穆 樂，孫錦涵，張 健，張淋然，丁彥琴，孫玉寧

（1.寧夏醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，銀川 750004；2.海南醫(yī)學院臨床醫(yī)學院，?？?571199）

犬博卡病毒（Minute virus of canine，MVC）屬于細小病毒家族的博卡病毒亞家族成員之一。博卡病毒屬主要含有牛博卡病毒（Bovine parvovirus,BPV）、犬博卡病毒（MVC）以及人博卡病毒（Human bocavirus，HBoV）3個家族成員。近年來，又相繼在黑猩猩（Gorilla bocavirus，GBoV）、豬（Porcine bocavirus，PBoV）、貓（Feline bocavirus，F(xiàn)BoV）、犬（Canine bocaviruses，CBoV）以及加利福尼亞海獅中發(fā)現(xiàn)了博卡病毒的新家族成員[1-4]。細小病毒是一種無包膜、分子量小、線性單鏈的DNA病毒，基因組大小為5 kb[5]。MVC基因組全長為5402 nt，包含3個開放閱讀框（open reading frame，ORF），分別編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1（85 kDa）、NP1（20 kDa），結(jié)構(gòu)蛋白VP1（81 kDa）、VP2（63 kDa）、VP3（61 kDa）[6]。

VP1和VP2蛋白是細小病毒衣殼的主要結(jié)構(gòu)蛋白，其中VP2蛋白約占病毒粒子衣殼蛋白的90%，VP1蛋白約占10%[7]。細小病毒的VP1和VP2基因?qū)儆谥貜托蛄薪Y(jié)構(gòu)基因，它們編碼的結(jié)構(gòu)蛋白存在一段相同的氨基酸序列：VP1蛋白在N端多出一段氨基酸序列，是VP1蛋白所獨有序列（獨特區(qū)），其后續(xù)的氨基酸序列與VP2氨基酸序列一致。研究發(fā)現(xiàn)，細小病毒VP1和VP2蛋白參與到病毒感染宿主細胞的過程，并且VP1蛋白在病毒衣殼蛋白的合成及形成感染性顆粒的過程中起著重要作用。VP1蛋白N端的獨特區(qū)域含有磷脂酶A2（PLA2）的保守序列（如HDXXY、YXGXG等區(qū)域），具有磷脂酶A2活性，其功能對于病毒DNA從吞噬體進入細胞核發(fā)揮重要作用[4,8]。博卡病毒 VP1在N端前有132個氨基酸是VPl蛋白所獨有的，剩余571個氨基酸與VP2氨基酸序列完全一致。本研究前期通過突變的方法，改變MVC的磷脂酶A2的保守序列氨基酸，發(fā)現(xiàn)酶活性的改變明顯影響了MVC在宿主細胞中的DNA復制能力[6]，說明VP1結(jié)構(gòu)蛋白在MVC基因組復制中發(fā)揮作用。本實驗通過構(gòu)建MVC結(jié)構(gòu)蛋白VP1 N端獨特區(qū)序列的原核表達載體，經(jīng)誘導表達并獲得純化的融合目的蛋白，免疫新西蘭大白兔后制備VP1的多克隆抗體，為后續(xù)開展MVC在感染及致病機制等方面的研究提供物質(zhì)基礎。

1 材料與方法

1.1 材料大腸桿菌DH5α和BL21（DE3）、質(zhì)粒pET32a（+）均由寧夏醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生化實驗室保存；沃爾特里德犬細胞（walter reed dog，WRD）及博卡病毒由美國堪薩斯大學醫(yī)學院微生物系邱建明教授惠贈；新西蘭大白兔購自寧夏醫(yī)科大學動物實驗中心。

1.2 原核表達載體構(gòu)建應用BioEdit軟件設計引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。上游引物：5'-GGTCTCGAATTCATGGCTCCTCC GAATAGAAAACC-3'（下劃線標記為EcoRⅠ酶切位點），下游引物：5'-GGTCTCCTCGAGCTACC TAGCTTGTTTAGAG-3'（下劃線標記為XhoⅠ酶切位點），以前期獲得的感染性克隆載體pI-MVC為模板擴增VP1 5'端獨特區(qū)基因片段（396 nt）。擴增條件：95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸35 s，共30個循環(huán)；最后72℃延伸10 min?；厥詹⒓兓疨CR片段，將純化產(chǎn)物和pET32a（+）優(yōu)化載體經(jīng)EcoRⅠ/XhoⅠ雙酶切并膠回收后連接轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中。挑選陽性單克隆菌落，提取質(zhì)粒，雙酶切鑒定，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.3 重組蛋白的表達及純化采用電轉(zhuǎn)化法將構(gòu)建的原核表達重組質(zhì)粒pET32a-VP1N轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細胞中，將菌液涂布LB固體培養(yǎng)基后置于37℃溫箱孵育；次日，挑取陽性單克隆至LB培養(yǎng)液（氨芐青霉素抗性）中培養(yǎng)；然后按1∶100擴增培養(yǎng)至吸光度值為0．7～0．8。取1 mL培養(yǎng)物作為未誘導陰性對照組。經(jīng)終濃度為0．25 mmol/L的IPTG誘導，37℃震蕩培養(yǎng)4 h。于4℃條件下10 000×g離心收集誘導表達培養(yǎng)物。通過10%SDSPAGE電泳分析目的蛋白的表達情況，并用鎳柱純化融合蛋白。蛋白定量測定后于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 免疫動物選取2．0 kg左右健康新西蘭大白兔，取500 μg的純化融合蛋白用PBS稀釋后與等體積的弗氏完全佐劑充分混合，于家兔足部、背部皮下多點注射。2周后再以相同劑量的蛋白與弗氏不完全佐劑充分混合，進行加強免疫；4周后，每隔7 d取250 μg純化蛋白加強免疫1次，隨后處死兔子取全血，分離抗血清，進行Protein A和去交叉的His柱純化。

1.5 抗血清純化從冰箱取出Protein A柱和去交叉的His柱，室溫放置幾分鐘后用5倍柱體積的二級水過柱及相同體積的20 mmol/L的磷酸鈉溶液（pH7．0）平衡柱子。離心好的血清過Protein A柱，經(jīng)10倍柱體積的20 mmol/L的磷酸鈉溶液（pH7．0）洗柱后，用4倍柱體積100 mmol/L的甘氨酸（pH2．5）洗脫柱子，收集洗脫液并用0．2倍柱體積1 mol/L Tris-HCl（pH9．0）充分混勻。然后洗脫液（約8．4 mL）過His交叉柱，收集洗脫液，此為純化后目的抗體溶液。加入等體積的甘油后分裝，于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 ELISA法測定多抗效價已純化的蛋白抗原包被濃度1 μg/mL，多肽抗原包被濃度 4 μg/mL。1%BSA封閉。將純化的多克隆抗體血清分別按1∶3125、1∶6250、1∶12 500、1∶25 000、1∶50 000、1∶100 000、1∶200 000、1∶400 000、1∶800 000、1∶1 600 000的倍數(shù)稀釋后，一抗37℃孵育1 h，二抗37℃孵育45 min。加顯色液反應15 min，終止反應后測定450 nm處的吸光度值。

1.7 Western blot檢測VP1N抗體的特異性WRD細胞感染MVC病毒48 h后，提取蛋白后進行SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將PVDF膜于5%脫脂奶粉封閉，室溫封閉1 h；PBST洗滌3次，每次5 min；分別加入制備的VP1抗體（VP1N，1∶2000）和VP2抗體（即VP1C，1∶2000，實驗室先期制備的抗體），4℃孵育過夜；PBST洗滌3次，每次5 min；然后將PVDF膜轉(zhuǎn)移到山羊抗兔的二抗孵育液（1∶400）中，在室溫條件下孵育1 h，PBST洗滌3次，每次5 min。用ECL化學發(fā)光法進行檢測。

1.8 免疫熒光法鑒定VP1N抗體特異性用6孔板（含有蓋玻片）進行WRD細胞培養(yǎng)及爬片，待細胞貼壁后加入MVC感染，同時設置MVC未感染組（陰性對照組）。感染48 h后，吸掉培養(yǎng)液并用PBS清洗細胞3次，加入冰冷的細胞固定液（丙酮和甲醇1∶1混合），室溫固定10 min。隨后PBS洗滌3次，每次10 min；加入0．5%的TritonX-100作用10 min；PBS洗滌3次，每次10 min；山羊血清于37℃封閉20 min；以純化的兔抗VP1多克隆抗體作為一抗（1∶50），37℃孵育2 h；PBS洗滌3次，每次10 min；加FITC標記的山羊抗兔IgG（1∶50），室溫避光孵育1 h；DAPI染色10 min，封片后在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pET-32a ( + ) -VP1N的酶切鑒定重組質(zhì)粒pET-32a（+）-VP1N經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，在400 bp大小位置可見清晰的條帶，表明VP1N基因片段成功插入到pET32a（+）載體中，同時經(jīng)測序鑒定，證實重組質(zhì)粒pET-32a（+）-VP1N構(gòu)建成功（圖1）。

圖1 重組質(zhì)粒pET-32a (+) -VP1N的酶切鑒定Fig.1 Identification of recombinant plasmid pET-32a(+)-VP1N by enzyme

2.2 目的蛋白的誘導表達及純化重組表達質(zhì)粒pET-32a（+）-VP1N在大腸桿菌中經(jīng)I PTG誘導后，經(jīng)SDS-PAGE電泳在34 kDa處出現(xiàn)一條明顯的蛋白條帶，大小與融合蛋白的理論值一致，而未誘導的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌在相應的位置未出現(xiàn)相同的條帶。擴大培養(yǎng)并進行誘導后，超聲破碎后離心分離沉淀和上清液，SDS-PAGE電泳可知重組蛋白主要以可溶性的形式存在于上清液中。利用Ni-NTA親和層析柱純化融合蛋白，得到單一條帶（圖2）。

圖2 SDS-PAGE檢測VP1N重組蛋白的表達和純化Fig.2 Expression and purification of fusion protein of VP1N detected by SDS-PAGE

2.3 VP1N抗血清效價測定以免疫前新西蘭大白兔血樣標本的血清作為對照。用ELISA法測定多克隆抗體效價，結(jié)果表明，VP1N抗體效價可達1∶1 600 000（表1）。

表1 ELISA法檢測VP1N蛋白抗血清效價Table 1 Titers of anti-VP1N serum detected by ELISA

2.4 Western blot法檢測VP1N多克隆抗體特異性病毒VP1基因位于MVC基因組的第3081～5192 nt，VP2基因位于MVC基因組的第3477～5192 nt（圖3A）。因此，VP1和VP2基因?qū)儆诤邢嗤蛄械幕?，VP1較VP2基因在病毒基因組5'端長396 nt，編碼132個氨基酸；除此外，VP1和VP2的其他基因序列及氨基酸序列完全一致，編碼571氨基酸。本次研究擴增VP1基因5'端獨特區(qū)的396 nt核苷酸序列，并成功構(gòu)建pET-32a(+)-VP1N重組載體，免疫新西蘭大白兔后得到的VP1抗體（即VP1N抗體）僅可特異性識別病毒VP1蛋白，不識別VP2蛋白。前期我們以VP1/VP2蛋白的C端構(gòu)建重組體并制備了VP2抗體（即VP1C抗體），此抗體能夠同時識別病毒的VP1和VP2蛋白（圖3A）。通過Western blot檢測VP1 N端抗體和VP1 C端抗體的特異性，結(jié)果顯示，MVC感染W(wǎng)RD細胞后，VP1C抗體檢測到兩條特異性條帶，大小分別為81 kDa和63 kDa，與病毒VP1和VP2結(jié)構(gòu)蛋白大小一致；VP1N抗體只在81 kDa處可以清晰地看到一條特異性條帶，與VP1蛋白大小一致，VP1C抗體可以同時識別VP1和VP2兩種結(jié)構(gòu)蛋白。研究結(jié)果表明，此次制備的VP1N抗體僅識別VP1蛋白，具有非常高的特異性。

圖3 VP1N抗體靶向序列及Western blot特異性分析Fig.3 VP1 antibody targeting sequence and specificity analysis of VP1N polyclonal antibodies

2.5 免疫熒光法檢測VP1N抗體特異性MVC感染W(wǎng)RD細胞24 h后，利用PBS緩沖液清洗細胞，固定后采用免疫熒光技術(shù)分析VP1N抗體活性。結(jié)果顯示，在MVC感染組中，出現(xiàn)特異性的綠色熒光（主要定位于細胞核中），未感染組中未見綠色熒光。結(jié)果說明，VP1N多克隆抗體能夠與VP1蛋白發(fā)生特異性反應，進一步說明VP1N多克隆抗體具有較高的特異性（圖4）。

圖4 免疫熒光法檢測VP1N多克隆抗體的特異性Fig. 4 Specificities of VP1N ployclonal antibodies analyzed by immunofluorescence assay

3 討論

博卡病毒為最早于1967年從一只健康的德國牧羊犬的糞便樣本中發(fā)現(xiàn)并分離得到的一種細小病毒[9]。此后，在亞洲國家的韓國、日本以及中國上海發(fā)現(xiàn)MVC感染的病例報道[10]。目前，關于MVC感染分布與犬類疾病的相關性尚未完全闡明。早期的研究發(fā)現(xiàn)，MVC作為新生幼犬和犬胚胎期感染疾病的重要致病原，感染后可導致流產(chǎn)、出生畸形，甚至胚胎死亡和再吸收[11-13]。同時也有研究者認為，MVC感染引起疾病可能與產(chǎn)生免疫抑制有關，發(fā)現(xiàn)患病犬出現(xiàn)包括單核細胞吞噬功能明顯減少、病毒血癥、肺泡細胞肥大和增生的間質(zhì)性肺炎、水腫、壞死和炎癥等癥狀[14-16]。近來也有研究發(fā)現(xiàn)，MVC感染與犬的神經(jīng)性疾病和嚴重的胃腸炎疾病有關[17-18]。隨著人民生活水平的提高，越來越多的家庭開始養(yǎng)寵物，尤其以家犬較多。因此，針對家犬中博卡病毒感染的檢測、治療值得大家關注。

在前期研究中，本課題組成功獲得了MVC基因組包含的兩個末端發(fā)夾回文結(jié)構(gòu)在內(nèi)的全部堿基序列（5402 nt），并首次成功構(gòu)建了博卡病毒MVC感染性克隆載體pI-MVC，分析了MVC編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NS2和NP1基因在基因組中的基本結(jié)構(gòu)特點、轉(zhuǎn)錄特性及基本功能[6]。結(jié)構(gòu)蛋白VP1位于MVC基因組核酸序列的第3081～5192 nt位，含有2112個堿基，翻譯編碼704個氨基酸，蛋白質(zhì)的分子量約為81 kDa；結(jié)構(gòu)蛋白VP2位于MVC基因組的第3477～5192 nt位，含有1716個堿基，翻譯編碼571個氨基酸，蛋白質(zhì)的分子量約為63 kDa。MVC病毒的VP1和VP2基因序列也屬于重復基因序列，VP1基因較VP2基因在5'端長396 nt，多編碼132個氨基酸，其他基因序列和氨基酸序列與VP2完全一致，編碼571氨基酸。我們前期研究中，針對VP1近C端的300氨基酸序列制備了多克隆抗體[19]，由于VP1和VP2蛋白C端氨基酸序列是完全一樣，靶向VP1C的抗體能夠同時特異性的識別VP1和VP2兩種蛋白質(zhì)，因此，我們在前期研究中針對VP1近C端的300個氨基酸序列制備了多克隆抗體，可以同時識別VP1和VP2蛋白（圖3）。本次研究中，我們針對VP1蛋白N端特異的132個氨基酸序列進行克隆，并成功構(gòu)建原核表達載體，通過誘導表達、純化融合蛋白，免疫新西蘭大白兔后得到可特異性識別VPI蛋白的高滴度多克隆抗體VP1N，效價達到1∶1 600 000。同時，通過Western blot檢測抗體的反應性和特異性可知，VP1N抗體僅能識別VP1蛋白，而與VP2蛋白沒有反應，由此說明制備的VP1N抗體具有非常好的抗體活性和特異性。同時，應用免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，VP1N抗體同樣能夠特異性檢測到MVC感染的WRD細胞中VP1 蛋白的表達。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建犬博卡病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1獨特區(qū)的原核表達載體，制備的VP1N多克隆抗體具有非常好的抗體活性和特異性。該研究結(jié)果為進一步加深對博卡病毒感染、致病機制及VP1基因功能等的研究提供了實驗基礎和理論支持。