楊雅茹，李帥東，白 林，姜冬梅

（1.宜賓學(xué)院，四川 宜賓 644000；2.宜賓職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川 宜賓 644000；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，四川 雅安 625000）

本研究利用上流式厭氧污泥床（UASB）處理來(lái)自豬場(chǎng)的高濃度有機(jī)廢水，探究其啟動(dòng)運(yùn)行性能和微生物在UASB 反應(yīng)器不同高度的分布情況，以期為UASB的性能優(yōu)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 UASB 反應(yīng)器裝置 UASB 反應(yīng)器由直徑為0.2 m的圓柱體有機(jī)玻璃構(gòu)成，上部為三相分離器和出水口，底部進(jìn)水，反應(yīng)器總高度為1.4 m，從三相分離器下端到反應(yīng)器底部從上到下均勻分布四個(gè)取樣口A、B、C、D，兩個(gè)取樣口之間相隔0.25 m，有效體積36 L。

1.2 啟動(dòng)運(yùn)行控制 本試驗(yàn)水質(zhì)為豬場(chǎng)廢水，取自四川農(nóng)業(yè)大學(xué)養(yǎng)豬場(chǎng)，化學(xué)需氧量（COD）達(dá)到8 000～10 000 mg∕L，pH 值為6.8～7.8；接種污泥為四川農(nóng)業(yè)大學(xué)污水處理廠ABR 反應(yīng)器排出的厭氧污泥，污泥量占反應(yīng)器總體積的21%。

UASB 啟動(dòng)方案：在常溫下（20～30 ℃）采用連續(xù)進(jìn)水的方式，初始進(jìn)水流量設(shè)置為18 L∕d，流量設(shè)置及對(duì)應(yīng)的水力停留時(shí)間（HRT）如表1 所示。在第一個(gè)水力停留時(shí)間，進(jìn)水濃度不斷升高，直至升到6 000 mg∕L。出水濃度和去除率達(dá)到穩(wěn)定后，提高進(jìn)水流量為28.8 L∕d，進(jìn)入HRT2階段，出水濃度COD再次穩(wěn)定后，繼續(xù)減少HRT，使之達(dá)到設(shè)計(jì)水流量72 L∕d。每日定時(shí)監(jiān)測(cè)出水pH值，保證其在7.2～7.8之間。

表1 不同進(jìn)水流量對(duì)應(yīng)的水力停留時(shí)間（HRT）

1.3 不同高度污水、污泥樣品的采集 在每個(gè)HRT 對(duì)反應(yīng)器從上到下O、A、B、C、D、I 六個(gè)取樣口的污水（含污泥）取樣，樣品置于高溫滅菌的聚乙烯瓶中，冰上保存并及時(shí)運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。

1.4 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.4.1 廢水水質(zhì)指標(biāo) 檢測(cè)方法主要依據(jù)中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定法及《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》。本研究主要檢測(cè)的水質(zhì)指標(biāo)及方法見(jiàn)表2。

表2 水質(zhì)監(jiān)測(cè)指標(biāo)及方法

1.4.2 16S rDNA 測(cè)序 利用提取污泥和廢水的DNA 試劑盒對(duì)樣品進(jìn)行DNA 提取，將廢水、污泥樣品總DNA通過(guò)Illumina Miseq技術(shù)測(cè)序平臺(tái)對(duì)16S rDNA V4區(qū)的PCR產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.5 微生物測(cè)序結(jié)果分析 使用QIIME1.8.0 軟件過(guò)濾測(cè)序數(shù)據(jù)。通過(guò)Flash軟件將有Overlap的一對(duì)Reads 進(jìn)行拼接，并對(duì)其數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。根據(jù)97%相似性使用Uclust 軟件對(duì)序列聚類成為OTUs（Operational Taxonomic Units），代表是一組來(lái)源于某一個(gè)相同分類單元的序列。從同一OTUs 中取一條代表性序列，使用RDP Classifier進(jìn)行下游的物種注釋分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 UASB 啟動(dòng)及運(yùn)行 反應(yīng)器共運(yùn)行了96 d，整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程COD去除情況見(jiàn)圖1。在水力停留時(shí)間為48 h（HRT1）階段，隨著進(jìn)水COD 濃度升高，出水口的COD 濃度緩緩降低，最低COD 濃度為336 mg∕L，COD 去除率最高能達(dá)到89.58%，此時(shí)的容積負(fù)荷從0.16 kgCOD∕m3·d 升高到1.4 kgCOD∕m3·d，這樣以高頻小幅的方式提升，可縮短調(diào)試期。

在水力停留時(shí)間為30 h、24 h和12 h（HRT 2、HRT3和HRT4）階段，進(jìn)水濃度維持在6 000 mg∕L左右時(shí)，每個(gè)HRT 的出水COD 呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，最終趨于穩(wěn)定。經(jīng)過(guò)4 個(gè)HRT 的運(yùn)行，COD去除率最終能達(dá)到80%以上。

沼氣產(chǎn)率如圖1 所示。在整個(gè)啟動(dòng)階段，沼氣產(chǎn)率一共有四個(gè)波峰，分別對(duì)應(yīng)四個(gè)運(yùn)行階段。在第一個(gè)階段，隨著反應(yīng)器運(yùn)行，沼氣產(chǎn)率不斷升高，最高升到了0.886 4 L∕L·d，但是當(dāng)HRT降低為30 h時(shí)，最高產(chǎn)率只有0.418 4 L∕L·d；后兩個(gè)HRT 階段的沼氣最高產(chǎn)率又恢復(fù)到0.9 L∕L·d左右，分別為0.890 1 L∕L·d、0.899 8 L∕L·d。說(shuō)明在第二階段的時(shí)候，反應(yīng)器正在適應(yīng)高濃度的COD，因此可以推測(cè)當(dāng)反應(yīng)器從固定HRT、升高濃度進(jìn)水變?yōu)楸３止潭ǜ邼舛冗M(jìn)水、降低HRT這個(gè)轉(zhuǎn)變過(guò)程會(huì)影響沼氣產(chǎn)率。

圖1 UASB反應(yīng)器啟動(dòng)期間進(jìn)水COD、出水COD和產(chǎn)氣率

啟動(dòng)中后期，容積負(fù)荷變化范圍為2.62～10.95 kgCOD∕m3·d。本次試驗(yàn)中，用UASB處理常溫下的豬場(chǎng)廢水，最高容積負(fù)荷和產(chǎn)氣率都較高，表明反應(yīng)器不同的設(shè)計(jì)參數(shù)和運(yùn)行情況會(huì)影響產(chǎn)氣率。

2.2 UASB 啟動(dòng)階段反應(yīng)器不同高度微生物群落的變化分析

2.2.1 微生物群落豐富度和多樣性分析 根據(jù)97%相似性聚類成的OTU數(shù)目和Alpha多樣性分析結(jié)果來(lái)看（見(jiàn)圖2），發(fā)現(xiàn)在UASB啟動(dòng)期間的每個(gè)HRT 階段，微生物群落的豐富度指數(shù)（Chao1）和多樣性指數(shù)（Shannon）會(huì)沿著反應(yīng)器高度呈現(xiàn)不同的差異性［1］。HRT1階段，微生物群落豐富度表現(xiàn)為中下部＞頂部＞中上部＞底部（C1＞A1＞B1＞D1）；微生物多樣性則表現(xiàn)為中上部＞頂部＞中下部＞底部（B1＞A1＞C1＞D1）。當(dāng)縮短水力停留時(shí)間為30 h（HRT2階段）時(shí)，微生物群落豐富度沿著UASB 反應(yīng)器高度增加而下降；微生物多樣性表現(xiàn)為底部最高，中下部最低。HRT3 階段，微生物群落豐富度變化趨勢(shì)為頂部＞中下部＞中上部＞底部（A3＞C3＞B3＞D3）；微生物多樣性沿著反應(yīng)器高度增加而升高。HRT4 階段，微生物群落的豐富度指數(shù)表現(xiàn)為中下部＞中上部＞頂部＞底部（C4＞B4＞A4＞D4）；多樣性指數(shù)和HRT3階段的變化趨勢(shì)一致。

圖2 OTU、Chao1和Shannon統(tǒng)計(jì)圖

2.2.2 物種注釋分析 采用RDP Classfier 對(duì)每一條OUTs的一條代表性序列進(jìn)行下游物種注釋分析，共得到60 個(gè)門、133 個(gè)綱、233 個(gè)目、253 個(gè)科、590 個(gè)屬水平的細(xì)菌和一些無(wú)法歸類的細(xì)菌。利用UASB 反應(yīng)器處理豬場(chǎng)廢水時(shí)，不同啟動(dòng)階段優(yōu)勢(shì)菌群在門水平上是相似的，分別為屬于古菌的廣古菌門（Euryarchaeota）和屬于細(xì)菌的擬桿菌（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Fimicutes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、陰溝單胞菌門（WWE1），屬水平上為甲烷絲菌屬（Methanosaeta）、擬桿菌目（Bacteroidales）和互養(yǎng)菌屬（Syntrophus），但占細(xì)菌總數(shù)的百分比不同。在細(xì)菌16S rRNA測(cè)序中發(fā)現(xiàn)了古菌，這是由于細(xì)菌和古菌在此基因序列上有較高的同源性［2］。

本試驗(yàn)中廣古菌門（Euryarchaeota）啟動(dòng)初期就是優(yōu)勢(shì)菌，與徐銳［3］的研究不一致，可能是因?yàn)榻臃N污泥自身就帶有Euryarchaeota。Euryarchaeota的甲烷絲菌屬（Methanosaeta）在屬水平上也是反應(yīng)器的優(yōu)勢(shì)菌，Methanosaeta是專性乙酸營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷古菌，可利用多種代謝底物產(chǎn)生甲烷（如乙酸、氫氣∕二氧化碳），適于生活在高負(fù)荷和中性pH 條件下［4］。在啟動(dòng)時(shí)期不同HRT 下，Methanosaeta的豐度沿著反應(yīng)器的高度被量化，在前三個(gè)HRT 下，其最高值都位于反應(yīng)器中下部，只有在啟動(dòng)末期沿反應(yīng)器高度自下而上呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。乙酸型產(chǎn)甲烷古菌的生長(zhǎng)與顆粒生物膜密切相關(guān)，啟動(dòng)末期底部最高，說(shuō)明大部分顆粒污泥都集中在底層，若顆粒退化，其生物豐度也會(huì)降低［5］。

啟動(dòng)初期和末期，擬桿菌（Bacteroidetes）都集中在中上部和頂部，啟動(dòng)中期會(huì)有一段時(shí)間集中在反應(yīng)器底部（如HRT2）。Bacteroidetes的擬桿菌目（Bacteroidales）在目水平上是優(yōu)勢(shì)菌，在UASB反應(yīng)器不同高度的豐度變化趨勢(shì)和Bacteroidetes一致，只有在啟動(dòng)中后期依然保持底部較高水平，表明Bacteroidales在降解反應(yīng)器有機(jī)底物（如蛋白質(zhì)和多糖）中起到了非常關(guān)鍵的作用，可為甲烷的產(chǎn)生提供更多的底物［6］。

有研究表明變形菌門（Proteobacteria）在去除有機(jī)物中起了非常重要的作用［7-8］，主要參與消耗乙酸、丙酸和丁酸等有機(jī)酸，若Proteobacteria量少，有機(jī)酸產(chǎn)生量可能也會(huì)少。在啟動(dòng)初期，Proteobacteria主要在反應(yīng)器頂部聚集，在中后期直至末期，反應(yīng)器不同高度的Proteobacteria都沒(méi)有較明顯的差異，表明厭氧反應(yīng)器在啟動(dòng)初期產(chǎn)生有機(jī)酸的位置可能是在反應(yīng)器頂部。在啟動(dòng)中后期，Proteobacteria的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于啟動(dòng)的其他時(shí)期，我們猜想有可能在啟動(dòng)中后期會(huì)有一段產(chǎn)酸的抑制時(shí)期。Proteobacteria在屬水平上的互養(yǎng)菌屬（Syntrophus）是啟動(dòng)期反應(yīng)器的優(yōu)勢(shì)菌，對(duì)產(chǎn)甲烷能力的提升有重要作用。有研究表明，Syntrophus是具有直接種間電子傳遞能力的細(xì)菌之一，可以提升厭氧反應(yīng)器中有機(jī)物轉(zhuǎn)化成甲烷的速率［9］。在反應(yīng)器啟動(dòng)初期和末期，Syntrophus集中在底部，沿反應(yīng)器高度增加量逐漸減少，表明啟動(dòng)初期和末期主要是底部的Syntrophus在進(jìn)行種間電子傳遞，從而提高產(chǎn)甲烷的速率。啟動(dòng)中期，不僅反應(yīng)器不同高度Syntrophus的量沒(méi)有明顯差異，而且Syntrophus的總量也低于啟動(dòng)前期和后期，表明啟動(dòng)中期Syntrophus產(chǎn)甲烷速率可能有所降低，這也與本試驗(yàn)中啟動(dòng)中期（HRT2）產(chǎn)氣能力下降一致。但啟動(dòng)中后期產(chǎn)甲烷能力是非常高的，表明在啟動(dòng)中后期對(duì)產(chǎn)甲烷能力起主要作用的菌不是Syntrophus，而是其他細(xì)菌或（和）古菌。

厚壁菌門（Fimicutes）是一種細(xì)胞壁較厚的細(xì)菌，其肽聚糖可以通過(guò)產(chǎn)生內(nèi)孢子抵抗極端環(huán)境，因此對(duì)高有機(jī)負(fù)荷環(huán)境具有高耐受性［10］。豬場(chǎng)廢水恰好屬于高有機(jī)負(fù)荷的廢水，因此，F(xiàn)imicutes屬于反應(yīng)器中的第三優(yōu)勢(shì)菌。Fimicutes在反應(yīng)器不同高度的量會(huì)隨著啟動(dòng)階段的不同表現(xiàn)出一定的差異。在啟動(dòng)初期和末期，反應(yīng)器不同高度的Fimicutes量沒(méi)有明顯差異，但啟動(dòng)中后期在反應(yīng)器頂部，F(xiàn)imicutes的量增加。有研究證明Fimicutes的變化趨勢(shì)與甲烷產(chǎn)量呈現(xiàn)正相關(guān)，因其極有可能會(huì)降解蛋白質(zhì)、多糖或腐殖酸［6］。本試驗(yàn)啟動(dòng)中后期（HRT3），F(xiàn)imicutes的量高于前面幾個(gè)階段，和產(chǎn)甲烷量最多一致，表明此階段Fimicutes最重要的一個(gè)功能有可能就是產(chǎn)甲烷。但是微生物群體之間存在協(xié)同作用，若其中一些群體的功能失效，另外一些群體將補(bǔ)償該特定功能（代償性）［11］。因此，不排除Fimicutes有可能此時(shí)在補(bǔ)償某些產(chǎn)甲烷菌群的功能。

綠彎菌門（Chloroflexi）具有產(chǎn)生水解酶的功能，主要降解的是可溶性微生物產(chǎn)物，如可溶性蛋白和可溶性多糖等。在UASB 反應(yīng)器中，Chloroflexi基本都集中在反應(yīng)器底部，只有在啟動(dòng)中期會(huì)有一段時(shí)間在反應(yīng)器中上部，表明反應(yīng)器中可溶性的微生物產(chǎn)物大部分位于反應(yīng)器底部，顆粒污泥也是大部分位于反應(yīng)器底部。陰溝單胞菌門（WWE1）是Chouari 在2005 年從城市污水處理廠發(fā)現(xiàn)并命名為候補(bǔ)門，后被重新命名為“Cloacimonetes”，其廣泛存在于豬的消化道以及厭氧反應(yīng)器中［12］。本研究中WWE1 在啟動(dòng)初期和末期，反應(yīng)器底部的量高于中部和頂部，但這兩段啟動(dòng)時(shí)期的總量都小于啟動(dòng)中期。而啟動(dòng)中期反應(yīng)器不同高度的豐度有差異，啟動(dòng)的中前期，WWE1 主要聚集在反應(yīng)器中下部，頂部較少，啟動(dòng)中后期，反應(yīng)器不同高度的WWE1 量沒(méi)有明顯變化，但總量高于其余啟動(dòng)時(shí)期。因此，推測(cè)WWE1可能是啟動(dòng)中后期提升產(chǎn)甲烷能力的主要細(xì)菌。

3 結(jié)論

3.1 采用設(shè)計(jì)的UASB 處理豬場(chǎng)廢水，容積負(fù)荷從0.16 kgCOD∕m3·d 升高到1.4 kgCOD∕m3·d，設(shè)計(jì)的反應(yīng)器可處理6 000 mg∕L COD濃度的糞水，產(chǎn)氣率最高能達(dá)到0.9 L∕L·d左右，COD去除率最高為89.58%。

3.2 UASB 反應(yīng)器在啟動(dòng)時(shí)期的不同高度，優(yōu)勢(shì)菌種類沒(méi)有變化，在門水平上為屬于古菌的廣古菌門和屬于細(xì)菌的擬桿菌、變形菌門、厚壁菌門、綠彎菌門、陰溝單胞菌門，屬水平上為甲烷絲菌屬、擬桿菌目和互養(yǎng)菌屬。但優(yōu)勢(shì)菌會(huì)有量的差異：廣古菌門、綠彎菌門和陰溝單胞菌門主要位于反應(yīng)器底部和中下部；擬桿菌、變形菌門、厚壁菌門主要位于反應(yīng)器中部和上部；甲烷絲菌屬和互養(yǎng)菌屬主要位于反應(yīng)器底部和中下部，擬桿菌目主要位于反應(yīng)器中部和上部。