江 悅， 謝桂蘭， 陳 放， 徐 鶯

(四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 成都 610064)

1 引 言

煙草脆裂病毒(Tobacco Rattle Virus, TRV)是一種雙正鏈RNA病毒，其基因組由RNA1和RNA2兩部分組成.RNA1的大小和基因序列比較保守，主要包括依賴于RNA的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase, RdRp)和移動(dòng)蛋白(Movement Protein, MP)，其可以使病毒粒子在宿主植物內(nèi)復(fù)制和移動(dòng). RNA2一般包含病毒衣殼蛋白(Coat Protein, CP)和一些非結(jié)構(gòu)性基因，RNA2基因組可以被修飾以攜帶外源基因，因此目的基因通常被克隆到RNA2上[1]. 煙草脆裂病毒不僅能夠侵染煙草，還能夠侵染番茄果實(shí)、辣椒葉、矮牽?；ā⒙e斗菜、唐松草花、玫瑰花、草莓果實(shí)、加州罌粟、麻瘋樹、紫茉莉[2]和菠菜[3].

在植物油脂基因工程中，常用傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，即將特定外源基因穩(wěn)定的在受體生物中表達(dá)[4]，但實(shí)驗(yàn)過程繁瑣，周期較長，而利用煙草農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)系統(tǒng)僅在被侵染葉片表達(dá)目的基因[5]. TRV作為一種植物病毒載體，具有復(fù)制快，感染強(qiáng)，對(duì)植株傷害小等優(yōu)點(diǎn)，不僅能在侵染葉片表達(dá)目的基因，在未侵染葉片也能檢測(cè)出目的基因的表達(dá)[6].

研究發(fā)現(xiàn)WRI1是提高總油脂含量的關(guān)鍵基因[7]，而FAD2基因是單不飽和脂肪酸生成多不飽和脂肪酸的關(guān)鍵[8].而多不飽和酸不利于儲(chǔ)存，沉默F(xiàn)AD2基因可以減少多不飽和脂肪酸的含量[9]. 本研究通過構(gòu)建TRV-WRI1過表達(dá)載體和TRV-FDA2沉默載體，對(duì)侵染7天和14天的本氏煙草株系WRI1下游基因進(jìn)行定量分析，并測(cè)定植株葉片的脂肪酸含量和種類，探討利用TRV過表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行油脂相關(guān)基因功能研究的可行性.

2 材料與方法

2.1 材 料

2.1.1 植物材料 本氏煙草(Nicotianabenthamiana)種子為本實(shí)驗(yàn)室保存.

2.1.2 菌株和質(zhì)粒 大腸桿菌(E.coli)和農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101菌株于-80 ℃冰箱保存. 煙草脆裂病毒過表達(dá)及沉默載體菌株于-80 ℃冰箱保存.

2.1.3 PCR引物 見表1.

表1 本文中所用PCR引物

2.2 方 法

2.2.1WRI1和FAD2基因序列克隆和載體構(gòu)建 以擬南芥RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，利用高保真酶Primer STAR Max(TaKaRa, Japan)進(jìn)行WRI1和FAD2基因的擴(kuò)增，引物序列如表1所示. 利用TaKaRa公司的限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)TRV載體的TRV2質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切. 酶切反應(yīng)結(jié)束后用核酸純化回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物，然后進(jìn)行連接. 測(cè)序后轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101.

2.2.2 農(nóng)桿菌重懸液制備 將轉(zhuǎn)入TRV-WRI1和TRV-FAD2的農(nóng)桿菌接種到含有Kana、Rif抗性的培養(yǎng)基中，28 ℃，200 r/min活化24 h；取1 mL活化菌液加入 YEB培養(yǎng)基，28 ℃，200 r/min，12 h，直至OD600≈0.8～1.0；5 000 r/min，常溫離心富集農(nóng)桿菌菌體；用重懸液(1 mol/L MgCl2，1 mol/L MES，200 mmol/L AS)重懸菌體至OD6000.8～1.0，將TRV2菌液與TRV1菌液按照1∶1體積混勻，室溫避光靜置2～4 h.

2.2.3 侵染本氏煙草 選擇4～6葉期的本氏煙草，將農(nóng)桿菌重懸液注射擴(kuò)散到膨大葉的遠(yuǎn)軸側(cè). 每株植物注射2～3片葉，將侵染后暗室培養(yǎng)24 h后，置于25 ℃，16 h/8 h光周期溫室培養(yǎng).

2.2.4 qRT-PCR分析 利用天根生物RNAPrep Pure Plant Kit試劑盒提取本氏煙草總RNA，PrimeScriptTMRT reagent Kit (TaKaRa, Japan)試劑盒合成單鏈cDNA. 使用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑對(duì)WRI1下游基因進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，所用引物見表1.

2.2.5 油脂成分測(cè)定 稱取0.1 g侵染后的本氏煙草葉片或侵染后的系統(tǒng)葉葉片放入玻璃管中，加入1 mL新鮮配制的5%硫酸甲醇溶液(v/v). 加入300 μL甲苯作為促溶劑，再加入10 μL 2%的BHT溶液和10 μg十七烷酸甘油三酯溶液作為內(nèi)參；各試劑加入結(jié)束后迅速震蕩混勻，90～95 ℃水浴反應(yīng)1.5～2 h；取出玻璃管冷卻至室溫，加入1.5 mL新鮮配制的0.9% NaCl溶液，混勻. 再向玻璃管中加入1 mL正己烷萃取脂肪酸甲酯，震蕩混勻，靜置5 min，取上清液于2 mL棕色玻璃瓶中；用氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用儀GC-MS 2010對(duì)提取的脂肪酸甲酯含量進(jìn)行測(cè)量，分離柱為HP-88. GC條件為：火焰離子化檢測(cè)器和加樣器溫度為220 ℃. 爐溫升溫程序?yàn)椋?60 ℃，保持1 min；然后每分鐘升高10 ℃，升到200 ℃，保持1 min；然后每分鐘升溫5 ℃，升到210 ℃，保持1 min. 脂肪酸甲酯含量通過與內(nèi)參的峰面積對(duì)比進(jìn)行計(jì)算.

3 結(jié)果與分析

3.1 TRV-WRI1過表達(dá)載體及TRV-FAD2沉默載體構(gòu)建

用表1中設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行擴(kuò)增，凝膠電泳檢測(cè)出WRI1大小約1 300 bp，F(xiàn)AD2大小約為500 bp(圖1)，片段大小與預(yù)期結(jié)果相符.

圖1 WRI1和FAD2基因PCR產(chǎn)物電泳圖

3.2 TRV-WRI1過表達(dá)植株中下游基因表達(dá)量分析

用TRV-WRI1過表達(dá)載體的農(nóng)桿菌侵染本氏煙草植株后，分別在侵染后第6 d和第13 d提取系統(tǒng)葉葉片的總RNA，以煙草β-actin為內(nèi)參，利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)WRI1轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)基因的表達(dá)量. 本研究對(duì)ACP1，KAS1，BCCP2，Pkb1和SUS2基因進(jìn)行定量分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，無論是在侵染葉還是系統(tǒng)葉中，過表達(dá)株系的這5個(gè)相關(guān)基因的表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組；第6天的侵染葉中ACP1基因增加量最為明顯，與對(duì)照組相比增加來約3倍；侵染第13 d的系統(tǒng)葉中，ACP1基因和SUS2基因表達(dá)量增加最明顯，增加了約1倍和1.5倍. 總體而言，侵染葉中WRI1相關(guān)基因的相對(duì)增加幅度略高于系統(tǒng)葉中相關(guān)基因的相對(duì)增加幅度(圖2). TRV-WRI1過表達(dá)后，在轉(zhuǎn)錄水平初步啟動(dòng)了植物中與脂肪酸合成相關(guān)基因的表達(dá).

圖2 TRV-WRI1過表達(dá)植株葉片中WRI1下游基因表達(dá)分析

3.3 TRV-WRI1過表達(dá)植株中油脂含量和成分的測(cè)定

為進(jìn)一步探究WRI1基因?qū)χ参镉椭糠e累的影響，本研究將TRV-WRI1和TRV空載(CK)侵染本氏煙草，分別在第7 d和第14 d取侵染葉葉片、系統(tǒng)葉葉片，測(cè)定油脂的成分和含量. 結(jié)果顯示，在侵染后第7 d，實(shí)驗(yàn)組中的軟脂酸含量和大部分硬脂酸含量顯著增加. 以每克植物葉片中的油脂含量來分析，實(shí)驗(yàn)組中的總油脂含量比對(duì)照組約增加16%. 侵染14 d后與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中的部分硬脂肪酸含量顯著增加，總油脂含量比對(duì)照組約增加28%(圖3).

3.4 TRV-FDA2沉默植株中油脂含量的成分和測(cè)定

為進(jìn)一步探究FAD2基因?qū)χ参镉椭糠e累的影響，本研究將TRV-FDA2和TRV空載(CK)侵染本氏煙草，分別在第7 d和第14 d取侵染葉葉片、系統(tǒng)葉葉片，測(cè)定油脂的成分和含量. 結(jié)果顯示，在侵染后第7 d和第14 d，實(shí)驗(yàn)組中的多不飽和脂肪酸含量顯著減少. 以每克植物葉片中的油脂含量來分析，實(shí)驗(yàn)組中的多不飽和脂肪酸含量比對(duì)照組減少約25%. 在侵染后第14 d，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中的多不飽和脂肪酸含量顯著減少，相比對(duì)照組減少約24%(圖4).

圖3 TRV-WRI1過表達(dá)植株葉片中脂肪酸分析

圖4 TRV-FDA2沉默植株葉片中脂肪酸分析

種子油脂合成[11-12]. 利用TRV過表達(dá)系統(tǒng)，在本氏煙中過表達(dá)WRI1基因，隨著侵染后時(shí)間的延長，外源基因短期內(nèi)在本氏煙中大量表達(dá)，在侵染后的第6 d和第13 d對(duì)WRI1的下游靶基因進(jìn)行定量分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，WRI1的過表達(dá)啟動(dòng)了其下游靶基因的表達(dá)，過表達(dá)植株中下游靶基因的含量顯著高于對(duì)照組. 從qRT-PCR結(jié)果可知，系統(tǒng)葉中WRI1下游基因的總體增加水平?jīng)]有侵染葉中的高，特別是與對(duì)照組相比，系統(tǒng)葉中的BCCP1、KAS1和Pl-Pkβ1基因的上升相對(duì)值沒有侵染葉中的高.

對(duì)其脂肪酸含量進(jìn)行測(cè)定，總的侵染葉片脂肪酸含量第7 d的增加16%，第14 d系統(tǒng)葉增加28%. 與對(duì)照組相比，侵染葉中的軟脂酸、硬脂酸和大部分不飽和硬脂酸均呈顯著性增加，而系統(tǒng)葉中的軟脂酸和部分不飽和硬脂酸的含量僅呈上升趨勢(shì)，并沒有出現(xiàn)顯著性的差異. Yang等[13]在二穗短柄草中過表達(dá)BdWRI1誘導(dǎo)了糖酵解和脂肪酸生物合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，使8 w齡葉片中的油脂含量增加了32.5倍，促進(jìn)了葉片中脂肪酸的合成和標(biāo)記的積累，然而，BdWRI1的過表達(dá)也導(dǎo)致了游離脂肪酸含量的增加，具有細(xì)胞毒性作用，導(dǎo)致細(xì)胞死亡.同時(shí)，利用TRV病毒載體沉默F(xiàn)DA2基因，脂肪酸測(cè)量結(jié)果顯示，在第7 d和第14 d，與對(duì)照組相比，多不飽和脂肪酸分別下降了25%和24%，且飽和脂肪酸含量差異不顯著，本實(shí)驗(yàn)成功利用病毒載體沉默F(xiàn)DA2基因.

病毒載體瞬時(shí)侵染植物表達(dá)目的基因相比于穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)在時(shí)間上大大縮短，本實(shí)驗(yàn)中，僅第6 d就檢測(cè)到了目的基因的表達(dá)，本氏煙中脂肪酸含量得到增加. 但是病毒載體的承載容量有限，不能包裝大片段的外源DNA基因，復(fù)制穩(wěn)定性差，外源基因無法在植物細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳[14-15]；同時(shí)TRV病毒載體侵染的物種也有局限性，但是可以通過開發(fā)更多的病毒載體來解決這一問題. 后續(xù)研究可以同時(shí)在煙草葉片上利用TRV病毒載體，過表達(dá)WRI1和沉默F(xiàn)AD2基因，達(dá)到提高油脂總量和減少不飽和脂肪酸比例目的.