蔡萌強(qiáng)，劉素彤，劉君穎，張麗慧，趙文霞

1 河南中醫(yī)藥大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院，鄭州 450000； 2 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 脾胃肝膽科，鄭州 450000

自身免疫性肝病(autoimmune liver disease，AILD)是一類(lèi)由異常自身免疫反應(yīng)介導(dǎo)的肝組織炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致肝細(xì)胞和/或膽管上皮細(xì)胞損傷的慢性肝膽系統(tǒng)炎性疾病。根據(jù)生化學(xué)、組織病理學(xué)及免疫學(xué)特征，可分成以肝細(xì)胞損傷為主的自身免疫性肝炎(AIH)和以膽管上皮細(xì)胞損傷為主的原發(fā)性膽汁性膽管炎(PBC)及原發(fā)性硬化性膽管炎(PSC)；同時(shí)具備上述兩種組織學(xué)特征的則稱(chēng)為重疊綜合征[1]。盡管目前對(duì)環(huán)境因素和遺傳易感性在觸發(fā)免疫性肝損傷中的認(rèn)識(shí)逐年增加，但AILD的確切發(fā)病機(jī)制仍未闡明[2]。AILD常伴有肝細(xì)胞和/或膽管上皮細(xì)胞的免疫炎癥損傷和慢性損傷修復(fù)反應(yīng)，易進(jìn)展為肝硬化，肝衰竭，甚至肝細(xì)胞癌，因此早期診斷、及時(shí)干預(yù)是改善AILD預(yù)后的關(guān)鍵。

microRNA (miRNA)是一種內(nèi)源性、短鏈非編碼RNA分子，通過(guò)與轉(zhuǎn)錄后mRNA互補(bǔ)區(qū)域結(jié)合，誘導(dǎo)mRNA降解或抑制基因轉(zhuǎn)化后翻譯，調(diào)控靶基因表達(dá)。單一miRNA可調(diào)節(jié)數(shù)百個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因，對(duì)細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程(包括代謝、免疫、增殖和凋亡、發(fā)育和分化)起重要的調(diào)控作用[3]。miRNA作為生物標(biāo)志物、潛在治療工具或靶點(diǎn)，在肝臟疾病中已進(jìn)行了廣泛的研究[4]。近年來(lái)，越來(lái)越多研究發(fā)現(xiàn)miRNA異常與AILD發(fā)病過(guò)程中的免疫炎癥反應(yīng)、肝纖維化密切相關(guān)，miRNA可通過(guò)影響肝臟免疫細(xì)胞分化、膽管上皮細(xì)胞分泌及肝星狀細(xì)胞激活等，參與ALID發(fā)生發(fā)展過(guò)程。

1 miRNA與AIH

AIH是由于自身免疫異常攻擊肝細(xì)胞，導(dǎo)致肝細(xì)胞炎癥損傷、肝纖維化，甚至肝衰竭。以血清轉(zhuǎn)氨酶和IgG增高、自身抗體陽(yáng)性為血清學(xué)特征，以肝組織出現(xiàn)中重度界面性肝炎為組織學(xué)特征[5]。然而目前AIH發(fā)病機(jī)制尚不清楚，發(fā)病機(jī)制可能與遺傳易感性、細(xì)胞分子機(jī)制及免疫調(diào)節(jié)功能缺失相關(guān)[6]。研究發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照相比，AIH患者的miRNA譜發(fā)生明顯改變，提示miRNA可能參與AIH的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。

1.1 miRNA參與肝臟免疫炎癥反應(yīng) CD4+T淋巴細(xì)胞是一種重要的免疫細(xì)胞，在AIH中，免疫介導(dǎo)的肝損傷是由自身反應(yīng)性CD4+T淋巴細(xì)胞引起的[7]。有學(xué)者[8]認(rèn)為，調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞 (Treg) /輔助性T淋巴細(xì)胞 (Th) 17及其相關(guān)細(xì)胞因子分泌失衡可能是AIH的一個(gè)重要發(fā)病機(jī)制。miR-155是一種在淋巴細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)的miRNA，可通過(guò)調(diào)控Treg和Th17分化，參與多種自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[9-10]。Xia等[11]發(fā)現(xiàn)在刀豆蛋白A (ConA)誘導(dǎo)的AIH小鼠模型中，肝組織miR-155明顯升高，并在48 h時(shí)達(dá)正常對(duì)照組的9.2倍。研究發(fā)現(xiàn)，抑制miR-155表達(dá)，可顯著阻止AIH小鼠肝臟Th17和Treg分化，而且由Th17分泌的促炎因子(IL-17A、IL-23)也明顯降低，但由Treg分泌的抗炎因子(IL-10)未受到影響。不僅如此，抑制miR-155表達(dá)后，由ConA誘導(dǎo)的血清ALT、AST、ALP升高亦被顯著抑制。Blaya等[12]發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照相比，AIH患者肝組織miR-155表達(dá)顯著增高(較正常對(duì)照增加7.6±5.6倍)；而外周血單核細(xì)胞miR-155表達(dá)卻降低，且經(jīng)過(guò)免疫抑制治療后，外周血單核細(xì)胞中的miR-155水平仍無(wú)顯著改變；進(jìn)一步將敲除miR-155基因小鼠和野生型小鼠同時(shí)注射ConA后，與野生型小鼠相比，miR-155缺陷小鼠肝組織炎癥壞死更顯著，血清ALT、AST以及受體相互作用蛋白激酶(RIPK1、RIPK3)等凋亡相關(guān)因子水平顯著增高。因此，miR-155在免疫介導(dǎo)的肝損傷中可能具有多效性作用，在肝組織和炎癥細(xì)胞中的正確表達(dá)可能均重要。

外泌體是一種脂質(zhì)雙層膜小泡，可由多種細(xì)胞分泌，直接將供體細(xì)胞中的mRNA、miRNA及蛋白質(zhì)等生物活性分子轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞，以調(diào)控受體細(xì)胞反應(yīng)[12]。Chen等[13]發(fā)現(xiàn)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells, BMSC)的外泌體可減輕由肝臟特異性抗原S100、內(nèi)毒素(LPS)誘導(dǎo)的AIH模型小鼠的肝損傷，其機(jī)制與抑制淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)及血清TNFα、IL-17A和IL-1β水平相關(guān)；當(dāng)應(yīng)用轉(zhuǎn)染miR-223前體的BMSC外泌體時(shí)，其對(duì)AIH小鼠肝損傷的保護(hù)作用更顯著；而轉(zhuǎn)染miR-223抑制劑時(shí)，外泌體的保護(hù)效果完全消失。研究結(jié)果表明miR-223對(duì)S100和LPS誘導(dǎo)AIH模型小鼠肝損傷具有顯著保護(hù)作用。新近研究[14]發(fā)現(xiàn)，核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)異常活化參與了許多自身免疫性疾病的進(jìn)展。的確，NLRP3信號(hào)通路在AIH小鼠中被顯著激活，研究發(fā)現(xiàn)含miR-223的BMSC外泌體可下調(diào)NLRP3，提示miR-223可能通過(guò)調(diào)控NLRP3信號(hào)通路防治AIH疾病進(jìn)展。

1.2 miRNA參與AIH肝纖維化 目前以糖皮質(zhì)激素聯(lián)合硫唑嘌呤為主的治療方案可使38%～93%的AIH患者得到緩解，但仍有30%～50%的患者治療無(wú)效從而進(jìn)展為肝硬化[15]。Tu等[16]研究發(fā)現(xiàn)AIH相關(guān)肝纖維化小鼠肝組織內(nèi)miR-143水平明顯低于正常對(duì)照，作者通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-143使AIH小鼠體內(nèi)miR-143過(guò)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-143組小鼠血清和肝組織內(nèi)TNFα、核因子-κB(NF-κB)及Ⅳ型膠原、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、TGFβ等促肝纖維化基因表達(dá)水平顯著低于無(wú)轉(zhuǎn)染AIH對(duì)照小鼠[17]，且肝臟形態(tài)及大小基本恢復(fù)正常；進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子活化激酶1(transforming growth factor-β3activated kinase 1,TAK1)磷酸化水平隨肝損傷程度增加而上調(diào)，經(jīng)miR-143干預(yù)的AIH小鼠肝組織TAK1磷酸化水平明顯降低，提示TAK1可能是miR-143的下游靶點(diǎn)。研究結(jié)果表明，miR-143可通過(guò)調(diào)節(jié)TAK1磷酸化改善由S100和LPS誘導(dǎo)的AIH小鼠肝組織炎癥損傷和纖維化。

1.3 miRNA作為AIH的生物標(biāo)志物 miR-122是肝細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量最高的一種miRNA，占肝臟miRNA總量的70%以上，具有高度的肝臟特異性。病理狀態(tài)下，miR-122可參與多種肝臟疾病(如乙型肝炎、丙型肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、藥物性肝炎、肝癌等)的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[18-20]。Migita等[21]發(fā)現(xiàn)AIH患者與健康受試者相比，體內(nèi)miR-122明顯升高(可達(dá)7.34倍)，并與患者血清ALT、AST水平呈正相關(guān)，且經(jīng)糖皮質(zhì)激素治療好轉(zhuǎn)后其水平明顯下調(diào)。眾所周知，miR-21可通過(guò)維持T淋巴細(xì)胞增殖與抑制其凋亡，調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫參與多種自身免疫疾病[22]。與miR-122類(lèi)似，miR-21在AIH患者血清中明顯增高，且與AIH患者血清ALT、AST相關(guān)性更顯著[21]。然而，AIH肝硬化晚期患者血清miR-122和miR-21卻明顯降低，且與肝纖維化評(píng)分呈負(fù)相關(guān)。但在組織學(xué)方面，僅miR-21表達(dá)水平與AIH炎癥的組織學(xué)分級(jí)呈正相關(guān)。因此，miR-122和miR-21有潛力成為評(píng)估AIH患者肝損傷程度和疾病狀態(tài)的生物學(xué)標(biāo)志物。由于miR-122在多種肝損傷模型中均表達(dá)增高，作為診斷標(biāo)志物，敏感性較高，特異性較低；而miR-21僅在AIH炎癥損傷時(shí)增高，對(duì)評(píng)估AIH炎癥損傷具有更好的特異性。

2 miRNA與PBC

PBC是一種以肝內(nèi)膽管破壞為特征的自身免疫性慢性膽汁淤積性肝病[23]，疾病主要發(fā)生于40歲以上的女性(男∶女為1∶9～10)[24]。PBC血清學(xué)特征為持續(xù)高滴度抗線粒體抗體陽(yáng)性，病理生理與機(jī)體對(duì)丙酮酸脫氫酶復(fù)合物E2亞基(PDC-E2)免疫耐受性喪失有關(guān)，導(dǎo)致靶向損傷膽道上皮細(xì)胞[25-26]；組織學(xué)特征包括門(mén)靜脈淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、選擇性破壞肝內(nèi)膽管、膽管纖維化。熊去氧膽酸(UDCA)可提高PBC患者無(wú)肝移植生存率，但仍有約40%PBC患者對(duì)熊去氧膽酸治療無(wú)應(yīng)答[23]，最終發(fā)生肝纖維化甚至肝衰竭。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多個(gè)miRNA在PBC患者中呈差異性表達(dá)，呈現(xiàn)出不同的miRNA表達(dá)譜，miRNA可通過(guò)影響PBC患者膽管細(xì)胞分泌、免疫細(xì)胞凋亡、分化及炎癥損傷等方面參與PBC的病理進(jìn)展過(guò)程。

2.1 miRNA調(diào)控膽汁分泌 陰離子轉(zhuǎn)換蛋白2(anion exchanger 2，AE2)是膽道上皮細(xì)胞內(nèi)Cl-/HCO3-的交換器，可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)pH和膽管碳酸氫鹽分泌，在膽管細(xì)胞頂端表面形成富含碳酸氫鹽的“保護(hù)傘”，使膽管上皮細(xì)胞免受疏水膽汁酸的影響，下調(diào)AE2表達(dá)可能引起膽汁淤積和膽管細(xì)胞損傷，導(dǎo)致對(duì)易感者膽管細(xì)胞免疫耐受破壞并繼發(fā)自身免疫反應(yīng)[25,27]。與正常肝組織相比，PBC患者肝組織內(nèi)miRNA-506上調(diào)3.4倍，原位雜交顯示miRNA-506主要位于肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞中[28]。膽管細(xì)胞內(nèi)miRNA-506通過(guò)與AE2 mRNA 3′未翻譯區(qū)(3′UTR)結(jié)合，抑制蛋白翻譯，下調(diào)AE2表達(dá)及活性，降低Cl-/HCO3-交換，導(dǎo)致膽道上皮細(xì)胞線粒體功能障礙、胞內(nèi)PDC-E2過(guò)表達(dá)以及對(duì)膽鹽敏感性增加，從而誘導(dǎo)膽管細(xì)胞凋亡、增殖。因此，抑制膽管細(xì)胞內(nèi)miRNA-506表達(dá)可使AE2活性增加，從而發(fā)揮治療作用。此外，膽管細(xì)胞中，Ⅲ型肌醇1,4,5-三磷酸受體(the type Ⅲ inositol 1,4,5- trisphosphate receptor，InsP3R3)是細(xì)胞內(nèi)Ca2+信號(hào)的主要信使分子，負(fù)責(zé)觸發(fā)基底外側(cè)Ca2+流向，InsP3R3在PBC患者膽管細(xì)胞表達(dá)下調(diào)，引發(fā)細(xì)胞內(nèi)Ca2+信號(hào)和膽汁碳酸氫鹽分泌受損，可導(dǎo)致膽汁淤積[29]。miR-506是表觀調(diào)控膽管細(xì)胞InsP3R3表達(dá)的主要因子，miR-506上調(diào)可直接抑制InsP3R3表達(dá)，進(jìn)而抑制PBC患者膽管細(xì)胞分泌。因此，miR-506對(duì)InsP3R3表達(dá)的影響，與PBC患者的AE2下調(diào)具有協(xié)同作用，進(jìn)一步降低膽管細(xì)胞的膽汁分泌，可能是miR-506調(diào)控PBC疾病進(jìn)展的主要機(jī)制。也已證實(shí)，miRNA-506定位于Xq27.3，是一條X連鎖miRNA[30]，因此，從表觀遺傳學(xué)角度分析，表觀遺傳X失活和由此產(chǎn)生的miR-506上調(diào), 可能與PBC發(fā)病主要為女性密切相關(guān)。

2.2 miRNA調(diào)控膽管的免疫炎癥反應(yīng) 研究[31]發(fā)現(xiàn)，在PBC患者外周血、肝臟及淋巴結(jié)內(nèi)與PDC-E2發(fā)生反應(yīng)的CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯增加，提示CD4+T淋巴細(xì)胞在PBC發(fā)病機(jī)制中可能起重要作用。Nakagawa等[32]通過(guò)微陣列和qRT-PCR在研究PBC患者CD4+T淋巴細(xì)胞內(nèi)的miRNA時(shí)，發(fā)現(xiàn)有miR-181a、miR-181b、miR-374b、miR-425 4種miRNAs表達(dá)下調(diào)。N-Ras作為T(mén)淋巴細(xì)胞受體信號(hào)通路上游靶點(diǎn)，是PBC膽管細(xì)胞衰老相關(guān)因子，可活化T淋巴細(xì)胞參與PBC發(fā)展過(guò)程[33]，微陣列研究和靶點(diǎn)預(yù)測(cè)提示：miR-181a、miR-181b、miR-374b、miR-425可能參與協(xié)同調(diào)節(jié)N-Ras靶點(diǎn)，繼而通過(guò)T淋巴細(xì)胞受體信號(hào)通路引發(fā)肝內(nèi)炎癥因子表達(dá)增加。同時(shí)體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)miR-425過(guò)表達(dá)時(shí)，可抑制N-Ras靶點(diǎn)及相應(yīng)炎癥因子(IL-2、INFγ)表達(dá)。

Th17可在自身免疫和病原入侵的背景下，分泌IL-6、IL-17、IL-22、TNFα等多種細(xì)胞因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和促炎作用[34]。Song等[35]發(fā)現(xiàn)與正常人和乙型肝炎患者相比，PBC患者外周血Th17占比顯著升高，且T淋巴細(xì)胞內(nèi)miR-181a表達(dá)下調(diào)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PBC患者體內(nèi)抗細(xì)胞凋亡蛋白(Bcl-2)表達(dá)水平顯著增高；Bcl-2蛋白表達(dá)不僅與miR-181a水平呈負(fù)相關(guān)，且與Th17占比呈正相關(guān)。研究結(jié)果表明，miR-181a的下調(diào)可通過(guò)增加Bcl-2表達(dá)，以抑制Th17凋亡，進(jìn)而促進(jìn)PBC疾病進(jìn)程中的T淋巴細(xì)胞活化。Liang等[36]分析PBC患者血漿和外周單核細(xì)胞內(nèi)miRNA后，發(fā)現(xiàn)無(wú)論血清還是單核細(xì)胞，miR-92a表達(dá)均下調(diào)，且與PBC患者外周血Th17占比呈負(fù)相關(guān)；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)外周單核細(xì)胞內(nèi)miR-92a和IL-17A可以共表達(dá)，表明miR-92a可能引發(fā)T淋巴細(xì)胞亞群失衡，特別是調(diào)節(jié)Th17增加，最終在PBC疾病進(jìn)展中扮演重要角色。

3 miRNA與PSC

PSC是一種罕見(jiàn)的慢性進(jìn)展性膽道疾病，其特征是自身免疫反應(yīng)誘導(dǎo)的膽管損傷、多發(fā)性膽管狹窄、膽汁淤積，繼而發(fā)生肝組織炎癥、纖維化甚至膽管惡性腫瘤。PSC病因和發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，具體病理生理機(jī)制尚不清楚。與其他自身免疫性肝病不同，PSC發(fā)病人群主要為青年男性。此外，PSC與炎癥性腸病密切相關(guān)，70%的PSC患者伴發(fā)炎癥性腸病，5%～10%的炎癥性腸病患者合并PSC[37]。并且迄今為止，尚無(wú)藥物治療對(duì)臨床結(jié)局有顯著影響，肝移植仍是大多數(shù)患者的最終需要[38]。目前miRNA與PSC的研究主要集中于參與并調(diào)控PSC肝纖維化進(jìn)展的研究方向。

多藥耐藥基因-2敲除小鼠(Mdr2-/-)與人類(lèi)PSC臨床過(guò)程相似，因此常被用作為研究PSC的模型[39]。膽道損傷和增生性肝纖維化是PSC和Mdr2-/-模型的典型病理特征。miR-200b的表達(dá)在晚期PSC患者和Mdr2-/-的膽管細(xì)胞中均增加，體外應(yīng)用miR-200b抑制劑處理人肝星狀細(xì)胞可降低肝星狀細(xì)胞中促纖維化基因和血管生成基因(VEGF-A/C, VEGFR-2/3等)表達(dá)，減輕肝纖維化[40]。研究發(fā)現(xiàn)，以褪黑素預(yù)處理或長(zhǎng)期暴露于黑暗環(huán)境中的Mdr2-/-膽管細(xì)胞miR-200b顯著降低，提示褪黑激素/miR-200b軸可能是包括PSC在內(nèi)的膽管損傷和纖維化的治療靶點(diǎn)。Hall等[41]研究發(fā)現(xiàn)miR-24/menin調(diào)節(jié)軸可能在PSC發(fā)展至肝纖維化過(guò)程中發(fā)揮作用。Menin蛋白可通過(guò)調(diào)節(jié)TGFβ1通路參與肝纖維化過(guò)程[42]，與野生對(duì)照小鼠相比，Mdr2-/-PSC模型小鼠飼養(yǎng)至12周時(shí)，肝組織menin水平降低，但在66周時(shí)明顯增加，而肝組織miR-24表達(dá)卻與menin變化完全相反。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，抑制miR-24表達(dá)后，肝組織menin及促纖維化因子(TGFβ1、α-SMA等)表達(dá)均明顯增加，表明miR-24可負(fù)調(diào)控menin參與膽汁淤積性肝病的纖維化過(guò)程。miR-24/menin調(diào)節(jié)軸在PSC患者疾病進(jìn)展中的作用仍有待進(jìn)一步研究。

4 展望

AILD的病因、發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明，既是基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)，也是臨床診療的難點(diǎn)。隨著miRNA調(diào)控免疫、膽汁代謝、肝組織炎癥損傷及纖維化修復(fù)證據(jù)的增加，必將加深人們對(duì)miRNA在AILD中作用的理解，為AILD診斷、防治及預(yù)后評(píng)估提供新的標(biāo)志物及潛在治療靶點(diǎn)。日益增加的證據(jù)顯示miRNA可能參與了AILD發(fā)生發(fā)展過(guò)程的調(diào)控，但miRNA在AILD臨床診療中的價(jià)值仍有待臨床數(shù)據(jù)的積累及論證，這可能是AILD未來(lái)研究的一個(gè)方向。

作者貢獻(xiàn)聲明：蔡萌強(qiáng)負(fù)責(zé)資料收集、撰寫(xiě)論文；劉素彤、劉君穎、張麗慧負(fù)責(zé)修改論文；趙文霞負(fù)責(zé)擬定研究方向、寫(xiě)作思路，指導(dǎo)撰寫(xiě)文章并最后定稿。