張建珍，柴林，史學(xué)凱 ，高璐 ，范云鶴

（1.山西大學(xué) 應(yīng)用生物學(xué)研究所，山西 太原 030006；2.山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006）

0 RNA干擾技術(shù)簡介

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是一種廣泛存在于真核生物的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象，其原理是雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）可引起生物體內(nèi)同源序列mRNA特異性地降解。RNAi現(xiàn)象最早由NAPOLI和JORGENSEN在研究矮牽牛（Petuniahybrida）的花色時(shí)報(bào)道：插入強(qiáng)啟動(dòng)子后，本應(yīng)高表達(dá)的查耳酮合成酶（chalcone synthase，CHS）基因受到抑制，致使花色變淺，并稱之為共抑制（cosuppression）［1］。1991年 FIRE 等向秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditiselegans）注射unc-22的反義鏈RNA（antisense RNA，asRNA）后，引發(fā)肌肉抽搐的表型，證明asRNA可以抑制基因的表達(dá)［2］。之后，GUO和KEMPHUES研究par-1基因在線蟲胚胎中的功能時(shí)發(fā)現(xiàn)，注射反義鏈RNA，可導(dǎo)致胚胎發(fā)育停滯，而作為陰性對(duì)照的正義RNA（sense RNA）也出現(xiàn)了相類似的表型，導(dǎo)致par-1mRNA的降解［3］。直到1998年，F(xiàn)IRE等通過嚴(yán)格制備并純化unc-22基因的正義ssRNA、反義ssRNA和dsRNA，并等量注射入秀麗隱桿線蟲性腺后，發(fā)現(xiàn)dsRNA可引起基因沉默，而ssRNA導(dǎo)入線蟲體內(nèi)則很快被降解［4］。以上的發(fā)現(xiàn)促進(jìn)了RNA干擾技術(shù)的快速發(fā)展，為廣泛研究生物的基因功能提供了高效便捷的技術(shù)途徑。

小干擾RNA（small interference RNA，siRNA）是一類長度為21 nt～23 nt的雙鏈RNA，根據(jù)其來源可分為內(nèi)源性siRNA（endo-siRNA）和外源性siRNA（exo-siRNA）［4］。外源 dsRNA 進(jìn)入生物體后，會(huì)被自身的核心酶系統(tǒng)降解為外源性siRNA進(jìn)而發(fā)揮作用。siRNA通路的作用機(jī)制為：外源或內(nèi)源產(chǎn)生的dsRNA在Dicer2酶的作用下，切割為長度為21 nt～23 nt、5′端含有一個(gè)磷酸基團(tuán)、3′端含有一個(gè)羥基且突出2 nt懸垂的siRNA；隨后siRNA在Dicer2及其協(xié)助蛋白R(shí)2D2的幫助下，將與siRNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（siRNA-induced silencing complex，siRISC）結(jié)合［5］；隨即，其正義鏈被降解，激活后的RISC在反義鏈的引導(dǎo)下，通過堿基互補(bǔ)配對(duì)原則識(shí)別靶標(biāo)mRNA，由Agonaute2（AGO2）切割與靶標(biāo)mRNA堿基互補(bǔ)序列，從而導(dǎo)致靶基因快速和持續(xù)性沉默［6］。

RNAi技術(shù)由于其高效性和特異性，在許多生物，特別是非模式生物中得到了廣泛應(yīng)用。KENNERDELL和CARTHEW（1998）首次將dsRNA應(yīng)用于黑腹果蠅（Drosophilamelanogaster）胚胎frizzled基因功能研究，之后，RNAi逐漸成為研究基因功能的強(qiáng)有力工具。近年來，RNAi技術(shù)在害蟲防治方面也呈現(xiàn)出巨大潛力。如2007年美國孟山都公司研究人員在玉米中表達(dá)可干擾玉米根螢葉甲（Diabroticavirgiferavirgifera）V-ATPaseA基因的dsRNA，將其喂食玉米根螢葉甲后，導(dǎo)致幼蟲發(fā)育異常并死亡［7］。隨后該公司研發(fā)表達(dá)dsRNA的轉(zhuǎn)基因玉米于2017年獲得美國FDA批準(zhǔn)。因此，RNAi技術(shù)有望成為害蟲防控領(lǐng)域的有效手段。

1 dsRNA進(jìn)入蟲體發(fā)揮作用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)

外源dsRNA從進(jìn)入蟲體到發(fā)揮RNAi作用需要經(jīng)過幾個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，包括dsRNA的穩(wěn)定性、dsRNA在細(xì)胞內(nèi)的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和逃逸以及dsRNA被核心酶系統(tǒng)加工為siRNA的效率。這些關(guān)鍵環(huán)節(jié)將會(huì)影響昆蟲的RNA干擾效率。

1.1 dsRNA的穩(wěn)定性

在RNAi過程中，通過注射法或飼喂法導(dǎo)入蟲體的dsRNA，首先存在于血淋巴液或腸液中，隨后被血腔組織細(xì)胞或腸上皮細(xì)胞吸收。越來越多的證據(jù)表明dsRNA在進(jìn)入細(xì)胞前保持完整性是保證RNAi效率的關(guān)鍵因素之一，而核酸降解酶（dsRN-ases）是最為關(guān)鍵的作用因子。大量研究表明，昆蟲中腸特異性的dsRNases對(duì)RNAi效率具有顯著的影響，通過RNAi抑制馬鈴薯甲蟲（Leptinotarsadecemlineata），沙漠蝗（Schistocercagregaria）和煙草天蛾（Manducasexta）等昆蟲dsRNases的表達(dá)后，能夠顯著降低dsRNA的降解，從而提升dsRNA在昆蟲體內(nèi)的穩(wěn)定性和持續(xù)性，增強(qiáng)RNAi效應(yīng)［8-10］。本課題組成功解析了飛蝗（Locustamigratoria）飼喂dsRNA干擾無效的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)LmdsRNase2在飛蝗中腸高表達(dá)，隨后分泌到中腸液中，在pH 6～10的胞外環(huán)境條件下可快速降解dsRNA，破壞其完整性，從而導(dǎo)致RNA干擾無效。對(duì)血淋巴特異表達(dá)的核酸酶進(jìn)行研究表明，飛蝗dsRNases受血淋巴液或腸液pH條件的限制，最終影響RNAi的效率［11-12］。

圖1 siRNA通路示意圖Fig.1 Diagrammatic sketch of siRNA pathway

1.2 dsRNA的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和逃逸

環(huán)境中的dsRNA能否吸收進(jìn)入昆蟲細(xì)胞及能否從內(nèi)體（Endosome）成功逃逸，是決定RNAi效率的第二個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。研究表明，外源dsRNA主要通過跨膜通道蛋白SID介導(dǎo)的吸收和細(xì)胞內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。2002年，Winston等首次在秀麗隱桿線蟲（C.elegans）中發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)性 RNAi缺陷基因 1（systemic RNA interference defective 1，SID-1）參 與dsRNA的吸收［13］。隨后，人們發(fā)現(xiàn)部分昆蟲中也存在SID-1同源基因，然而該基因并不是吸收dsRNA所必需的。已有研究表明沙漠蝗和赤擬谷盜（Triboliumcastaneum）均具有SID-1基因，但沉默該基因后并不影響RNAi效率，說明SID-1并不參與上述昆蟲的RNAi。2006年，ULVILA等首次發(fā)現(xiàn)dsRNA通過網(wǎng)格蛋白依賴的內(nèi)吞途徑進(jìn)入黑腹果蠅（D.melanogaster）S2 細(xì)胞［14］。自此，dsRNA 通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞的機(jī)制日益受到關(guān)注。多種內(nèi)吞途徑參與核酸的吸收，包括網(wǎng)格蛋白（Clathrin）介導(dǎo)的內(nèi)吞、小窩/脂筏介導(dǎo)的內(nèi)吞、大型胞飲依賴的內(nèi)吞、吞噬作用依賴的內(nèi)吞等，由于載體的多樣性導(dǎo)致內(nèi)吞途徑有所差異。研究發(fā)現(xiàn)，沙漠蝗、赤擬谷盜和馬鈴薯甲蟲等昆蟲均可通過網(wǎng)格蛋白依賴的內(nèi)吞途徑吸收dsRNA［15］。GILLET等報(bào)道，dsRNA可依賴大型胞飲途徑進(jìn)入棉鈴象甲（Anthonomusgrandis）中腸細(xì)胞［16］；其他類型的胞吞途徑是否參與昆蟲細(xì)胞吸收dsRNA尚未見報(bào)道。當(dāng)外源dsRNA進(jìn)入細(xì)胞后，dsRNA可快速地進(jìn)入早期內(nèi)體中（Early endosome），在Rab等蛋白的參與下轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入晚期內(nèi)體（Late endosome），晚期內(nèi)體與溶酶體（Lysosome）發(fā)生融合，并被溶酶體降解。dsRNA吸收進(jìn)入細(xì)胞后能否在早期內(nèi)體和晚期內(nèi)體成功逃逸與RNAi效率相關(guān)。此外，晚期內(nèi)體的形成和轉(zhuǎn)運(yùn)也會(huì)影響昆蟲RNAi效率?？朔@些dsRNA逃逸的障礙，可提高RNA干擾的效率。

1.3 RNAi核心酶系統(tǒng)

從內(nèi)體成功逃逸的dsRNA被RNAi核心酶系統(tǒng)加工為siRNA的效率，是決定RNAi的第三個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。RNAi核心酶主要包括Dicer與Argonaute，首先，dsRNA被Dicer剪切為siRNA，之后，其反義鏈與Argonaute蛋白組裝成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex，RISC），降解目標(biāo)mRNA［17］。研究發(fā)現(xiàn)，不同昆蟲RNAi途徑關(guān)鍵因子的數(shù)目及表達(dá)豐度存在差異，這與RNAi效率密切相關(guān)。2012年，WYNANT等發(fā)現(xiàn)沙漠蝗生殖系統(tǒng)微弱的RNAi與核心酶基因Dicer2和Argonaute2在精巢和卵巢中的低表達(dá)密切相關(guān)［18］；2016年，YOON等在馬鈴薯甲蟲中發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)Dicer2（Dicer2a和Dicer2b）基因，這一發(fā)現(xiàn)可解釋馬鈴薯甲蟲相較其他昆蟲物種對(duì)RNAi更為敏感的原因［15］。2018年，YOON等發(fā)現(xiàn)在鞘翅目昆蟲中存在一種特有的Staufen蛋白，稱為StaufenC，其在馬鈴薯甲蟲中參與dsRNA的剪切過程［19］?；诖耍ㄟ^進(jìn)一步研究RNAi核心酶基因及鑒定參與昆蟲siRNA途徑關(guān)鍵因子，可以更加深入地闡釋不同昆蟲RNAi效率的差異機(jī)制，從而實(shí)現(xiàn)RNAi技術(shù)在害蟲防控中的高效應(yīng)用。dsRNA在蟲體發(fā)揮作用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)見圖2。

圖2 dsRNA在蟲體中發(fā)揮作用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)Fig.2 Key steps for the roles played by dsRNA in insects

2 RNA干擾技術(shù)在害蟲防治中的應(yīng)用

2.1 RNA干擾用于害蟲防治的優(yōu)勢(shì)

目前防治害蟲主要采用傳統(tǒng)的農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治、物理防治和生物防治等方法。農(nóng)業(yè)防治主要是通過利用耕作栽培技術(shù)的改善，控制害蟲種群數(shù)量?；瘜W(xué)防治是利用馬拉硫磷、西維因和溴氰菊酯等化學(xué)農(nóng)藥防治害蟲。物理防治主要是粘板誘殺、人工或誘蟲燈捕捉害蟲等。生物防治主要是利用瓢蟲、寄生蜂等天敵進(jìn)行害蟲防治。然而傳統(tǒng)的害蟲防治方法面臨如下問題：1）害蟲對(duì)常用化學(xué)殺蟲劑產(chǎn)生抗藥性，農(nóng)藥殘留導(dǎo)致環(huán)境污染，防治成本提高，并造成嚴(yán)重的生物安全問題；2）傳統(tǒng)的農(nóng)業(yè)防治、物理防治和生物防治起效慢，殺蟲效率低。

RNAi作為新型的害蟲防控技術(shù)［20］具有許多傳統(tǒng)方法無法比擬的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)：1）特異性：可通過選擇dsRNA序列區(qū)域，針對(duì)性地降解靶標(biāo)基因的mRNA；2）廣譜性：目前已在鞘翅目、直翅目、膜翅目、半翅目、雙翅目和鱗翅目等多種重要農(nóng)業(yè)害蟲中開展了RNA干擾技術(shù)研究，均取得良好的防治效果；3）高效性：dsRNA介導(dǎo)的RNAi在生物體中以催化放大的方式進(jìn)行，少量的dsRNA就能有效地抑制靶基因的表達(dá)；4）系統(tǒng)性：RNAi效應(yīng)可以在害蟲全身甚至在世代間傳遞，可明顯提高RNA干擾效率［21］；5）環(huán)境安全性：殘留的dsRNA在自然界極易降解，無殘留，對(duì)環(huán)境無毒無害，相對(duì)安全。國際上普遍認(rèn)為RNAi技術(shù)在害蟲防治中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，可為農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供新路徑。

2.2 RNA干擾技術(shù)用于害蟲防治的關(guān)鍵因素

RNAi作為新型的害蟲防控技術(shù)，靶標(biāo)基因的篩選以及將dsRNA高效遞送至靶標(biāo)生物是其規(guī)?；瘧?yīng)用的關(guān)鍵因素。

2.2.1 靶標(biāo)基因的選擇

合適的靶標(biāo)基因是RNAi防治技術(shù)成功應(yīng)用的關(guān)鍵。與昆蟲生長發(fā)育及生存密切相關(guān)的功能基因是RNAi防治靶標(biāo)基因的首選，通過設(shè)計(jì)基因特異的dsRNA片段，以達(dá)到高效和無脫靶風(fēng)險(xiǎn)的害蟲防治效果。目前研究較多的靶基因可分為：①昆蟲特有的靶標(biāo)基因，如本課題組長期研究的幾丁質(zhì)酶基因，這類基因特異性強(qiáng)，安全性高，不會(huì)對(duì)其他非靶標(biāo)生物造成為害；②高效安全的管家基因，如Snf7基因［22］；③與害蟲抗性或免疫相關(guān)的基因，如P450酶基因［23］；④與害蟲行為有關(guān)的基因，如與食性、繁殖等有關(guān)基因（卵黃原蛋白受體）等［24］。

2.2.2 高效運(yùn)載體系

將RNAi技術(shù)應(yīng)用于害蟲防治，必須具有高效的運(yùn)載體系。在選定合適的靶基因后，有效導(dǎo)入害蟲體內(nèi)的dsRNA劑量是田間防治害蟲的關(guān)鍵因素。實(shí)驗(yàn)室合成dsRNA通常借助商品化的試劑盒，不僅合成量少且造價(jià)高，且很難滿足田間大規(guī)模應(yīng)用。因此，高效的dsRNA運(yùn)載體系（如植物介導(dǎo)表達(dá)dsRNA、微生物表達(dá)dsRNA和納米材料等）是RNA生物農(nóng)藥研發(fā)和推廣的重要技術(shù)平臺(tái)。表1列舉了高效運(yùn)載體系在RNA生物農(nóng)藥研發(fā)中的成功應(yīng)用。

表1 高效運(yùn)載體系介導(dǎo)的RNAi在害蟲防治中的成功應(yīng)用Table 1 Successful applications of high efficiency delivery system-mediated RNAinterference

2.3 RNA生物農(nóng)藥的研發(fā)

RNAi主要通過雙鏈RNA（dsRNA或siRNA）誘導(dǎo)而沉默靶基因，因此基于RNAi技術(shù)開發(fā)的生物農(nóng)藥，被稱為RNA生物農(nóng)藥。RNA生物農(nóng)藥以dsRNA與基因序列互補(bǔ)為基礎(chǔ)，沉默靶標(biāo)生物目的基因，使昆蟲生長發(fā)育異常，從而達(dá)到防治害蟲的目的。RNA生物農(nóng)藥的研發(fā)主要技術(shù)包括以下幾種。

2.3.1 植物介導(dǎo)表達(dá)dsRNA

通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將害蟲靶標(biāo)基因的dsRNA在植物體中表達(dá)，害蟲取食含有dsRNA的植物組織后生長發(fā)育受阻，生存率下降，種群數(shù)量減少，從而達(dá)到防治目的。已在玉米、棉花、煙草和馬鈴薯等有應(yīng)用報(bào)道（表1），主要針對(duì)鱗翅目、鞘翅目和半翅目等咀嚼式和刺吸式口器害蟲。

2.3.2 微生物表達(dá)dsRNA

常見的微生物表達(dá)dsRNA方法有病毒介導(dǎo)法與工程菌介導(dǎo)法。病毒介導(dǎo)法是利用病毒可侵染昆蟲的特性，在寄主昆蟲體內(nèi)復(fù)制形成靶標(biāo)基因的dsRNA，以獲得RNAi效果。如寄生于家蠶的重組病毒產(chǎn)生靶向BR-C基因的dsRNA使家蠶幼蟲不能化蛹、成蟲形態(tài)缺陷［34］。工程菌介導(dǎo)法是通過構(gòu)建可以表達(dá)靶基因dsRNA的載體，將其轉(zhuǎn)入細(xì)菌和真菌等微生物，獲得大量的dsRNA（表1）。其中缺失RNaseIII的細(xì)菌HT115大量表達(dá)dsRNA應(yīng)用較為廣泛，將其與飼料混合飼喂害蟲，以提高RNA生物農(nóng)藥的防效。

2.3.3 納米材料攜帶dsRNA

納米顆粒攜帶dsRNA是RNA生物農(nóng)藥應(yīng)用的又一種方法，其原理是利用納米顆粒通過靜電作用和范德華力與dsRNA結(jié)合，以提高dsRNA在昆蟲體內(nèi)的穩(wěn)定性，保護(hù)dsRNA不受核酸酶和昆蟲體內(nèi)環(huán)境的影響，從而提高RNAi效率，促進(jìn)RNA生物農(nóng)藥的防效。選擇毒性低且易于被細(xì)胞高效吸收的納米顆粒［38］，可大幅提升dsRNA的應(yīng)用價(jià)值（表1）。

2.3.4 化學(xué)合成dsRNA

實(shí)驗(yàn)室常用T7 RNA聚合酶（T7 RNA polymerase）體外合成dsRNA，該酶的特點(diǎn)是不需要其他蛋白因子參與就能夠獨(dú)立行使轉(zhuǎn)錄功能。此外，T7 RNA聚合酶只能特異性地識(shí)別T7啟動(dòng)子，且合成延伸速率較快。因此，通過T7 RNA聚合酶可以在體外條件下快速地合成dsRNA。另一種合成dsRNA的方法為傳統(tǒng)的化學(xué)合成核酸序列，主要通過對(duì)堿基的去保護(hù)、偶聯(lián)、加帽和氧化等步驟，逐步循環(huán)添加新的核苷酸，最終得到目標(biāo)核酸序列，但價(jià)格昂貴，合成效率低，有機(jī)雜質(zhì)多。無論是體外轉(zhuǎn)錄法還是化學(xué)合成法都限于小規(guī)模的RNAi實(shí)驗(yàn)，很難在田間進(jìn)行大規(guī)模推廣與應(yīng)用。因此，關(guān)于RNA生物農(nóng)藥的研發(fā)與推廣方面，多數(shù)科研人員聚焦于前三種方法（表1）。

3 RNA干擾技術(shù)用于害蟲防治的制約因素及應(yīng)對(duì)策略

3.1 制約RNAi技術(shù)在害蟲防治中應(yīng)用的因素

RNAi技術(shù)已廣泛應(yīng)用于基因功能研究，由于其高效性和特異性，有望成為第四代殺蟲劑的核心技術(shù)。但迄今為止，RNAi技術(shù)的應(yīng)用還存在一定的限制因素，其中主要制約因素是RNAi效率問題。不同的昆蟲類群RNAi效率存在較大差異，例如鞘翅目昆蟲赤擬谷盜（T.castaneum）和直翅目昆蟲飛蝗（L.migratoria）RNAi效率很高［40］，而鱗翅目昆蟲亞洲玉米螟（Ostriniafurnacalis）的RNAi效率很低［41］；同一種昆蟲通過注射、飼喂或植物介導(dǎo)表達(dá)等不同方式導(dǎo)入dsRNA，其RNAi效率也存在差異，例如對(duì)飛蝗注射dsRNA干擾效率很高，而飼喂dsRNA則無干擾效果［11］。

影響RNAi效率的因素很多，當(dāng)dsRNA進(jìn)入蟲體，首先接觸的是血淋巴和腸液，因此，dsRNA在血淋巴和腸道中的穩(wěn)定性將直接影響RNAi是否能被成功誘發(fā)。已有研究表明，dsRNA進(jìn)入血淋巴或腸腔的穩(wěn)定性與RNAi效率成正相關(guān)［42］。由于進(jìn)入蟲體的dsRNA被核酸外切酶所降解，導(dǎo)致RNAi效率低下［9-11，41］。除此之外，靶基因的選擇也會(huì)影響RNAi效率，2011年，TERENIUS等總結(jié)了鱗翅目昆蟲中150個(gè)基因的RNAi效率，發(fā)現(xiàn)與免疫相關(guān)的基因容易被干擾，而上皮組織中表達(dá)的基因則相對(duì)更難被干擾［43］。苗雪霞等將10個(gè)靶基因的dsRNA直接噴灑在新孵化的亞洲玉米螟蟲體上，發(fā)現(xiàn)其中9個(gè)靶基因可以引起蟲體發(fā)育不良的現(xiàn)象，且有4個(gè)靶基因可以導(dǎo)致高達(dá)90%的死亡率。由此可見，同種昆蟲同一干擾方式，不同的靶基因所引起的基因沉默效率顯著不同［44］。另外，應(yīng)用成本也是在推廣過程中需要考慮的問題之一，實(shí)驗(yàn)室可以通過注射的方式干擾靶基因，但實(shí)際應(yīng)用中飼喂和噴灑顯然是更便捷且更易被推廣的方式，但是飼喂和噴灑都需要消耗大量的dsRNA，而市面上體外合成dsRNA的試劑盒成本較高，所以在實(shí)際應(yīng)用中選擇微生物表達(dá)dsRNA，不但可以大大降低成本，還可以實(shí)現(xiàn)持續(xù)供給的目的。

3.2 提高RNA干擾技術(shù)應(yīng)用的策略

dsRNA的穩(wěn)定性是影響RNAi效率的重要因素，保證dsRNA的穩(wěn)定性是提高RNAi效率的關(guān)鍵。研究表明，可以通過載體包裹dsRNA的策略以提高dsRNA的穩(wěn)定性。近年來，納米材料因其具有低毒性、高轉(zhuǎn)染效率以及便于大量生產(chǎn)等特點(diǎn)被認(rèn)為是遞送dsRNA的良好載體。2010年，朱坤炎等利用殼聚糖納米材料包裹dsRNA飼喂岡比亞按蚊幼蟲，可以顯著沉默靶基因［36］。沈杰等研發(fā)合成的一種陽離子核-殼熒光納米材料（FNP）與dsRNA通過靜電作用相結(jié)合，利用其熒光可追蹤的特點(diǎn)，可以觀察到該材料能夠被果蠅腸上皮細(xì)胞所吸收。用FNP攜帶亞洲玉米螟Cht10的dsRNA飼喂亞洲玉米螟，發(fā)現(xiàn)其靶基因顯著沉默且出現(xiàn)蟲體顯著減小的表型［38］。除提高外源dsRNA進(jìn)入細(xì)胞前的穩(wěn)定性外，可采用篩選高效的靶基因，通過轉(zhuǎn)基因植物介導(dǎo)、工程菌介導(dǎo)和病毒介導(dǎo)的方式，低成本高效率地合成dsRNA的方法，并將dsRNA持續(xù)遞送到害蟲體內(nèi)干擾其靶基因，從而實(shí)現(xiàn)RNAi技術(shù)在害蟲防治中的應(yīng)用。

4 結(jié)論與展望

化學(xué)農(nóng)藥的長期施用導(dǎo)致了環(huán)境污染、生態(tài)安全和食品安全等一系列問題，已成為制約現(xiàn)代農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的瓶頸。因此，研發(fā)害蟲綠色防控技術(shù)體系對(duì)推動(dòng)綠色農(nóng)業(yè)及生態(tài)和食品安全具有重要意義。RNAi技術(shù)已被公認(rèn)為第四代殺蟲劑的核心技術(shù)。2015年，美國孟山都公司培育出dsRNA與Bt蛋白共表達(dá)的轉(zhuǎn)基因玉米 MON 87411［45］，2017年獲得美國FDA批準(zhǔn)，并計(jì)劃實(shí)現(xiàn)商業(yè)化。我國尚無基于RNAi技術(shù)的害蟲防控產(chǎn)品，因此研發(fā)高效安全的核酸生物農(nóng)藥是植物保護(hù)領(lǐng)域的重要研究方向。探究昆蟲RNAi機(jī)理，明確昆蟲RNAi效率差異的分子機(jī)制，篩選害蟲高效致死基因，研發(fā)高效運(yùn)載體系將會(huì)有力地促進(jìn)RNAi技術(shù)在植物保護(hù)領(lǐng)域的應(yīng)用。