江 沿 詹 學(xué)

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院消化科 國家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 兒童發(fā)育疾病研究 教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 兒科學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（重慶 400014）

自1990 年代起，隨著人們居住環(huán)境城市化以及生活方式西方化，兒童食物過敏（food allergy）的發(fā)病率大幅上升，并成為全球性的公共衛(wèi)生問題[1-4]。近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)在細(xì)菌群落分析中的應(yīng)用，越來越多的證據(jù)支持腸道菌群在食物過敏發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色[5-7]。微生物特別是細(xì)菌在腸道的早期定植發(fā)育對機(jī)體免疫系統(tǒng)的平衡至關(guān)重要[8]，腸道菌群與宿主之間穩(wěn)定的微生態(tài)環(huán)境破壞將導(dǎo)致食物過敏的發(fā)生。因此，調(diào)節(jié)宿主體內(nèi)腸道菌群平衡，維持宿主與腸道微生物群之間的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，對預(yù)防或治療兒童食物過敏起著至關(guān)重要的 作用。

1 腸道菌群的建立

雖然目前公認(rèn)胎兒在母體內(nèi)是處于無菌環(huán)境中，新生兒腸道菌群的定植最初發(fā)生在出生時，但有研究發(fā)現(xiàn)除感染因素外，一些特定的微生物群也存在于胎盤、胎膜、羊水、臍血和胎糞中，提示腸道菌群的最初定植可能在出生前就已完成[9]。研究顯示，生后1 年內(nèi)，腸道菌群沿著年齡相關(guān)的發(fā)育進(jìn)程共同進(jìn)化，新生兒糞便菌群通常以雙歧桿菌科（Bifidobacteriaceae）、腸桿菌科（Enterobacteriaceae）為主，隨著年齡的增長，到嬰兒期雙歧桿菌科和腸桿菌科的豐度減少，而毛螺菌科（Lachnospiraceae）的豐度增加[10]。

腸道菌群的組成一直處于動態(tài)變化中，且易受多種因素影響。采用16S rRNA基因測序方法分析分娩方式不同的120名嬰兒生后1年內(nèi)糞便菌群的多樣性和組成，以探討生命早期腸道菌群的組成及其動態(tài)改變對嬰兒健康的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，剖宮產(chǎn)和陰道分娩嬰兒的腸道菌群在生后第1 年有顯著差異，特別是在出生后第1 周菌群組成的差異性最大，表現(xiàn)為陰道分娩嬰兒大腸桿菌屬（Escherichia coli）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）富集，腸球菌屬（Enterococcus）和克雷伯菌屬（Klebsiella）（潛在病原菌）豐度減少。并且陰道分娩嬰兒早期腸道菌群的發(fā)展更穩(wěn)定，生后主要以兼性厭氧菌屬（Facultative anaerobic genera）如大腸桿菌和葡萄球菌（Staphylococcus）為主，隨著時間的推移，逐漸被雙歧桿菌屬作為優(yōu)勢菌屬所取代；而剖宮產(chǎn)嬰兒的腸道雙歧桿菌（Bifidobacteria）定植明顯延遲。說明陰道分娩過程中母體的傳播對于嬰兒生命早期多種菌群種類的獲得至關(guān)重要，剖宮產(chǎn)分娩可能導(dǎo)致嬰兒腸道菌群建立延遲，增加發(fā)生菌群紊亂的風(fēng)險，而陰道分娩可能為早期腸道菌群發(fā)展提供適合的生態(tài)空間環(huán)境[11]。采用高通量16S rDNA基因測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)，高脂飲食小鼠體內(nèi)細(xì)菌群落α多樣性（指單獨(dú)個體內(nèi)菌群分類單元多樣性）降低，β多樣性（指不同個體之間菌群分類單元多樣性）增加，梭狀芽孢桿菌屬（Clostridiales）的瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）、變形菌屬（Deltaproteobacteria）的脫硫弧菌科（Desulfovibrionaceae）和擬桿菌屬（Bacteroidetes）的里研菌科（Rikenellaceae）的豐度顯著增加，鼠桿菌科（Muribaculaceae）和普氏菌科（Prevotellaceae）的豐度減少[12]。

除上述分娩方式及飲食外，現(xiàn)代生活方式的多種因素均會引發(fā)腸道共生菌群的變化[9,13-14]，如從農(nóng)村向城市或郊區(qū)生活過渡、抗生素使用、疫苗接種、母乳或配方奶喂養(yǎng)、日常嬰兒護(hù)理、多個兄弟姐妹、家有寵物等。

2 食物過敏與腸道菌群的變化

新近研究證實(shí)，腸道菌群的組成及結(jié)構(gòu)改變與食物過敏存在因果關(guān)系。瑞典一項(xiàng)前瞻性研究采用16 S rRNA 基因測序隨訪93 名兒童從嬰兒期（4、6、13 月齡）到學(xué)齡期（8 歲）腸道菌群的變化，與非過敏兒童相比，過敏性疾病兒童腸道內(nèi)瘤胃球菌屬（Ruminococcus）暫時性低表達(dá)（在6 月齡時減少，之后呈時間依賴性增加），擬桿菌屬、普氏菌屬（Prevotella）以及糞球菌屬（Coprococcus）持續(xù)性低表達(dá)，8 歲時過敏兒童腸道菌群中雙歧桿菌富集，其中以青年雙歧桿菌（Bifidobacterium adolescentis）富集最明顯，而乳桿菌（Lactobacillus）、腸球菌（Enterococcus）和毛螺菌（Lachnospira）減少[5]。在美國一項(xiàng)出生隊列前瞻性研究中，以16 S rRNA 測序法分析216 名兒童3～6 月齡糞便菌群，并在3 歲時檢測牛奶、雞蛋、花生、大豆、小麥和核桃血清特異性IgE（sIgE），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，食物致敏或過敏反應(yīng)兒童腸道菌群種類及多樣性與正常兒童相比顯著減少，嗜血桿菌屬（Haemophilus）、枸櫞酸桿菌屬（Citrobacter）、Dialister菌屬（厚壁菌門,Firmicutes）、Dorea菌屬、梭菌屬（Clostridium）、顫螺旋菌屬（Oscillospira）及乳球菌屬（Lactococcus）豐度明顯減 少[6]。新加坡的研究亦有相似發(fā)現(xiàn)，過敏嬰兒在3月齡時菌群豐度顯著降低，而非過敏嬰兒放線菌門（Actinobacteria）和疣微菌門（Verrucomicrobia），比如阿克曼菌（Akkermansia）豐度明顯高于過敏嬰兒，以共生菌屬雙歧桿菌的豐度最高，占總菌屬數(shù)的28.84%；早期克雷伯菌屬/雙歧桿菌屬豐度比值升高與兒童后期發(fā)生過敏反應(yīng)的潛在風(fēng)險增加有關(guān)，與低豐度比值嬰兒在18月齡、3歲時發(fā)生過敏的概率分別增加6倍、9倍[15]。

但與之相反，也有研究通過16 S rRNA 基因測序分析發(fā)現(xiàn)牛奶蛋白過敏嬰兒糞便細(xì)菌多樣性顯著增加，毛螺菌科豐度增加，雙歧桿菌屬豐度降低；進(jìn)一步通過菌群移植實(shí)驗(yàn)在小鼠模型中證實(shí)雙歧桿菌/毛螺菌科比值降低，促使小鼠免疫系統(tǒng)向Th2方向發(fā)展，進(jìn)一步加重過敏臨床反應(yīng)[16]。

上述多項(xiàng)研究證實(shí)食物過敏兒童與非過敏兒童體內(nèi)腸道菌群存在明顯差異，并從時間相關(guān)性上表明機(jī)體內(nèi)菌群的改變較食物過敏反應(yīng)發(fā)生早，存在相關(guān)因果關(guān)系。兒童早期腸道菌群平衡的破壞可增加生命后期發(fā)生食物過敏的潛在風(fēng)險，為研究以腸道微生物群為靶點(diǎn)早期預(yù)防或治療食物過敏反應(yīng)提供科學(xué)理論依據(jù)。

3 腸道菌群促進(jìn)免疫耐受形成

宿主胃腸道局部的免疫系統(tǒng)（即腸黏膜相關(guān)淋巴組織）對無害的蛋白抗原無反應(yīng)的狀態(tài)稱為口服免疫耐受[17]?？诜褪軝C(jī)制被破壞會導(dǎo)致食物過敏發(fā)生。胃腸道內(nèi)影響免疫耐受的兩個主要因素為飲食及腸道微生物群[18]。小鼠模型證實(shí)，正常生理情況下食物中的大分子成分可誘導(dǎo)小腸固有層調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）的大量發(fā)育，進(jìn)而抑制機(jī)體對無害食物抗原的免疫反應(yīng)[18]。另外，生命早期引入固體食物，對食物抗原免疫耐受的建立也起到重要作用[18-20]。一項(xiàng)隨機(jī)對照試驗(yàn)證實(shí)，對于患有嚴(yán)重濕疹、雞蛋過敏或兩者兼而有之的高危嬰兒（640名）在早期飲食中引入花生可使嬰兒5歲前花生過敏發(fā)生率明顯降低[19]。腸道菌群與固有免疫細(xì)胞和功能性上皮屏障的相互作用，對建立和維持機(jī)體口服耐受至關(guān)重要。

3.1 調(diào)節(jié)免疫平衡

腸道微生物群參與調(diào)節(jié)機(jī)體生理的多種方面，微生物群的改變可能對機(jī)體免疫調(diào)節(jié)產(chǎn)生長期影響[21]?？诜庖吣褪艿恼T導(dǎo)需要CX 3 CR 1+單核巨噬細(xì)胞（CX 3 CR 1+mononuclear phagocytes，CX 3 CR 1+MNPs）的抗原提呈作用及IL-10的生成[22]。研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群在CX 3 CR 1+MNPs調(diào)節(jié)腸道T細(xì)胞反應(yīng)中起到關(guān)鍵作用，正常腸道菌群促進(jìn)CX 3 CR 1+MNPs產(chǎn)生IL-10，調(diào)節(jié)Th 1/Treg、Th 17/Treg平衡，抑制促炎性Th 1和Th 17細(xì)胞擴(kuò)增，促進(jìn)抗炎性Treg細(xì)胞分化，以維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，減輕腸道炎癥；同時CX 3CR 1+MNPs效應(yīng)細(xì)胞因子IL-10 的產(chǎn)生也需要細(xì)菌上皮的附著作用，腸道菌群的上皮黏附性是產(chǎn)生機(jī)體抗炎作用的關(guān)鍵，腸道菌群附著于腸上皮細(xì)胞，進(jìn)一步激活CX 3 CR 1+MNPs中的抗炎信號，以抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)及病理損傷[22]。

此外，腸道菌群還可通過激活MyD 88 通路促進(jìn)Treg 細(xì)胞表達(dá)核激素受體RORγt，抑制機(jī)體免疫反應(yīng)，食物過敏嬰兒和小鼠體內(nèi)發(fā)生菌群失調(diào)導(dǎo)致菌群調(diào)節(jié)功能受損，缺乏表達(dá)Myd 88或Rorc mRNA（編碼RORγt）的Treg細(xì)胞，過度表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子GATA-3及其他Th 2相關(guān)細(xì)胞因子，促使Th 2相關(guān)的免疫損傷，破壞黏膜表面免疫平衡[23-24]。

3.2 維持腸黏膜屏障功能

腸道黏膜屏障由黏膜上皮細(xì)胞、細(xì)胞間的緊密連接等構(gòu)成，正常腸道菌群對維持和增強(qiáng)腸黏膜屏障功能起著重要作用。例如梭狀菌屬通過刺激正常人的3型固有淋巴細(xì)胞（type 3 innate lymphoid cells，ILC 3）生成IL-22（原名IL-10相關(guān)T 細(xì)胞衍生誘導(dǎo)因子，屬IL-10家族糖蛋白），IL-22通過介導(dǎo)腸上皮細(xì)胞再生，并誘導(dǎo)潘氏細(xì)胞產(chǎn)生抗菌肽、杯狀細(xì)胞產(chǎn)生黏液，增強(qiáng)物理屏障功能，降低腸道通透性，維持上皮屏障的完整性和減少機(jī)體對過敏原的暴露[25-26]。健康小鼠模型證實(shí)，糞厭氧擬桿菌（Anaerostipes caccae）可調(diào)節(jié)回腸上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄基因表達(dá)[27]，將其單定植無菌小鼠后發(fā)現(xiàn)，小鼠血清中β-乳球蛋白sIgE、IgG1、小鼠肥大細(xì)胞蛋白酶-1（mMCPT-1）和IL-13、IL-14 等細(xì)胞因子水平下降，小鼠對牛奶蛋白的反應(yīng)性明顯降低，說明糞厭氧擬桿菌可促進(jìn)機(jī)體免疫耐受形成，與預(yù)防牛奶蛋白過敏的發(fā)生相關(guān)。

短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）是由腸道共生菌發(fā)酵纖維而產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，其中乙酸鹽最多，其次為丙酸鹽和丁酸鹽。SCFAs 主要促進(jìn)腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)，也維持腸道屏障功能[28]。丁酸鹽可激活結(jié)腸上皮細(xì)胞的PPAR-γ 信號通路[29]，促使結(jié)腸上皮細(xì)胞β-氧化獲得能量，丁酸鹽消耗大量氧，使上皮細(xì)胞處于缺氧狀態(tài)，另外，維持結(jié)腸上皮細(xì)胞內(nèi)的缺氧厭氧狀態(tài)，促使腸道菌群以產(chǎn)SCFAs的專性厭氧菌為優(yōu)勢菌群，形成良性循環(huán)，維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。此外，SCFAs 可借G 蛋白偶聯(lián)受體GPR 43 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)介導(dǎo)的方式增加上皮黏膜屏障功能，促進(jìn)IgA 生成，增強(qiáng)濾泡輔助T細(xì)胞和黏膜生發(fā)中心的反應(yīng)[30]。

4 益生菌的應(yīng)用

大量臨床和流行病學(xué)研究表明，早期腸道菌群的異常發(fā)育與兒童食物過敏相關(guān)臨床表現(xiàn)的發(fā)展存在關(guān)聯(lián)。此外，研究發(fā)現(xiàn)早期過敏發(fā)生也與后期兒童哮喘的發(fā)生有關(guān)，新生兒腸道菌群可通過調(diào)節(jié)腸道微環(huán)境影響CD4+T細(xì)胞數(shù)量和功能，從而影響兒童發(fā)生過敏性哮喘的易感性[10]。因此，通過早期干預(yù)來調(diào)節(jié)宿主腸道微生物菌群平衡，恢復(fù)宿主與腸道微生物之間的穩(wěn)態(tài)成為治療兒童食物過敏的一個新方向。

在卵清蛋白（ovalbumin，OVA）誘導(dǎo)過敏小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，益生菌復(fù)合物可明顯抑制OVA口服激發(fā)的過敏反應(yīng)、降低小鼠直腸溫度、改善腹瀉癥狀。進(jìn)一步分析證實(shí)，益生菌復(fù)合物可通過調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡，抑制OVA 致敏小鼠IgE、Th 2 細(xì)胞因子（IL-4、IL-5、IL-10、IL-13）和Th 17 細(xì)胞因子（IL-17）的分泌，誘導(dǎo)Th 1相關(guān)細(xì)胞因子（IFN-γ、IL-12）、TGF-β以及 CD 4+Foxp3+Tregs的生成，說明益生菌參與調(diào)節(jié)機(jī)體免疫平衡，可以減輕過敏相關(guān)炎癥反應(yīng)[31]。

除此之外，益生菌還可促進(jìn)機(jī)體免疫耐受的獲 得[32]。過敏小鼠模型證實(shí)，鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosusGG,LGG）配合深度水解配方喂養(yǎng)可加快誘導(dǎo)口服耐受的建立，抑制血清sIgE 的增加，顯著降低小鼠皮膚過敏反應(yīng)[33]。在對220名牛奶蛋白過敏兒童的隨機(jī)對照研究中，與單用深度水解配方喂養(yǎng)兒童相比，鼠李糖桿菌配合深度水解配方可加速牛奶蛋白耐受性的獲得，并降低其他過敏反應(yīng)（濕疹、蕁麻疹、哮喘或鼻結(jié)膜炎）的發(fā)生風(fēng)險[34]。英國研究者建議用鼠李糖桿菌配合深度水解蛋白配方代替單用深度水解蛋白配方作為IgE介導(dǎo)的牛奶蛋白過敏嬰兒的一線飲食管理，以改善過敏患兒的預(yù)后，減少醫(yī)療資源的消耗及國家衛(wèi)生服務(wù)中心患者管理成本，從而為牛奶蛋白過敏治療提供經(jīng)濟(jì)、有效的飲食策略[35]。

綜上，生命早期腸道菌群的變化與兒童食物過敏的發(fā)生關(guān)系密切，菌群多樣性的改變及特定菌群組成平衡的紊亂可能會影響宿主免疫系統(tǒng)的成熟，增加宿主對過敏反應(yīng)的易感性。益生菌可作為微生態(tài)制劑調(diào)節(jié)宿主腸道菌群平衡，但其確切作用機(jī)制、具體菌種的選擇以及使用療程和時機(jī)尚有待進(jìn)一步探索。目前仍需大量實(shí)驗(yàn)室及臨床試驗(yàn)來進(jìn)一步確定如何有效穩(wěn)定地建立腸道菌群來預(yù)防或治療食物過敏。