鄧艾汶， 李青遙， 楊 文， 肖朝文

(四川大學生命科學學院， 成都 610064)

1 引 言

雖然擬南芥作為模式植物在植物界應用廣泛，但其經濟價值缺乏.多年生木本楊樹在研究木本植物發(fā)育調控、生物與非生物脅迫應答和物種進化等生物學問題中起著重要作用，并且具有重要的經濟價值[1].隨著我國經濟的發(fā)展，楊樹優(yōu)良育種的需求大大增加，但由于育種資源缺乏、栽培體系不健全等因素限制了我國林木育種發(fā)展.近年來，基因工程技術的發(fā)展和分子生物學的應用為楊樹抗逆育種改良提供了新思路.

細胞壁作為植物細胞外界的第一層屏障，對植物細胞起到至關重要的保護作用.細胞壁結構由初生細胞壁、次生細胞壁和胞間層組成，其中初生壁主要成分為果膠，纖維素和半纖維素[2].對于高等植物而言，細胞壁不僅作為細胞的重要結構組成單元，根據不同細胞壁組分的理化性質，細胞壁在植物生長過程中起多種調控作用[3].細胞壁具有對植物提供機械支持、介導物質運輸、抵御病原體和逆境脅迫、調控生長速度和傳遞外界信號等一系列重要的生物學功能[4].

果膠是一類存在于植物細胞壁中富含半乳糖醛酸(Galacturonic Acid，GalA)的多糖生物大分子，在雙子葉植物和非禾本科單子葉植物中約占初生細胞壁的35%，在調控細胞粘附、氣孔開閉和防御響應等方面起重要作用[5].根據果膠分子主鏈和側鏈結構的不同，主要分為以下四類結構單元：同型半乳糖醛酸聚糖(Homogalacturonan，HG)，鼠李半乳糖醛酸聚糖I型(Rhamnogalacturonan I, RG I)，鼠李半乳糖醛酸聚糖Ⅱ型(Rhamnogalacturonan Ⅱ，RG Ⅱ)，木葡糖半乳糖醛酸聚糖(Xylogalacturonan，XG)[6].其中，同型半乳糖醛酸聚糖HG在果膠中最為豐富，約占60%.HG是由α-1,4糖苷鍵連接的線形聚合物，在它的C-6位羧基處可被甲基酯化修飾，在O-2或O-3位可被乙酰化修飾[7].研究表明，HG的不同理化狀態(tài)影響細胞粘附性和組織完整性，也影響細胞間的信號傳遞[8].在果膠HG合成過程中，HG的主鏈通過果膠甲基轉移酶在高爾基體合成并在C-6位置被甲基酯化后，以約70%-80%的高酯化形式沉積在細胞壁上[9].這種高度甲酯化狀態(tài)的HG隨后會被果膠甲基酯化酶(Pectin Methylesterase，PME)去甲酯化而使其甲酯化程度降低.低甲酯化的果膠在不同pH和不同質子濃度條件下，一方面可與鈣離子(Ca2+)發(fā)生交聯(lián)，產生“蛋盒”(egg-box)的構象，從提高細胞壁剛性；另一方面可被多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase，PG)剪切成為小片段，使其可塑性增加[8].所以，果膠修飾酶可通過改變HG的狀態(tài)影響果膠的構象和重塑性而調控植物生長發(fā)育.植物果膠甲酯酶PME可以通過修飾果膠的甲酯化狀態(tài)參與細胞壁果膠的代謝和重塑.因此，PME與植物的生殖和發(fā)育密切相關，影響植物的多個生理過程[10].近年來，果膠甲酯酶PME的功能被逐步揭示，其主要表現在細胞壁柔韌性與硬化、細胞粘附和細胞分離[11]，果實成熟[12]，木材生長與發(fā)育[13]，莖稈生長[14]，葉片氣孔發(fā)育[15]，種子萌發(fā)[16]和花粉管伸長[17]等方面.另外，由于細胞壁作為外界環(huán)境與植物細胞內環(huán)境的一道屏障，細胞壁修飾過程與植物防御響應密切有關[18].擬南芥微陣列數據庫預測顯示，植物在響應多種生物與非生物脅迫時，有約75%的PME基因表達水平發(fā)生明顯變化.然而，無論是在擬南芥還是楊樹中，PME在干旱脅迫中的作用機制都鮮有報導.

在本研究中，生物信息學預測表明，擬南芥AtPME34和毛白楊PtoPME34-1基因在莖組織中的表達量都很高[17].通過轉錄組數據庫和序列比對，我們從毛白楊中篩選并克隆出擬南芥AtPME34的同源基因PtoPME34-1，并進行組織特異性表達分析和蛋白亞細胞定位觀察.進一步研究發(fā)現，PtoPME34-1基因的過量表達和敲除都有效提高了楊樹抗旱性.這些研究結果證實了毛白楊果膠甲酯酶PtoPME34-1在調控植物生長發(fā)育和抗旱脅迫中的重要作用.

2 材料和方法

2.1 材料和試劑

野生型毛白楊(Popilustrichocarpa)，植物總RNA提取試劑盒(Bioflux)，反轉錄試劑盒(Takara)，高保真DNA聚合酶(Vazyme)，qPCR TB green Taq Ⅱ酶(Takara)，限制性內切酶(NEB)，T4 DNA連接酶(NEB)，質體提取純化試劑盒(Omega)，大腸桿菌DH5α，根癌農桿菌GV3101，亞細胞定位載體pBI121-GFP，植物過量表達載體pCXSN，基因敲除載體pYLCRISPR/Cas9.

2.2.1PtoPME34-1基因的克隆和進化樹構建 取野生型毛白楊第三到第四莖節(jié)幼嫩葉片，液氮迅速研磨成粉末，使用Biospin多糖多酚植物總RNA試劑盒提取植物總RNA，使用 Takara 公司的反轉錄試劑盒去除基因組DNA，并反轉錄合成cDNA.采用Phanta Max高保真 DNA 聚合酶進行PtoPME34-1基因的PCR擴增，并測序驗證.比對PtoPME34-1在其他物種中的同源基因，使用MEGA7軟件(https://www.megasoftware.net/)進行氨基酸序列比對，構建NJ進化樹(neighbor-joining phylogenetic tree)，重復值設置為1 000，比對結果用GeneiousPrime軟件(https://www.geneious.com/prime/)顯示.

2.2.2PtoPME34-1基因組織特異性表達分析 取三個月大約8 cm高的野生型楊樹組培苗，將其分成根、基部莖(植株中間以下的莖段)、上部莖(中間以上)、老葉(植株中間以下葉片)、新葉(中間以上)和葉柄部分.另取一生長狀態(tài)相似的楊樹莖段，用刀劃開表皮并剝開，外部為韌皮部，內部為木質部.隨后立即將8個不同組織的材料放入液氮中充分研磨，按照方法2.2.1進行總RNA的提取和cDNA的合成.使用qPCR TB green Taq Ⅱ酶進行實時熒光定量PCR(qPCR)反應，每組樣品含3個重復，所得樣品cq值用CFX Manager軟件導出，以最小值為基礎，以毛白楊UBQ為內參基因，根據2-△△Ct法計算PtoPME34-1基因在不同組織中的相對表達量.

2.2.3 PtoPME34-1蛋白亞細胞定位分析 使用Phanta高保真酶和基因特異引物擴增PtoPME34-1基因的開放閱讀框并回收PCR產物.T4連接酶連接目的基因和限制性內切酶KpnⅠ酶切的pBI121-GFP線性載體，構建重組質粒.對于亞細胞定位觀察，培養(yǎng)帶有重組質粒的農桿菌，當菌液OD600= 0.8時，注射3 w大的煙草葉片，并標記注射位置.注射完成的煙草在黑暗下繼續(xù)培養(yǎng)48 h和光照條件下培養(yǎng)12 h之后，使用激光共聚焦顯微鏡，在488 nm下的觀察熒光.pBI121-GFP空載體作為陽性對照.質壁分離使用0.3 g/mL的蔗糖溶液處理煙草葉片.

2.2.4 基因過量表達植株的構建 PCR擴增PtoPME34-1基因的編碼序列，通過同源重組，將基因片段重組到植物過量表達載體pCXSN上.完成重組反應后，使用熱激法轉化重組質粒到大腸桿菌DH5α感受態(tài)中，隨后進行陽性菌株的鑒定和農桿菌的轉化，獲得帶有陽性克隆的農桿菌.毛白楊苗的轉化采用葉盤法，將葉片在農桿菌重懸液中浸染10 min，取出清洗后在置于共培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)2 d.然后依次在選擇培養(yǎng)基、生芽培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)至約8 cm的幼苗后移栽到土里.利用潮霉素抗性篩選獲得陽性的轉基因植株.

2.2.5 基因敲除Crispr植株的構建 在網站(http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR2/CRISPR)中輸入gDNA 序列，選擇1～3個靶位點并添加對應靶位點的接頭.本載體系統(tǒng)采用Golden Gate cloning方法進行Cas9載體和多個gRNA表達盒片段的一次連接組裝.先構建gRNA表達盒， 隨后將其與pYLCRISPR/Cas9連接，然后進行載體的陽性克隆篩選檢測和打靶效果檢測.植物轉化和陽性植株篩選如前所述.

2.2.6 干旱脅迫 在楊樹中，選擇74日齡和108日齡植株進行干旱處理.停止?jié)菜? d，當楊樹分生組織干燥3 cm，葉尖下垂，土壤完全干旱時，在托盤中澆水約3 L，直到土壤表面浸透，清除多余的水分，使植株恢復生機.36 h后拍照并記錄表型.

2.2.7 植物果膠甲酯化程度的測定 果膠的甲酯化程度是甲基酯化的同型半乳糖醛酸與總同型半乳糖醛酸的比值.測量甲酯化程度方法主要參考文獻[19].

2.2.8 半乳糖醛酸含量測定 稱取1 mg 植物細胞壁到玻璃試管中，每樣5個重復，加水混勻.加入40 μL 4 mol/L氨基磺酸鉀(pH = 1.6)，再加入2.4 mL濃硫酸使其劇烈反應，渦旋震蕩搖勻.沸水浴10 min，冰上迅速降溫.最后加入80 μL含有0.15%苯基苯酚的0.5%的NaOH溶液，室溫下顯色反應5 min.利用分光光度計下測量OD525波長下的吸光值，根據表1所示的半乳糖醛酸標準品與吸光值得到的標準曲線計算樣品半乳糖醛酸的含量.

2.2.9 甲醇含量測定 稱取1 mg 植物細胞壁加到1.5 mL離心管中，每樣5個重復.加入400 μL 0.5 mol/L的NaOH溶液反應1 h，期間劇烈震蕩4次左右.加200 μL濃度為1 mol/L的HCl溶液并混勻，室溫離心10 min.取200 μL上清液加入300 μL濃度為20 mmol/L的HEPES 緩沖液(pH=7.5).加入500 μL含乙醇氧化酶的20 mmol/L的HEPES 緩沖液，反應后快速離心，加入500 μL的反應液，充分混勻后在60 ℃反應15 min.利用分光光度計下測量OD412波長下的吸光值，根據表2所示的甲醇標準品吸光值得到的標準曲線計算出反應液所含有的甲醇含量.本研究中所有的引物序列見表3.

表1 半乳糖醛酸標準品與吸光值

表2 甲醇標準品與吸光值

表3 引物序列

3 結果分析

3.1 毛白楊PtoPME34-1基因的克隆和同源性分析

毛白楊(Populustomentosa)屬于楊屬，在中國北方廣泛應用于造林綠化，因此對毛白楊的基因功能研究對于中國本土林業(yè)育種具有十分重要的經濟和生態(tài)意義.由于毛白楊的全基因組數據庫缺少，而模式樹種毛果楊(Populustrichocarpa)已經獲得全基因組測序，可以利用毛果楊的數據庫，同源克隆毛白楊的目標基因，進行基因功能分析.

如圖1(a)所示，在不同植物中比對毛白楊PtoPME34-1及其同源蛋白的序列，灰線和黑線分別表示預測的PMEI結構域和PME結構域的氨基酸位置.序列比對結果說明，包括PtoPME34-1在內的所有氨基酸序列都包含前后兩個結構域：PMEI結構域和PME結構域，屬于第一類(Type I)PME亞家族蛋白.通過氨基酸序列同源性比對分析，我們發(fā)現擬南芥AtPME34和毛果楊的PtrPME34與毛白楊PtoPME34有較高的同源性.為了進一步分析同源性和進化關系，我們使用氨基酸序列對其進行了多序列比對和進化樹構建.圖1(b)所示為毛白楊和擬南芥PME基因家族的系統(tǒng)發(fā)育關系，藍色、灰色、綠色分別表示Ⅰ型、ⅡA型和ⅡB型的PME基因家族.圖1(c)所示為PtoPME34-1及其同源蛋白的系統(tǒng)進化樹.毛白楊PtoPME34-1與毛果楊PtrPME34-1 (Potri.012G014500.1)位于同一染色體.毛白楊PtoPME34-1與毛果楊PtrPME34-1序列相似性高達100%，與擬南芥AtPME34序列相似性為93%，與毛白楊PtoPME34-2序列相似性也達100%.系統(tǒng)發(fā)育進化樹的結果表明， PtoPME34-1及不同物種中的同源蛋白在進化過程中非常保守，意味著果膠甲酯酶PME在植物生長發(fā)育過程中的重要作用.

圖1 PtoPME34-1的氨基酸序列同源性比對和系統(tǒng)發(fā)育進化樹

果膠甲基酯酶(PME，EC3.1.1.11，第八類碳水化合物酯酶[20])主要源于植物或微生物細胞壁，可以催化線性同聚半乳糖醛酸結構域中半乳糖醛酸GalA殘基C-6處的甲基，從而調控甲酯化程度并釋放甲醇和質子.通過網站(http://www.cbs. dtu.dk/services/TargetP)預測顯示PtoPME34-1蛋白可能在細胞壁中表達.為了驗證PtoPME34-1蛋白的亞細胞定位，我們構建了綠色熒光蛋白GFP標記PtoPME34-1的植物表達載體，通過農桿菌介導的方法瞬時轉化煙草葉片，利用激光共聚焦顯微鏡觀察GFP熒光信號.如圖2(a)所示，陽性對照組pBI121-GFP在煙草葉肉細胞中的膜、質、核區(qū)域均有熒光信號，而PtoPME34-1-GFP在煙草葉肉細胞中的信號只出現在細胞邊界部位.質壁分離處理發(fā)現，PtoPME34-1-GFP在煙草葉肉細胞中的信號仍然在細胞邊界部分(紅色箭頭所示為細胞膜).結果表明，PtoPME34-1蛋白在植物細胞的細胞壁中表達，與其果膠修飾酶功能的亞細胞作用位置一致.

為分析基因的組織特異性表達，我們利用qPCR檢測了楊樹不同組織包括幼葉(YL)、老葉(OL)、木質部(X)、韌皮部(PH)、葉柄(P)、基部莖(BS)、上部莖(US)和根(R)中PtoPME34-1的基因表達水平.圖2(b)所示，PtoPME34-1在所有組織部位中均有表達，在老葉中表達最少，在韌皮部、葉柄和根中表達較多，在木質部和基部莖中表達量最高.這些結果表明，PtoPME34-1傾向于在營養(yǎng)運輸部位表達，它可能參與調節(jié)植物生長發(fā)育中養(yǎng)分和水分的運輸過程.

圖2 PtoPME34-1蛋白的亞細胞定位和基因組織特異性表達

如圖3(a)所示，我們獲得了8個獨立的陽性楊樹PtoPME34-1的轉基因植株.qPCR檢測結果證實PtoPME34-1在轉基因株系1，3，8中的表達量顯著提高(圖3(b)).圖3(a)為正常澆水情況下的植株，圖3(c)為停止?jié)菜?天至萎蔫并再次加水36小時后的植株.結果顯示，過表達PtoPME34-1植株經干旱脅迫并復水后可恢復綠葉，而野生型的葉片依然干枯.這說明PtoPME34-1基因過量表達提高了植物的耐旱性.

為避免基因功能冗余，我們利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)獲得了PtoPME34-1和其同源基因PtoPME34-2的雙突變體株系.選擇其中4個突變體株系，利用生化方法測定楊樹細胞壁提取物中果膠的甲酯化程度.如圖4(a)所示，四個突變株系果膠含量均出現顯著下降.如圖4(b)所示，與野生型相比，突變體的果膠甲酯化程度顯著升高.這說明，突變體中PtoPME34-1和PtoPME34-2基因表達水平的下降使其編碼的果膠甲酯酶活性下降，去果膠甲酯化的能力減弱，最終導致果膠甲酯化程度升高.此外，Crispr突變體植株干旱復水后也能恢復綠葉，表現出一定程度的耐旱性(圖4c).

圖3 PtoPME34-1基因過量表達提高毛白楊的抗旱性

圖4 PtoPME34-1和PtoPME34-2基因的缺失降低果膠甲酯化程度且提高植物抗旱性

楊樹作為我國在經濟和環(huán)境方面具有重要貢獻的樹種之一，其遺傳育種研究早已相繼展開.細胞壁作為支持保護細胞的結構，其細胞壁合成修飾酶的基因功能和逆境響應機制在楊樹物種中卻鮮有報道.一方面，楊樹遺傳相關研究主要集中在生物學功能強大的轉錄因子；另一方面，細胞壁修飾酶基因多為比較保守的基因家族，存在基因功能冗余的現象，為其研究造成了困難.本研究首次在毛白楊中分離鑒定了果膠甲酯化酶基因PtoPME34-1并測序得到了完整的CDS序列.通過基因序列比對和進化分析，毛白楊PtoPME34-1氨基酸序列與毛果楊中PtrPME34-1相似性高達100%，并且該序列與多個物種中的同源蛋白相比差異性較小，均包含PMEI和PME兩個結構域，歸屬于第一類(Type I)PME亞家族蛋白.

我們分別進行了PtoPME34-1組織特異性表達分析及蛋白亞細胞定位分析.RNA表達水平檢測結果表明，PtoPME34-1表達量最高的組織位于營養(yǎng)物質運輸部位，比如基部莖、木質部等，說明PtoPME34-1可能參與楊樹生長中物質的運輸，尤其是在次生細胞壁中[15].從細胞水平來看，含GFP標記的PtoPME34-1-GFP融合蛋白定位在煙草葉片細胞壁，與PtoPME34-1蛋白作為果膠修飾酶的功能作用位點一致.這些分析結果表明，PtoPME34-1蛋白在毛白楊細胞壁中行使果膠甲基酯化酶的功能，對植物的生長發(fā)育有重要調節(jié)作用.

為了研究PtoPME34-1基因在植物體中的生物學功能，本實驗采用模式植物毛白楊作為植物材料構建了過量表達轉基因植株，發(fā)現過量表達PtoPME34-1后毛白楊抗旱性增強.此外，我們構建了PtoPME34-1和PtoPME34-2雙基因敲除突變體植株，敲除的植株中果膠甲酯化程度顯著高于野生型，且抗旱性也明顯提高.以前的研究發(fā)現，擬南芥PME34可以控制氣孔運動和調節(jié)保衛(wèi)細胞壁的靈活性，從而響應熱脅迫[21].因此，我們推測PtoPME34-1調控植物抗旱性是否也與氣孔開放程度相關，還需進一步驗證.由于過表達果膠甲基酯酶基因PtoPME34-1，其表達水平變化引起酶活水平的變化，導致果膠酯化程度的改變.我們猜測這種干旱信號響應的變化可能會體現在滲透響應基因的表達水平上，從而影響ABA等信號通路，作用于氣孔運動的變化，最終使植株或葉片的失水率與野生型出現差異，改變植物體的干旱耐受能力，但其具體分子機制尚待進一步探索.