顏 楠，韓 峰，刁艷君，陳啟穎，劉家云

空軍軍醫(yī)大學(xué)附屬西京醫(yī)院檢驗科，陜西西安 710032

狼瘡抗凝物(LAC)是一種磷脂依賴的病理性循環(huán)抗凝物質(zhì),是抗磷脂抗體(APL)的一種[1]，為IgG或IgM的異質(zhì)性免疫球蛋白。主要通過結(jié)合β2糖蛋白Ⅰ、人凝血酶原及其他磷脂復(fù)合物來干擾磷脂依賴的凝血過程,使體外檢測的凝血時間延長[2]。持續(xù)LAC陽性的患者被認(rèn)為有較高的血栓形成和復(fù)發(fā)風(fēng)險,與不明原因習(xí)慣性流產(chǎn)、死胎、血栓性疾病及某些自身免疫性疾病密切相關(guān)[3]。因LAC的異質(zhì)性，檢測試劑種類、磷脂構(gòu)成和濃度、檢測原理(有磁珠法與光學(xué)法、散射光與透射光)的不同，以及檢測反應(yīng)終點判斷方式的不同等均會影響到檢測結(jié)果[4]。有部分LAC陽性的患者有凝血酶原時間(PT)和活化部分凝血活酶時間(APTT)的延長，會使凝血因子活性的檢測出現(xiàn)假性降低的結(jié)果。稀釋法是指將原血漿標(biāo)本按不同稀釋比例進(jìn)行稀釋。由于凝血因子的促凝過程是一系列酶促反應(yīng)，其反應(yīng)速度與強度在一定范圍內(nèi)與凝血因子的活性呈線性相關(guān)[5]，故稀釋后各濃度血漿的凝血因子活性通過乘以稀釋倍數(shù)，可校正為與檢測結(jié)果相同或相近的結(jié)果[6]。若存在病理性的抗凝物質(zhì)，如LAC，稀釋法可以通過降低干擾物質(zhì)的滴度，使檢測結(jié)果能更準(zhǔn)確地反映體內(nèi)凝血因子的真實水平。

1 資料與方法

1.1一般資料 在2020年10月至2021年4月于本院住院治療的抗磷脂綜合征(APS)患者中選取LAC陽性[LAC檢測采用改良的稀釋蝰蛇毒時間試驗(dRVVT)進(jìn)行篩選和確診試驗，計算LA比值(LA比值=篩選試驗比值/確診試驗比值)，LA比值>1.2為陽性]且PT、APTT均延長的6例患者作為LAC陽性組，男1例、女5例，年齡14～49歲、平均26.33歲。另外，選取同期于本院體檢的健康者30例作為對照組，男、女各15例，排除有先天性凝血功能障礙、凝血因子缺乏、肝臟疾病、嚴(yán)重感染、血栓栓塞性疾病者，年齡23～56歲，平均36.00歲。

1.2儀器與試劑 使用的檢測儀器為Sysmex公司生產(chǎn)的Sysmex CS5100型全自動凝血分析儀。PT、APTT、凝血因子活性、LAC檢測試劑或試劑盒及質(zhì)控品均為德國西門子公司產(chǎn)品。

1.3方法 采集受試者清晨空腹靜脈血于枸櫞酸鈉抗凝管中，以1 500×g離心15 min后分離血漿。采用全自動凝血分析儀及相應(yīng)的配套試劑進(jìn)行檢測。對照組：將30例受試者的混合血漿分別按1∶1、1∶21、1∶22、1∶23、1∶24、1∶256種不同稀釋倍數(shù)配制成不同濃度的血漿，稀釋液選用德國西門子公司生產(chǎn)的原裝OVB緩沖液。分別檢測凝血因子FⅧ、FⅨ、FⅪ、FⅫ、FⅡ、FⅤ、FⅦ、FⅩ活性，將其與所對應(yīng)稀釋度的理論值作線性相關(guān)分析。LAC陽性組：用同樣的方法采集6例LAC陽性組患者標(biāo)本，將6例患者的標(biāo)本分別按同樣的方法進(jìn)行梯度稀釋并對上述8種凝血因子的活性進(jìn)行檢測。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS26.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計學(xué)分析，檢驗水準(zhǔn)α=0.05；應(yīng)用GraphPad Prism 8軟件繪圖。

2 結(jié) 果

2.1對照組凝血因子活性檢測值與理論值的相關(guān)性分析 對照組8種凝血因子活性檢測值與理論值均呈直線相關(guān)(R2≥0.90，P<0.05)，見圖1。凝血因子活性在不存在任何干擾物質(zhì)的情況下隨稀釋度的增加而逐漸降低。

圖1 對照組凝血因子活性檢測值與理論值的線性相關(guān)分析

2.2LAC陽性組凝血因子活性檢測 隨著稀釋倍數(shù)的增加，內(nèi)源性凝血因子(FⅧ、FⅨ、FⅪ、FⅫ)活性隨之升高，能恢復(fù)到大致正常水平，且升高到一定水平時不再隨著稀釋倍數(shù)的增加而繼續(xù)升高。此處列舉LAC比值最高患者的檢測結(jié)果，見表2。

表2 LAC比值最高患者的8種凝血因子不同稀釋倍數(shù)的檢測結(jié)果(%)

3 討 論

APTT檢測是一項針對內(nèi)源性凝血途徑的篩查試驗,參與內(nèi)源性凝血的因子主要有FⅧ、FⅨ、FⅪ、FⅫ。APTT的檢測方法為凝固法。當(dāng)APTT延長時通常提示內(nèi)源性凝血功能障礙[7]，與血液不凝和出血有關(guān)。LAC陽性患者體內(nèi)的LAC可直接與凝血酶原上的抗原決定簇結(jié)合，抗原抗體復(fù)合物與陰離子磷脂相結(jié)合，抑制凝血酶原、FⅧ、FⅨ、FⅩ等與磷脂微粒的結(jié)合，也可導(dǎo)致APTT延長[8]。內(nèi)源性凝血因子的檢測方法同樣為凝固法[9]，其原理是通過把不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)血漿檢測得到的APTT值繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線來讀取凝血因子活性水平，可以分別測得內(nèi)源性凝血因子FⅧ、FⅨ、FⅪ、FⅫ的活性。dRVVT的原理是在待測血漿中加入激活劑蝰蛇毒和鈣離子，魯賽爾氏蝰蛇毒可直接活化凝血因子X使血液凝固[3]。其包括篩選試驗和確證試驗。如果血漿中存在LAC能使篩選試驗的凝固時間延長。確診試驗的試劑和篩選試驗試劑一樣，但其含高濃度磷脂，外源性磷脂與LA抗體結(jié)合，很大程度上糾正了凝固時間。計算其比值(LA比值=篩選試驗比值/確診試驗比值)，若LA比值>1.2，則判斷患者為LAC陽性[10]。該試驗證明LAC存在特異且簡便的檢測手段。國際血栓與止血學(xué)會(ISTH)與臨床實驗室和標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)分別在2009年與2014年更新了關(guān)于LAC檢測相關(guān)指南文件[11-12],指南均推薦將dRVVT和APTT兩種試驗作為LAC的一線篩查試驗。

當(dāng)LAC陽性患者表現(xiàn)出APTT假性延長時，需要通過APTT來反映的內(nèi)源性凝血因子FⅧ、FⅨ、FⅪ、FⅫ活性檢測也同樣會受到干擾。這無疑將大大增加臨床的診療難度。臨床應(yīng)分析患者是否存在可導(dǎo)致LAC陽性的感染或藥物的使用，進(jìn)一步檢測并排除自身免疫性疾病。LAC陽性的自身免疫性疾病以系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)[13]和APS多見，其中LAC陽性是APS的診斷標(biāo)準(zhǔn)之一[14]。當(dāng)實驗室檢測間隔12周以上，連續(xù)2次檢測LAC為陽性時，加上一項血栓形成或復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的臨床表現(xiàn)即可診斷APS。LAC陽性患者被認(rèn)為有較高的血栓風(fēng)險[15]，但極少有LAC陽性患者發(fā)生出血[16]。

本研究首先將健康人混合血漿標(biāo)本各稀釋度的凝血因子活性檢測結(jié)果與其對應(yīng)稀釋度的理論活性值進(jìn)行線性相關(guān)分析，8種凝血因子活性檢測值與理論值均呈直線相關(guān)(R2≥0.90，P<0.05)，而且凝血因子活性在不存在任何干擾物質(zhì)的情況下隨稀釋度的增加而逐漸降低，即只表現(xiàn)為單純的稀釋效應(yīng)。另外，本研究收集了6例LAC陽性且PT、APTT均延長的患者標(biāo)本，用稀釋法進(jìn)行了同樣的凝血因子活性檢測。結(jié)果顯示隨著稀釋度的增加，凝血因子FⅧ、FⅨ、FⅪ、FⅫ活性并沒有表現(xiàn)出稀釋效應(yīng)，而是隨稀釋比例增加而逐漸升高最終恢復(fù)至大概正常水平，即明確提示存在干擾。因其標(biāo)本在稀釋的過程中LAC的滴度也隨之降低，最終可以得到相對準(zhǔn)確的結(jié)果。對于內(nèi)源性凝血因子活性降低且LAC升高的患者，應(yīng)綜合分析實驗室的檢測結(jié)果，并需要進(jìn)一步采用稀釋法對凝血因子活性進(jìn)行檢測。而FⅡ、FⅤ、FⅦ、FⅩ的活性變化較小是由于這4個凝血因子主要反映外源性凝血途徑的凝血狀況，而LAC主要作用于凝血酶原復(fù)合物(因子Ⅹa、Ⅴa、Ca2+及磷脂)以及Tenase復(fù)合物(因子Ⅸa、Ⅷa、Ca2+及磷脂)，并能在體外延長磷脂依賴的凝血試驗的時間[17]。所以內(nèi)源性凝血途徑的篩查試驗APTT對LAC較敏感，通過APTT檢測得到的FⅧ、FⅨ、FⅪ、FⅫ活性也更易受到干擾。在明確APTT延長的原因是LAC且不存在其他出血風(fēng)險因素時,不應(yīng)將APTT延長與內(nèi)源性凝血因子活性降低視為手術(shù)禁忌。

臨床實驗室有必要開展凝血因子活性、LAC等特殊項目的檢測，以協(xié)助復(fù)雜出血性疾病與血栓性疾病的診斷。最后，實驗室應(yīng)與臨床科室密切溝通，使臨床科室充分了解影響實驗室檢測結(jié)果的干擾因素以及各類疾病的實驗室檢測路徑，避免錯誤理解和使用檢驗結(jié)果，從而共同為患者提供更加快速、準(zhǔn)確的診斷與治療。