuǎn)換成基因名，并使用R 3.6.2的colorspace、stringi、ggplot2等程序包進(jìn)行可視化處理，對(duì)GO功能和KEGG通路富集分析，得到冬蟲夏草作用的生物學(xué)功能和潛在作用腎精虧虛通路信號(hào)，繪制氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1 冬蟲夏草活性成分的篩選

通過分析檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫與文獻(xiàn)[8-9]中冬蟲夏草成分，共收集到347個(gè)冬蟲夏草化合物，根據(jù)篩選條件OB≥30%和DL≥0.18進(jìn)行篩選，得到可供進(jìn)一步分析的有效成分22個(gè)。

2.2 冬蟲夏草抗腎精虧虛靶點(diǎn)

根據(jù)GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫檢索腎精虧虛的相關(guān)基因，共有438個(gè)靶點(diǎn)。檢索TCMSP、Drugbank、Stitch、Swiss target prediction等數(shù)據(jù)庫得到冬蟲夏草22個(gè)活性成分相關(guān)靶點(diǎn)103個(gè)，運(yùn)用韋恩圖R軟件包做冬蟲夏草活性成分調(diào)控的靶點(diǎn)基因與腎精虧虛的靶點(diǎn)基因交集，得到19個(gè)共同靶點(diǎn)，見圖1；冬蟲夏草有13個(gè)活性成分參與抗腎精虧虛，見表1。

圖1 冬蟲夏草與腎精虧虛靶點(diǎn)的韋恩圖

表1 冬蟲夏草活性成分和靶點(diǎn)相關(guān)信息

2.3 冬蟲夏草活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

采用Cytoscape 3.7.2軟件建立冬蟲夏草防治腎精虧虛證的化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)模型，構(gòu)建成完整的網(wǎng)絡(luò)圖，紅色“三角形”代表分子，綠色“四邊形”代表靶蛋白，“邊”代表冬蟲夏草活性成分與腎精虧虛靶點(diǎn)相互作用關(guān)系。通過網(wǎng)絡(luò)分析，冬蟲夏草有13個(gè)活性成分，與腎精虧虛證的19個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)、30條網(wǎng)絡(luò)關(guān)系參與治療腎精虧虛證，黃豆黃素、花生四烯酸、膽甾醇、11，14-二十碳二烯酸可能為冬蟲夏草抗腎精虧虛的核心成分，PTGS2、CNR1、PPARA、SLC6A2為治療腎精虧虛的重要靶點(diǎn)。從網(wǎng)絡(luò)圖中可以看出黃豆黃素可以調(diào)控SP1、NOS1、NOS2、NOS3、MMP3、PTGS2靶點(diǎn)，酒渣堿、川芎哚、黃豆黃素、花生四烯酸等8個(gè)活性成分同時(shí)調(diào)控PTGS2靶點(diǎn)，這表明冬蟲夏草多成分、多靶點(diǎn)共同作用腎精虧虛。

圖2 冬蟲夏草活性成分-共同靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系

2.4 冬蟲夏草PPI網(wǎng)絡(luò)和頻次分布圖

將上述19個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，構(gòu)建共同靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)。PPI網(wǎng)絡(luò)圖(圖3a)包含19個(gè)節(jié)點(diǎn)，48條邊，靶蛋白平均節(jié)點(diǎn)度值為5.05。蛋白與蛋白之間線條表示靶點(diǎn)之間相互作用關(guān)系，線條越多表示關(guān)聯(lián)度越大，處于較核心位置，如PTGS2、NOS3、CASP3和PPARA等。對(duì)全部靶點(diǎn)蛋白(19個(gè))進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并繪制條形圖(圖3b)。

注：a.PPI網(wǎng)絡(luò)圖；b.前19個(gè)靶點(diǎn)的頻次圖。圖3 冬蟲夏草與腎精虧虛共同靶點(diǎn)PPI圖和頻次分布

2.5 GO和KEGG通路富集分析

在GO功能分析結(jié)果中，在P<0.05基礎(chǔ)上對(duì)前20功能特征的生物過程(BP)、分子功能(MF)、細(xì)胞組分(CC)進(jìn)行分析。GO分析結(jié)果顯示，生物過程(BP)主要涉及小分子代謝調(diào)節(jié)、血壓調(diào)節(jié)、有機(jī)羥基化合物轉(zhuǎn)運(yùn)等；羧酸結(jié)合、有機(jī)酸結(jié)合、血紅素結(jié)合和四吡咯結(jié)合等分子功能(MF)；細(xì)胞組分(CC)涉及膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)和高密度脂蛋白顆粒等，詳見圖4。

注：a：生物過程；b：分子功能；c：細(xì)胞組分。圖4 冬蟲夏草治療腎精虧虛靶點(diǎn)的GO富集圖

KEGG分析共得到12條信號(hào)通路，主要涉及到鈣信號(hào)通路、精氨酸生物合成信號(hào)通路、膽固醇代謝信號(hào)通路、精氨酸和脯氨酸代謝通路等，將上述信號(hào)通路利用R 語言軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化處理得到氣泡圖(圖5)，其中氣泡的顏色越紅，富集越顯著；氣泡大小表示通路相關(guān)聯(lián)的基因數(shù)量，氣泡越大表明富集的基因越多。

圖5 冬蟲夏草抗腎精虧虛靶點(diǎn)的KEGG富集圖

3 結(jié)論

腎精虧虛證是指腎精虧損、髓?？仗撍碌陌l(fā)育遲緩、未老先衰、成人生殖機(jī)能減退、肢體痿弱不用、耳鳴、癡呆等臨床表現(xiàn)的總稱[10-12]。中醫(yī)采用補(bǔ)腎益精方治療腎精虧虛證取得了良好效果[5]，冬蟲夏草歸肺、腎經(jīng)，具有明顯的補(bǔ)腎益精作用。

本研究通過對(duì)冬蟲夏草有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系的挖掘，發(fā)現(xiàn)冬蟲夏草的黃豆黃素、花生四烯酸、膽甾醇、11，14-二十碳二烯酸為核心有效成分，可能在治療腎精虧虛證中起著重要作用。黃豆黃素有一定的促成骨細(xì)胞增殖活性，在低濃度時(shí)呈現(xiàn)正相關(guān)趨勢(shì)，隨著濃度的增加，細(xì)胞增殖明顯，但在1×10-5mol·L-1時(shí)抑制骨細(xì)胞增殖，使骨細(xì)胞皺縮、死亡[13]?；ㄉ南┧嵘险{(diào)C-Fos和Egr-1的表達(dá)，能誘發(fā)細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育，常常作為食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑添加在嬰幼食品中[14]。錢正明等[15]研究發(fā)現(xiàn)冬蟲夏草的蟲體、子座均有膽甾醇，其含量在蟲體中較高高，其均值為1.78 mg/g，子座中膽甾醇含量較低，其均值為0.61 mg/g。膽甾醇是動(dòng)物組織(特別在大腦和脊髓組織)的重要物質(zhì)，參與細(xì)胞膜構(gòu)成、激素合成的生理作用[16]。11，14-二十碳二烯酸降低LPS誘導(dǎo)小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞中NO產(chǎn)生，增加PEG2和TNF-α的產(chǎn)生，改變巨噬細(xì)胞對(duì)炎癥刺激的反應(yīng)[17]。鈣信號(hào)通路在細(xì)胞存活、增殖、代謝中有著重要作用，Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，激活各種Ca2+依賴性酶，形成Ca2+-CaM，通過活化、磷酸化，激活鈣信號(hào)通路，張玉琴等[18]研究栝樓桂枝顆粒通過對(duì)鈣信號(hào)通路中促進(jìn)CREB、CaMKII 的磷酸化，抑制CaM 的表達(dá)，對(duì)N-甲基-D-天冬氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)元興奮性毒性損傷具有保護(hù)作用。CUI等[19]在鵪鶉體內(nèi)絨毛尿囊膜實(shí)驗(yàn)和多種內(nèi)皮細(xì)胞體外模型試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)四氫巴馬汀通過調(diào)節(jié)精氨酸生物合成通路的促血管生成。WEN等[20]從膽固醇代謝通路的角度闡明尼古丁暴露雌性產(chǎn)前小鼠可導(dǎo)致調(diào)節(jié)性T細(xì)胞衰退，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的衰退誘導(dǎo)自身免疫性疾病。PATIN等[21]發(fā)現(xiàn)精氨酸和脯氨酸代謝通路在肌萎縮性側(cè)索硬化癥演化過程中起中心作用，與該通路相關(guān)的基因肌酸激酶、脯氨酸-4-羥化酶或亞精胺合成酶失調(diào)有關(guān)。文獻(xiàn)研究表明冬蟲夏草能補(bǔ)腎陽虛，可顯著逆轉(zhuǎn)氫化可的松所致小鼠腎陽虛的活性，升高T-SOD、GSH-Px、CAT、T-AOC 的水平，改善小鼠運(yùn)動(dòng)能力、性腺器官萎縮、減輕腎臟病理變化[22]。

本研究通過文獻(xiàn)研究共檢索到347個(gè)冬蟲夏草成分，其中包含核苷類、氨基酸類、肽類、鞘酯類等，這些化合物都具有較強(qiáng)的生物活性，蟲草核苷類提取物能抑制明顯改善糖尿病腎病小鼠的腎功能，抑制P38和ERK信號(hào)通路的活化[23]，氨基酸可以減緩順鉑治療肺癌患者腎毒性和作為急性腎衰竭患者進(jìn)行連續(xù)性腎臟替代治療時(shí)的補(bǔ)充劑[24，25]，蟲草多肽預(yù)防由四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病性骨質(zhì)疏松癥小鼠的骨質(zhì)減少，增強(qiáng)骨密度和骨礦含量[26]。但由于OB≥30%和DL≥0.18的篩選條件限制，核苷類、氨基酸類、肽類、鞘酯類等化合物被排除在外。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道冬蟲夏草含有大量的多糖、蛋白類成分，冬蟲夏草含有粗蛋白約30%，總糖類約13%[27]，從冬蟲夏草中純化出4.39×104Da的半乳糖甘露聚糖能降低SD大鼠的血清尿素氮和肌酐水平，明顯減輕大鼠腎臟細(xì)胞病變癥狀[28-29]；冬蟲夏草蛋白能上調(diào)Bax誘導(dǎo)凋亡，抑制A549細(xì)胞增殖，促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌TNF-α、IL-1、IL-12，激活免疫反應(yīng)抑制A549細(xì)胞增殖[30]。由于冬蟲夏草的多糖和蛋白等大分子化合物分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，難以準(zhǔn)確發(fā)現(xiàn)其治療疾病的靶點(diǎn)，暫未被TCMSP數(shù)據(jù)庫收錄。建議未來加強(qiáng)冬蟲夏草大分子成分的補(bǔ)腎精虧虛的作用研究，完善冬蟲夏草腎精虧虛證的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討冬蟲夏草治療腎精虧虛證的有效活性成分、靶點(diǎn)和通路，為后續(xù)進(jìn)一步試驗(yàn)等提供了理論支持。但還有更多冬蟲夏草的活性成分、靶點(diǎn)和通路有待發(fā)現(xiàn)，本研究也難以全面解釋其治療腎精虧虛證的作用機(jī)制，需要在以后的研究中，針對(duì)某一通路和靶點(diǎn)驗(yàn)證冬蟲夏草可治療腎精虧虛證。