龐琳琳 ，趙秋華 ，王 欣 ，張俊杰 ，郭 爽 ，李蓓蓓 ，劉 珂 ，邵東華 ，邱亞峰 ，馬志永 ，袁萬(wàn)哲，魏建超

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，保定 071001；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；3.上海市閔行區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海 201109）

德國(guó)科學(xué)家Glaserser發(fā)現(xiàn)一種與纖維素關(guān)節(jié)炎和漿膜炎相關(guān)的革蘭氏陰性菌，1922年由Schermer和Ehrlich首次分離得到，1943年Hj?rre和Wramby將此種微生物命名為副豬嗜血桿菌[1-2]。副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，HPS）是一種無(wú)鞭毛缺乏運(yùn)動(dòng)性，可形成莢膜和菌毛樣結(jié)構(gòu)，非溶血性，且生長(zhǎng)十分嬌嫩依賴生長(zhǎng)因子煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）的革蘭氏陰性菌[1-2]；從豬體內(nèi)分離的HPS通常是帶莢膜的，體外培養(yǎng)幾代后莢膜消失，在TSA上培養(yǎng)形成白色半透明的圓形菌落，與金黃色葡萄球菌一起培養(yǎng)產(chǎn)生“衛(wèi)星”現(xiàn)象[3-4]。作為一種存在于豬上呼吸道的條件性致病菌，可引起嚴(yán)重的全身性疾病，即以纖維性多漿膜炎，關(guān)節(jié)炎和腦膜炎或急性肺炎和急性敗血癥為特征的Glsser病[4-6]。根據(jù)Kielstein and Rapp-Gabrielson（KRG）試驗(yàn)，把已分離出來(lái)的HPS進(jìn)行血清型分型，共分為15種血清型，且發(fā)現(xiàn)其毒力明顯不同[7]，其中血清型1、5、10、12、13、14和15型毒力較強(qiáng)[8]，有時(shí)死亡率高達(dá)50%；而我國(guó)主要的流行株為4型和5型，其次為12型和13型[9-10]。

HPS是豬呼吸道疾病的常見(jiàn)病原體之一，常與其他病原體如豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）、猴免疫缺陷病毒（Simian immunodeficiency，SIV）、多殺巴斯德菌（Pasteurella multocida）、胸膜肺炎放線桿菌（Antinobacillus pleuropneumoniae）和豬肺炎支原體（Mycoplasma hyop neumoniae）等混合感染引發(fā)更為嚴(yán)重的全身性炎癥[11-14]，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。與上述病原體發(fā)生共感染時(shí)，可以從患有肺炎豬的肺組織中分離到HPS[15]。目前該病菌在體內(nèi)各組織中的分布規(guī)律及在血液和不同組織中的載量的變化尚未見(jiàn)報(bào)道。鑒于該菌株的日益流行，使得對(duì)該病菌在體內(nèi)各組織中的感染狀況及其排毒規(guī)律等研究成為一種必要。本研究觀測(cè)了HPS感染仔豬臨床癥狀（體溫、體重、精神、食欲等），應(yīng)用SYBR Green Ⅱ熒光定量PCR的方法檢測(cè)了菌體在鼻黏膜和血液中動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，分析了HPS在仔豬各組織中的分布情況，為該病的發(fā)病機(jī)理及臨床診斷提供理論依據(jù)，更為今后該病的防控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與菌株20頭28日齡健康斷奶仔豬購(gòu)自上海市崇明縣某豬場(chǎng)。購(gòu)進(jìn)前采集40頭仔豬血液和鼻拭子，對(duì)豬瘟病毒（Classical swine feler virus，CFSV）、偽狂犬病病毒（Pseudorabies vivus，PRV）、豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus，PCV2）、PRRSV和HPS進(jìn)行了PCR檢測(cè)和ELISA檢測(cè)，選擇CFSV、PRV、PCV2、PRRSV抗原陰性、HPS抗原和抗體均為陰性的豬為實(shí)驗(yàn)對(duì)照。血清13型HPS（W2）由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所豬呼吸道傳染病研究團(tuán)隊(duì)分離、鑒定并保存。攻毒菌株的復(fù)壯：將血清13型HPS W2株接種到TSB（5%新生牛血清，10 ng/mL NAD）液體培養(yǎng)接種；37℃、220 rpm搖床培養(yǎng)；OD值達(dá)到0．4～0．6時(shí)，2794×g離心5 min收獲菌體沉淀；加入適量的PBS重懸菌株，2794×g離心5 min，洗滌3次后，加入一定量的PBS，使菌液濃度約為1×106CFU/mL。

1.2 主要試劑胰胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA培養(yǎng)基）和胰胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB培養(yǎng)基）均購(gòu)自英國(guó)的OXOID公司；新生牛血清購(gòu)自浙江天杭生物科技股份有限公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）、2×TaqPCR Master Mix購(gòu)自天根生化科技（上海）有限公司；SYBR Green ExTaqⅡ及DNA膠回收試劑盒均購(gòu)自寶生物（大連）有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒、DL2000 DAN marker及質(zhì)粒抽提試劑盒均購(gòu)自天根生化科技（上海）有限公司。

1.3 引物的設(shè)計(jì)參照GenBank中HPS全基因組中特異性保守序列設(shè)計(jì)1對(duì)引物，擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度為275 bp。HPS-qF：5'-ACAACCTGCAAGTACTTA TCGGGAT-3'，HPS-qR：5'-TAGCCTCCTGTCTG ATATTCCCACG-3'， 引物由生工生物（上海）股份有限公司合成。

1.4 動(dòng)物分組與處理仔豬被隨機(jī)分成高劑量組、中劑量組、低劑量組和對(duì)照組，每組5頭，各組均用滴鼻方式感染；分圈嚴(yán)格隔離飼養(yǎng)，均提供全價(jià)優(yōu)質(zhì)飼料飼喂，1周后開(kāi)始試驗(yàn)。HPS滴鼻高劑量感染組鼻腔接種2 mL/頭的HPS W2株（2×106CFU/mL），HPS滴鼻中劑量感染組鼻腔接2mL/頭的HPS W2株（2×105CFU/mL），HPS滴鼻低劑量感染組鼻腔接種2mL/頭的HPS W2株（2×104CFU/mL），對(duì)照組每頭仔豬腹腔注射和鼻腔接種等量生理鹽水。此后每日觀察試驗(yàn)組的運(yùn)動(dòng)、呼吸、采食和飲水，連續(xù)觀察20 d。在感染后的第4、8、12、16、20 d測(cè)量直腸體溫并采集各組豬鼻拭子及血液，在攻毒后第12、20 d分別采用安樂(lè)死方式處死全部試驗(yàn)豬，剖檢，觀察各臟器的病理變化，收集扁桃體、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腹部淋巴結(jié)、氣管以及腦等組織。

1.5 樣品中HPS的分離鑒定取上述樣品的一部分進(jìn)行HPS的病原分離，對(duì)分離到的疑似HPS按照文獻(xiàn)進(jìn)行PCR檢測(cè)，同時(shí)對(duì)部分陽(yáng)性核酸樣品進(jìn)行測(cè)序分析。

1.6 樣品處理與熒光定量PCR檢測(cè)每個(gè)鼻拭子樣品中加入500 μL無(wú)菌PBS渦旋均勻；實(shí)質(zhì)性器官按照質(zhì)量與體積比為1∶1的比例加入無(wú)菌PBS并對(duì)各組織進(jìn)行研磨。取200 μL血液或前述組織上清液，按照細(xì)菌基因組提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取基因組DNA，按照本實(shí)驗(yàn) 室已建立的HPS熒光定量PCR檢測(cè)方法，各樣品中HPS載量與分布進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品進(jìn)行3個(gè)平行試驗(yàn)，同時(shí)設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線，換算出各組織中HPS的拷貝數(shù)。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)應(yīng)用IBM SPSS Statistics 20軟件和Excel對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析。

2 結(jié)果

2.1 HPS感染豬的臨床癥狀及剖檢變化在試驗(yàn)期間對(duì)照組的豬只未發(fā)現(xiàn)臨床癥狀。3個(gè)試驗(yàn)組的豬在感染HPS后均未出現(xiàn)死亡，但感染HPS的高、中劑量組的豬相對(duì)于對(duì)照組生長(zhǎng)速度明顯減緩，被毛粗亂。攻毒后第4 d，高劑量HPS感染組個(gè)別豬只出現(xiàn)精神沉郁；攻毒后第8 d，高、中劑量HPS感染組部分豬表現(xiàn)出食欲不振、呼吸困難；攻毒 后第12 d，高劑量HPS感染組個(gè)別豬只厭食、流涕、咳嗽以及大聲喘氣等明顯癥狀；攻毒后第16 d，咳嗽和喘氣癥狀逐漸好轉(zhuǎn)；20 d后癥狀消除，采食、飲水和排泄均正常。

攻毒后12 d和20 d，對(duì)出現(xiàn)明顯HPS臨床癥狀的部分豬進(jìn)行剖解，發(fā)現(xiàn)高劑量HPS感染組部分豬全身淋巴結(jié)腫大，特別是頜下淋巴結(jié)腫大明顯，部分肺臟呈現(xiàn)淤血，氣管內(nèi)有膿性分泌物，其他臟器均未見(jiàn)明顯肉眼病變；而對(duì)照組正常。

2.2 HPS感染豬體溫變化由圖1可知，對(duì)照組體溫?zé)o明顯變化。從第4 d開(kāi)始，攻毒組部分豬只在攻毒后體溫變化明顯，大部分豬只均出現(xiàn)發(fā)熱癥狀，體溫高于對(duì)照組，并隨時(shí)間延長(zhǎng)持續(xù)升高，特別是高劑量感染組豬平均體溫較其他組略升高1～2℃，第12 d時(shí)達(dá)到最高值，為40．9℃，顯著高于對(duì)照組；第16 d各攻毒組體溫逐漸下降；此后趨于正常。

圖1 各組平均體溫的變化Fig.1 Mean rectal temperature of pigs in each group

2.3 HPS經(jīng)鼻腔感染后在豬各組織中分布采用HPS熒光定量PCR方法檢測(cè)HPS感染豬后各組織中HPS的分布由結(jié)果可知，HPS在氣管、扁桃體、頜下淋巴結(jié)的檢出率為100%，其次是肺臟、腹骨淋巴結(jié)，在心臟、肝臟、脾臟僅有高劑量感染組個(gè)別豬只檢出，而在腎臟和腦組織中未檢出。對(duì)照豬只各器官均未檢測(cè)到HPS（表1）。

表1 HPS感染后在豬各組織中的分布Table 1 Distribution of HPS in pig tissues after infection

進(jìn)一步對(duì)高劑量感染組豬各組織中HPS載量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在攻毒后12 d發(fā)病豬肺臟HPS載量最高，肺組織中載量較高，其次為氣管、扁桃體、頜下淋巴結(jié)、腹股溝淋巴結(jié)、心臟、肝臟、脾臟（圖2）。

圖2 HPS感染后在豬各組織中的載量分析Fig.2 HPS load in pig tissues after infection

2.4 HPS感染后豬血液和鼻拭子中HPS載量的動(dòng)態(tài)變化在HPS感染后第4、8、12、16、20 d采各組豬鼻拭子和血液，采用HPS熒光定量PCR方法檢測(cè)HPS感染后豬 血液和鼻拭子中HPS載量。各組豬只血液中均未檢測(cè)到HPS。然而，豬只感染HPS后第8-20 d在鼻拭子中可檢測(cè)到HPS，且 高劑量感染組豬HPS載量顯著高于其他組（P＜0．05）（圖3），其中感染后12 d HPS載量達(dá)到最高值，表明HPS可以定殖在呼吸道，而且持續(xù)存在排毒，并表現(xiàn)為無(wú)規(guī)律排毒。

圖3 HPS感染后豬鼻拭子中HPS載量的動(dòng)態(tài)變化Fig.3 Dynamic changes of HPS load in nasal swabs of pigs after HPS infection

2.5 樣品中HPS的分離鑒定對(duì)上述部分HPS陽(yáng)性樣品接種到TSA培養(yǎng)基上進(jìn)行HPS的 病原分離，從鼻拭子、氣管分泌物、肺臟、淋巴結(jié)等組織中分離到9株疑似HPS菌株，采用PCR方法對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步鑒定，在1%瓊脂糖凝膠中電泳中，可見(jiàn)一條275 bp的目的條帶（圖4），大小與預(yù)期結(jié)果相符，選擇一部分進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，均與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中HPS參考毒株一致，證明從發(fā)病豬分離的病原體為HPS。

圖4 疑似HPS菌株的PCR鑒定Fig.4 Identification of suspected HPS isolates by PCR

3 討論

HPS是一種存在于上呼吸道的條件致病菌，可通過(guò)呼吸系統(tǒng)傳播，常常作為一種繼發(fā)性細(xì)菌和多種病原體混合感染，引發(fā)更為嚴(yán)重的全身性疾病，使豬群死亡率增加，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失[19]。一般應(yīng)用藥物和疫苗兩種方法對(duì)HPS引起的疾病進(jìn)行防控，但HPS的血清型眾多，各血清型之間交叉免疫保護(hù)現(xiàn)象較弱，臨床中還有大量的HPS并未得到分離[16]；且隨著抗生素在豬產(chǎn)業(yè)的廣泛應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)豬體對(duì)一些抗生素的耐藥性逐漸增加；以上原因?yàn)榕R床上對(duì)HPS的防控帶來(lái)了具體的挑戰(zhàn)[17]。因此，了解HPS在仔豬機(jī)體內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程、排毒、各組織中的分布等情況，可以為HPS致病機(jī)理及防控的研究奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

本研究觀測(cè)了HPS感染仔豬臨床癥狀（體溫、體重、精神、食欲等），應(yīng)用SYBR Green Ⅱ熒光定量PCR的方法檢測(cè)了菌體在鼻黏膜和血液中動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，分析HPS在仔豬各組織中分布情況。研究發(fā)現(xiàn)，高劑量組臨床癥狀相較于其他組更為明顯；由圖1可見(jiàn)，高劑量組的平均體溫明顯高于其他各組，且在感染后的第12 d時(shí)最高，然后緩慢下降。在感染的第8～20 d時(shí)高劑量組鼻拭子中HPS的載量顯著的高于各組（P＜0．05），在感染后的第12 d時(shí)排毒量達(dá)到最高（圖3）；從低、中劑量組鼻黏膜內(nèi)的排毒情況來(lái)看，HPS可以定殖在呼吸道中且出現(xiàn)了持續(xù)性排毒的情況，但并不存在一定的排毒規(guī)律性，這一結(jié)果符合Pomorska-Mól等[18]研究的HPS和SIV混合感染時(shí)HPS增殖過(guò)程。通過(guò)檢測(cè)HPS在各組織中分布發(fā)現(xiàn)，HPS主要定殖在氣管、扁導(dǎo)體、淋巴結(jié)、肺組織中，此結(jié)論為HPS新型菌株的分離提供了思路。