廖嘉明, 李春梅, 張石虎, 李布野, 歐陽昆唏*, 陳曉陽*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院, 廣州 510642; 2.五華縣林業(yè)局, 廣東 梅州 514400)

基因編輯技術(shù)指能夠靶向編輯生物體內(nèi)的目標(biāo)基因，實(shí)現(xiàn)對特定DNA片段的刪除、插入、定點(diǎn)突變等的技術(shù)。與傳統(tǒng)的類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases, TALEN)[1]和鋅指核酸酶(zinc finger nuclease, ZFN)[2]基因編輯技術(shù)相比，成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)(clustered regularly interspaced short palindromic repeat, CRISPR)基因組編輯系統(tǒng)具有突變效率高、準(zhǔn)確度高、載體構(gòu)建簡單等特點(diǎn)，成為全球最為流行的基因編輯技術(shù)，獲得了2020年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)[3]。CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)極大地促進(jìn)了生命科學(xué)的發(fā)展。除了用于疾病治療、藥物研發(fā)、基因功能研究，該技術(shù)在農(nóng)作物的遺傳改良領(lǐng)域也起到重要作用。

本文介紹了CRISPR/Cas系統(tǒng)的作用機(jī)理以及其在作物和林木遺傳育種中的研究進(jìn)展和應(yīng)用，進(jìn)一步就該系統(tǒng)在植物遺傳育種應(yīng)用中的技術(shù)優(yōu)化進(jìn)行了探討，并對其發(fā)展前景進(jìn)行了展望。

1 CRISPR/Cas系統(tǒng)

1.1 CRISPR/Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)

1987年，Ishino等[4]在大腸桿菌iap基因的3′端側(cè)翼區(qū)發(fā)現(xiàn)了一段由高度同源的29個(gè)核苷酸組成的重復(fù)序列，且彼此之間被32個(gè)核苷酸的間隔序列隔開(圖1)。對原核生物基因組序列的分析結(jié)果顯示，在古細(xì)菌和細(xì)菌的基因組中存在25～50 bp長度的短重復(fù)序列，中間間隔著大小相似的獨(dú)特序列[5]。到2002年，將這種特殊的重復(fù)序列結(jié)構(gòu)稱為成簇規(guī)律性間隔的短回文重復(fù)序列(CRISPR)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)在CRISPR序列附近存在一些保守基因，這些基因被命名為Cas基因[6]。2005年，CRISPR中的間隔序列首次被證實(shí)與病毒和細(xì)菌的遺傳物質(zhì)序列具有同源性[7]。這些具有同源性的間隔序列是細(xì)胞受到外源遺傳物質(zhì)入侵后產(chǎn)生的痕跡，以使它們產(chǎn)生適應(yīng)性免疫，因此，推測CRISPR序列在細(xì)菌基因組中的廣泛存在可能對外來DNA的入侵起防御和保護(hù)作用[8]。Barrangou等[9]通過細(xì)菌和噬菌體的相關(guān)試驗(yàn)證明，細(xì)菌中CRISPR與相關(guān)的Cas基因一起對噬菌體產(chǎn)生抗性，表明CRISPR/Cas系統(tǒng)參與了細(xì)菌適應(yīng)性免疫反應(yīng)，因此，認(rèn)為CRISPR/Cas系統(tǒng)可能被開發(fā)為一種病毒防御機(jī)制系統(tǒng)。之后研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)噬菌體首次入侵宿主細(xì)菌時(shí)，CRISPR/Cas系統(tǒng)同時(shí)裂解噬菌體和質(zhì)粒DNA，整合噬菌體的一段DNA序列到基因組CRISPR位點(diǎn)中，然后表達(dá)CRISPR RNA(crRNA)；當(dāng)噬菌體再次入侵時(shí)，crRNA表達(dá)，Cas蛋白利用crRNAs靶向外源遺傳物質(zhì)干擾噬菌體的入侵[10-12]。也就是說，當(dāng)噬菌體入侵時(shí)，CRISPR/Cas系統(tǒng)的防御保護(hù)作用由RNA介導(dǎo)，是一種獲得性免疫系統(tǒng)，初步驗(yàn)證了CRISPR/Cas系統(tǒng)的生物學(xué)功能。

圖1 大腸桿菌iap基因重復(fù)序列比較[4]

1.2 CRISPR/Cas系統(tǒng)的分類

有一組保守的CRISPR相關(guān)基因與CRISPR的重復(fù)序列和間隔序列相鄰，它們編碼Cas蛋白，不同的Cas蛋白可能參與CRISPR/Cas系統(tǒng)作用的一個(gè)或多個(gè)階段[6]。根據(jù)Cas蛋白的種類及組合的不同可將CRISPR/Cas系統(tǒng)分為三種主要類型：TypeⅠ、TypeⅡ和TypeⅢ，其中Cas1和Cas2蛋白在所有類型中都存在[13-14]。

Type Ⅰ的特征蛋白是一個(gè)大型蛋白Cas3(圖2)，具有單鏈解旋酶和DNase活性以及水解ATP的能力。Cas3將外源DNA作為目標(biāo)，識別并解旋外源DNA的互補(bǔ)鏈，使其與crRNA配對形成R環(huán)結(jié)構(gòu)，再利用核酸酶活性使非互補(bǔ)鏈斷裂。TypeⅡ的特征蛋白是Cas9(圖2)，最典型的Cas9蛋白首次發(fā)現(xiàn)于釀膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)中，該蛋白中至少含有兩個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu)域、一個(gè)類RuvC的核酸酶結(jié)構(gòu)域(N端附近)和一個(gè)HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域[13]。雙鏈RNA結(jié)構(gòu)由反式作用crRNA(trans-activating crRNA，tracrRNA)與crRNA通過堿基互補(bǔ)配對形成，引導(dǎo)CRISPR相關(guān)蛋白Cas9在目標(biāo)DNA中引入雙鏈斷裂，其中核酸酶結(jié)構(gòu)域HNH裂解互補(bǔ)鏈，而類RuvC結(jié)構(gòu)域裂解非互補(bǔ)鏈[13-14]。由于TypeⅡ免疫系統(tǒng)需要的Cas蛋白相對簡單，因此CRISPR/Cas9系統(tǒng)是目前應(yīng)用最普遍的系統(tǒng)。TypeⅢ型Cas蛋白又可分為兩種亞型：TypeⅢ-A和TypeⅢ-B。TypeⅢ-A亞型的靶向是DNA；而TypeⅢ-B亞型的靶向是RNA，主要參與crRNA的成熟以及剪切外源入侵遺傳物質(zhì)[13]，其特征蛋白為Cas10(圖2)。

圖2 Cas3[15]、Cas9[16]、Cas10[17]蛋白主要結(jié)構(gòu)域

1.3 CRISPR/Cas及其衍生系統(tǒng)的作用機(jī)制

1.3.1CRISPR/Cas系統(tǒng) CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為研究最為深入且應(yīng)用最為廣泛的系統(tǒng)，主要由Cas9蛋白、crRNA和tracrRNA三部分組成。首先，tracrRNA和RNaseⅢ對precrRNA(precursor crRNA)進(jìn)行加工得到成熟的crRNA，crRNA與tracrRNA互補(bǔ)配對后引導(dǎo)Cas9蛋白結(jié)合并剪切雙鏈DNA[11]，其中Cas9蛋白通過與目標(biāo)序列3′端的PAM序列(通常為“NGG”)進(jìn)行識別。為了使CRISPR/Cas9系統(tǒng)的使用更加地簡便，研究者將crRNA和tracrRNA合并設(shè)計(jì)成一個(gè)sgRNA(single guide RNA)，經(jīng)驗(yàn)證sgRNA能引導(dǎo)Cas9蛋白切割雙鏈DNA[14-18]。Cas9蛋白與目標(biāo)DNA結(jié)合后，利用核酸內(nèi)切酶活性切割靶序列，產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂(double-strand break，DSB)。而修復(fù)DSB有兩種方式[19]：一種是自然條件下的非同源末端連接(nonhomologous end-joining，NHEJ)方式，修復(fù)概率高，但修復(fù)過程容易出錯(cuò)，如引入個(gè)別堿基的插入、缺失或替換；另一種方式是同源重組修復(fù)(homology-directed repair，HDR)，可以將外源DNA供體片段重組整合到DNA雙鏈斷裂的位置，但在自然條件下出現(xiàn)的概率較低，所以細(xì)胞修復(fù)DSB的方式主要為NHEJ[18](圖3)。這兩種DSB修復(fù)方式在真核生物細(xì)胞中高度保守，因此，在很多物種中均可以進(jìn)行精確的基因編輯[20]。

另一種使用較為廣泛的是CRISPR/Cas12a系統(tǒng)(也稱CRISPR/Cpf1)，能特異性識別5′端連續(xù)2個(gè)或3個(gè)胸腺嘧啶(T)的PAM序列[21]。相較于CRISPR/Cas9系統(tǒng)，CRISPR/Cpf1系統(tǒng)不需tracrRNA參與，僅需在crRNA引導(dǎo)下即可對DNA雙鏈進(jìn)行切割；且該系統(tǒng)中crRNA比sgRNA更短，其蛋白也比Cas9蛋白更小，有助于構(gòu)建裝載量小和多基因編輯的載體[22-23]。

1.3.2CRISPR/Cas衍生系統(tǒng) 科學(xué)家們還開發(fā)出了不依賴DSB的CRISPR/Cas系統(tǒng)，包括堿基編輯器[24]和引導(dǎo)編輯器[25]等在內(nèi)的精準(zhǔn)基因編輯系統(tǒng)。

目前常用的堿基編輯系統(tǒng)主要有胞嘧啶堿基編輯器(cytosine base editor，CBE)和腺嘌呤堿基編輯器(adenine base editor，ABE)(圖3)，這兩類堿基編輯系統(tǒng)主要利用胞嘧啶脫氨酶或腺嘌呤脫氨酶與Cas9缺口酶(nicking Cas9，nCas9)融合，融合蛋白在sgRNA介導(dǎo)下對靶位點(diǎn)進(jìn)行精準(zhǔn)的堿基編輯，最終實(shí)現(xiàn)C·G堿基對向T·A堿基對的轉(zhuǎn)換或A·T堿基對向G·C堿基對的轉(zhuǎn)換。雖然堿基編輯器是可用于進(jìn)行堿基轉(zhuǎn)換的強(qiáng)大工具，但不能用于進(jìn)行堿基顛換、插入或缺失。因此，在植物中尋找可使用的新型基因組工程方法顯得尤為重要。

Anzalone等[25]開發(fā)的引導(dǎo)編輯器(prime editors，PEs)(圖3)能彌補(bǔ)堿基編輯器存在的問題。PEs系統(tǒng)由nSpCas9(H840A)、引導(dǎo)編輯向?qū)NA(prime editing extended guide RNA，pegRNA)和逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV(moloney murine leukemia virus reverse transcriptase)三部分組成。其中，pegRNA是在gRNA序列的3′末端添加引物結(jié)合位點(diǎn)(prime binding sites，PBS)和攜帶編輯信息的逆轉(zhuǎn)錄(reverse transcription，RT)模板。PEs系統(tǒng)是切口酶H840A-逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV融合蛋白，主要在pegRNA介導(dǎo)下進(jìn)行編輯，可在植物基因組的特定位點(diǎn)引入堿基-堿基轉(zhuǎn)換或少量堿基的定點(diǎn)缺失和插入，也可以在沒有供體DNA或雙鏈斷裂的情況下對哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的堿基進(jìn)行編輯，這種編輯器將基因組編輯提升到了一個(gè)新的水平。另外，Lin等[26]對一種引導(dǎo)編輯系統(tǒng)(prime editing system，PPE)進(jìn)行優(yōu)化，通過密碼子、啟動(dòng)子和編輯條件優(yōu)化調(diào)整了啟動(dòng)子編輯器在植物中的應(yīng)用，編輯效率高達(dá)21.8%。盡管PPE系統(tǒng)的效率低于堿基編輯器，但在開展植物育種和功能基因組學(xué)研究中具有巨大的潛力。

圖3 CRISPR/Cas系統(tǒng)及衍生技術(shù)示意圖[23]

2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用

2013年，Li等[27]利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在擬南芥和煙草中進(jìn)行基因精準(zhǔn)編輯，首次在植物基因組中運(yùn)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)且驗(yàn)證了其在植物基因編輯方面的可行性。隨后，研究人員也陸續(xù)在不同植物中開展CRISPR/Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用研究。目前，該系統(tǒng)還處于初始應(yīng)用階段，隨著技術(shù)的不斷完善進(jìn)步，它將會(huì)改變傳統(tǒng)育種方式，在植物性狀改良、加快育種進(jìn)程等方面發(fā)揮重要作用。

2.1 在農(nóng)作物基因編輯中的應(yīng)用

與傳統(tǒng)育種方法相比，CRISPR/Cas系統(tǒng)能快速精準(zhǔn)改良目標(biāo)性狀、顯著縮短育種周期。目前，CRISPR/Cas系統(tǒng)在改良作物產(chǎn)量、品質(zhì)、抗病性和抗除草劑以及基因功能研究中均起到了重要作用。

王加峰等[28]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)靶向突變了調(diào)控水稻千粒重的TGW6基因，結(jié)果表明，T1代純合缺失突變體千粒重顯著增加。Li等[29]以中花11作為轉(zhuǎn)化材料定點(diǎn)敲除了Gn1a、DEP1、GS3及IPA1基因，T2代純合缺失突變體植株的籽粒數(shù)目及籽粒長度顯著增加。改變細(xì)胞分裂素穩(wěn)態(tài)可提高谷物產(chǎn)量，Wang等[30]和Zhang等[31]對小麥、水稻中的細(xì)胞分裂素激活酶通過編輯或敲除編碼細(xì)胞分裂素氧化酶/脫氫酶(CKX)基因均得到了高產(chǎn)的株系[30-31]。

研究者利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對作物的品質(zhì)進(jìn)行改良，如對水稻的香氣基因OsBADH2進(jìn)行編輯，獲得了香米突變體[32]，加快了香稻的育種進(jìn)程；山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所小麥分子育種創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)分別對與面粉吸水率密切相關(guān)的Pinb基因、與淀粉品質(zhì)相關(guān)的Waxy基因、與面團(tuán)褐變相關(guān)的Ppo基因以及面粉黃色素含量相關(guān)的Psy基因進(jìn)行精準(zhǔn)打靶，獲得了一批具有新優(yōu)異等位基因的小麥新資源[33]。Waltz[34]定向突變了雙孢菇(Agaricusbisporus)的多酚氧化酶基因PPO，發(fā)現(xiàn)突變體材料的多酚氧化酶活性降低了30%，抗褐變能力得到顯著提高。此外，該系統(tǒng)還有助于培育富含類胡蘿卜素[35]和γ-氨基丁酸[36]、減少植酸[37]和高油酸含量[38]的優(yōu)質(zhì)作物。

利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)修飾相關(guān)基因可獲得抗性植株。袁隆平團(tuán)隊(duì)與Tang等[39]通過靶向敲除水稻中與鎘離子吸收和積累相關(guān)的基因，得到了對抗鎘毒害的水稻品種。試驗(yàn)表明，對水稻中的SWEET11、SWEET13和SWEET14基因的啟動(dòng)子進(jìn)行突變，可產(chǎn)生具有廣譜抗性的水稻品系[40]。敲除植物敏感基因也是產(chǎn)生廣譜病毒抗性的有效途徑，如敲除黃瓜eIF4E基因，可以使黃瓜獲得對馬鈴薯病毒的廣譜抗性[41]。

編輯除草劑靶向基因也可以獲得內(nèi)源抗性的作物。Li等[42]以NHEJ修復(fù)方式對水稻EPSPS基因保守區(qū)域兩個(gè)重要氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)置換，T0代即得到了抗草甘膦的水稻突變體；Zhang等[43]通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)誘導(dǎo)小麥A1992V取代ACCase獲得了抗喹禾靈小麥。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)可同時(shí)對多個(gè)基因進(jìn)行編輯，因此，基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的多基因編輯技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，Shan等[44]運(yùn)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對水稻的四個(gè)基因進(jìn)行定點(diǎn)編輯，得到了白化且矮化的T1代植株。CRISPR/Cas9系統(tǒng)編碼優(yōu)化RNA時(shí)也可以同時(shí)在多個(gè)位點(diǎn)產(chǎn)生突變，且這種突變能夠正常遺傳給后代[45]；Ma等[20]同時(shí)對水稻中7個(gè)基因進(jìn)行敲除；Yu等[46]通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)同時(shí)對擬南芥中多個(gè)基因編輯得到了傳統(tǒng)雜交難以得到的三基因突變體。由此可見，多基因編輯技術(shù)尤其適用于家族成員多或功能冗余的基因功能研究。

2.2 在林木基因編輯中的應(yīng)用

與農(nóng)作物相比，傳統(tǒng)林木育種具有育種周期長、遺傳背景復(fù)雜等生物學(xué)特點(diǎn)，導(dǎo)致林木遺傳改良的進(jìn)程緩慢。將CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用于林木改良極大地促進(jìn)了林木基因組功能和遺傳改良的研究進(jìn)程。

楊樹作為林木中的模式植物，CRISPR/Cas9系統(tǒng)在楊樹功能基因組研究和基因工程育種中都有著廣泛的應(yīng)用。2015年，F(xiàn)an等[47]利用該系統(tǒng)靶向敲除了毛白楊(Populustomentosa)的八氫番茄紅素脫氫酶基因(phytoenedesaturase，PDS)獲得白化表型植株。同年，Zhou等[48]利用該系統(tǒng)成功靶向編輯種間雜種銀灰楊(P.tremula×alba)中4CL1和4CL2基因，突變體莖稈呈紅褐色，且發(fā)現(xiàn)SNP接近或位于PAM位點(diǎn)內(nèi)時(shí)能完全抑制基因打靶作用。對參與調(diào)控楊樹側(cè)芽發(fā)生的直系同源基因BRC1和BRC2進(jìn)行靶向敲除時(shí)，BRC2基因突變體的分支數(shù)顯著多于野生型，且在莖節(jié)處產(chǎn)生異位葉片；BRC1基因突變體的分支數(shù)也明顯增加；由此表明，BRC1和BRC2參與調(diào)控楊樹側(cè)芽發(fā)生，且有著不同的作用機(jī)制和表達(dá)模式[49]。由CRISPR/Cas9介導(dǎo)產(chǎn)生的楊樹NST/SND同源基因四重突變體的木質(zhì)部和韌皮部部分細(xì)胞缺少次生細(xì)胞壁，包括木纖維細(xì)胞、木射線薄壁細(xì)胞和韌皮纖維細(xì)胞，導(dǎo)致該突變體幾乎無法直立，由此說明NST/SND同源基因參與楊樹次生壁的形成[50]。綜上所述，CRISPR/Cas9系統(tǒng)可快速高效地敲除兩個(gè)以上內(nèi)源基因，從而獲得多重突變體楊樹株系，為開展基因功能研究和楊樹遺傳改良奠定了基礎(chǔ)。

近年來，CRISPR/Cas9系統(tǒng)被用于林木抗病性、生長發(fā)育和果實(shí)品質(zhì)等特性的改良[51]。在柑橘屬(Citrusspp.)，應(yīng)用CRISPR/Cas9定向編輯柑橘中調(diào)控潰瘍病感病反應(yīng)的關(guān)鍵基因CsLOB1及其啟動(dòng)子序列，提高了柑橘對潰瘍病的抗性[52]。Charrier等[53]首次利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)定向突變梨樹的PcTFL1.1基因，獲得了花期提前的突變體植株。Chang等[54]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)同時(shí)對石榴中的兩個(gè)UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶基因PgUGT進(jìn)行編輯，突變體安石榴苷的含量降低了40%。

咖啡、可可和橡膠樹的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)也相繼被建立。利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)靶向編輯咖啡樹CcPDS基因，得到表型黃化、弱小的純合突變體[55]?？煽珊诠】稍斐煽煽纱竺娣e減產(chǎn)，研究表明，降低可可TcNPR3基因的表達(dá)有利于提高可可對疫霉菌的抗性[56]，從而降低黑果病的得病率。Fister等[57]發(fā)現(xiàn)在可可離體葉片上注射含CRISPR/Cas9基因編輯載體的農(nóng)桿菌，48 h后接種疫霉菌后，實(shí)驗(yàn)組的病斑面積較對照組顯著減小。Fan等[58]率先建立了橡膠樹CRISPR/Cas9系統(tǒng)，直接傳遞CRISPR/Cas9核糖核蛋白(ribose nucleoprotein，RNPs)在橡膠樹中靶向誘變，以橡膠樹FT和TFL基因?yàn)榘悬c(diǎn)，設(shè)計(jì)了5種sgRNA，利用PEG介導(dǎo)法將含有Cas9-sgRNA重組質(zhì)粒導(dǎo)入橡膠的原生質(zhì)體中，靶向突變頻率為3.74%～20.11%。

3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的優(yōu)化與發(fā)展

盡管CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)發(fā)展迅速，且得到了廣泛應(yīng)用，但目前，該系統(tǒng)一些技術(shù)方面的問題仍有待進(jìn)一步改進(jìn)和探討：如脫靶現(xiàn)象、PAM區(qū)的限制性、編輯效率以及生物安全監(jiān)管等。脫靶現(xiàn)象嚴(yán)重限制了該技術(shù)的應(yīng)用。研究表明，通過使用合適的Cas蛋白或提高sgRNA序列的特異性可降低或者消除脫靶現(xiàn)象[59]；靶點(diǎn)GC含量在50%～70%時(shí)打靶效率較高[20]。有效拓展CRISPR系統(tǒng)PAM位點(diǎn)范圍是該技術(shù)在育種中廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵所在。由于Cas9需要靶位點(diǎn)NGG的PAM序列，限制了基因組中靶位點(diǎn)選擇的自由度，為解決此問題，開發(fā)出了可增強(qiáng)基因組編輯范圍的新型CRISPR/Cas9工具。雖然來自釀膿鏈球菌的Cas9(SpCas9)使用最廣泛，但是僅極少數(shù)DNA序列符合靶位點(diǎn)旁邊存在兩個(gè)G堿基這一特殊要求。Chatterjee等[60]從犬鏈球菌(Streptococcuscanis)中鑒定出Cas9(ScCas9)，發(fā)現(xiàn)ScCas9具有更廣泛地靶向DNA序列的能力；Cas9酶將靶向位置從最初基因組上的10%位點(diǎn)擴(kuò)大到將近50%；并進(jìn)一步設(shè)計(jì)出具有增強(qiáng)基因組編輯能力的新蛋白，極大地拓寬了DNA序列[61-62]。人工改造的變體xCas9、SpCas9-NG[63]和SpRY[64]也極大地?cái)U(kuò)展了CRISPR/Cas系統(tǒng)的編輯范圍。提高同源重組(homologous recombination，HDR)效率也至關(guān)重要，Aird等[65]將供體DNA與Cas9/gRNA核糖核蛋白復(fù)合體連接，使DSB處供體DNA的濃度增加，從而提高Cas9介導(dǎo)的同源重組修復(fù)效率。

相較于草本植物和農(nóng)作物，木本植物中CRISPR/Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用尚處于基因編輯體系建立的初步階段。除上述幾種普遍存在的問題外，林木自身特性也存在一些限制：①木本植物sgRNA在線設(shè)計(jì)軟件數(shù)據(jù)庫較少，因此，建立針對木本植物的sgRNA設(shè)計(jì)和檢測脫靶效應(yīng)的公共網(wǎng)絡(luò)平臺，收集并建立更多樹種的基因組數(shù)據(jù)庫能顯著提高CRISPR/Cas9系統(tǒng)在林木林木遺傳育種的應(yīng)用效率[66]；②傳統(tǒng)遺傳轉(zhuǎn)化方法常伴有外源基因的插入，生長周期較短的植物可通過后代分離群體獲得無外源基因污染的轉(zhuǎn)化植株，但木本植物普遍采用無性繁殖方式且生長周期較長，其突變體后代通常帶有外源DNA的污染，由此可能會(huì)產(chǎn)生基因污染等生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)問題。向細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入Cas9/sgRNA核糖核蛋白復(fù)合物可解決外源DNA污染問題，但多數(shù)木本植物的組培再生體系或穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系還未完全完善，極大地限制了CRISPR系統(tǒng)在林木中的應(yīng)用，因此，建立和完善木本植物原生質(zhì)體制備及再生體系將促進(jìn)基因編輯育種在林木中的應(yīng)用[66]。

CRISPR/Cas系統(tǒng)作為一項(xiàng)變革性的新興技術(shù)，隨著基因編輯技術(shù)的普及可能導(dǎo)致生物安全監(jiān)管困難等問題。各國都沒有現(xiàn)成的監(jiān)管經(jīng)驗(yàn)，在技術(shù)監(jiān)管和風(fēng)險(xiǎn)防控上均保持較高的謹(jǐn)慎態(tài)度。近期開發(fā)的一種外源成分檢測器(foreign element detector，F(xiàn)ED)可在外源成分信息未知的情況下對全基因組重測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，可精確鑒定出外源成分的片段長度及在基因組上的插入位置，為全球基因組編輯產(chǎn)品的應(yīng)用和安全監(jiān)管提供了一個(gè)重要工具平臺[67]。我國基因編輯技術(shù)的研發(fā)雖然居全球領(lǐng)先地位，但仍然尚未出臺基因編輯產(chǎn)品的相關(guān)管理政策，其相關(guān)產(chǎn)業(yè)面臨技術(shù)領(lǐng)先、管理滯后、應(yīng)用空白的局面。該平臺的建立有望為我國基因編輯產(chǎn)品的開發(fā)和應(yīng)用提供安全保障。

4 展望

CRISPR/Cas系統(tǒng)是一種功能強(qiáng)大的基因組編輯系統(tǒng)，它對基因功能研究以及作物性狀的遺傳改良具有重要意義，顯著促進(jìn)了植物科學(xué)的快速發(fā)展。雖然目前該編輯系統(tǒng)還存在很多不足，但其相較于傳統(tǒng)育種的優(yōu)勢顯而易見，尤其在林木育種方面，將極大地縮短林木育種周期，對林木基因功能研究也起到巨大的推動(dòng)作用。經(jīng)過優(yōu)化和改良的CRISPR/Cas基因編輯系統(tǒng)將成為培育植物新品種的主要手段之一，在植物遺傳改良方面具有廣闊的發(fā)展和應(yīng)用前景。