王風(fēng)波，唐明薇，王科，王瓊芬，王寶蘭

腦出血患者往往遺留嚴重的神經(jīng)行為功能障礙，活動能力低下，社會參與受限，給其家庭和社會帶來一定的負擔(dān)[1]。自噬是真核細胞自我分解代謝蛋白質(zhì)、衰老細胞器并再利用的重要途徑，以維持機體平衡和生存[2]。研究顯示，多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展均有自噬的參與，其表現(xiàn)為活性及相關(guān)基因的異常表達，如缺血缺氧性等腦損傷，自噬的激活可明顯降低神經(jīng)細胞死亡率，被視為自噬機制對神經(jīng)細胞的保護作用[3]。Beclin-1是主要自噬標記物之一，不但是衡量自噬活性或水平的重要方法，而且對自噬過程及程度的調(diào)節(jié)起著重要作用。本研究采用高壓氧聯(lián)合早期康復(fù)訓(xùn)練對腦出血大鼠進行干預(yù)，觀察大鼠海馬區(qū)腦細胞Beclin-1陽性表達及神經(jīng)行為學(xué)的變化，旨在探討高壓氧聯(lián)合早期康復(fù)訓(xùn)練對腦出血后自噬相關(guān)蛋白活性的影響作用，以及自噬相關(guān)蛋白活性與神經(jīng)行為學(xué)改變的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料 ①動物與分組：健康成年雄性SD大鼠55只，體質(zhì)量240～280g，由成都醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供[SYXK(川)2015-196]，按隨機數(shù)字表法分為空白組、非干預(yù)模型組、高壓氧組、康復(fù)訓(xùn)練組、聯(lián)合干預(yù)組，每組各10只，備用大鼠5只。所有大鼠均常規(guī)飼養(yǎng)，實驗過程遵循國家有關(guān)實驗動物使用準則。②主要儀器及試劑：小動物顱骨鉆、腦立體定位儀(玉研科技)，高壓氧實驗艙(煙臺宏遠)，Ⅶ型膠原酶、Beclin-1兔多克隆抗體及鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(strept avidin-biotin complex，SABC)試劑盒(武漢博士德)、山羊抗兔工作液(北京中杉金橋)、數(shù)碼三目攝像顯微鏡(麥克奧迪)、圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0(美國Media Cybernetics)。

1.2 方法 ①腦出血模型制備：稱重后腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，頭部向上固定于腦立體定位儀，前囟區(qū)備皮，消毒，鉆孔定位左側(cè)尾狀核：前囟后1.0mm矢狀線左側(cè)3mm處，顱骨鉆鉆孔后進針5mm，微量注射器設(shè)置5min，緩慢注入膠原酶Ⅶ型溶液0.5U，留針10min，緩慢退針[4]。實驗過程中保持室溫25±2℃?？瞻捉M不予任何處置。模型制備成功標準：術(shù)后次日，大鼠清醒，神經(jīng)行為學(xué)Longa評分≥2分。②干預(yù)方法：a.高壓氧：術(shù)后第3天開始，高壓氧組、聯(lián)合干預(yù)組大鼠每天按時置入高壓氧實驗艙，先純氧洗艙10min至艙內(nèi)氧濃度達(90±2)%，20min勻速加壓，至2.0個絕對大氣壓后穩(wěn)壓吸純氧40min(氧流量2L/min)，再20min勻速減壓出艙[5]。1次/d，連續(xù)14d。空白組、模型組大鼠不予高壓氧干預(yù)。b.早期康復(fù)訓(xùn)練：術(shù)后第3天開始，康復(fù)訓(xùn)練組、聯(lián)合干預(yù)組大鼠進行以下訓(xùn)練[6]：細毛牙刷從頭至尾勻速刷動；網(wǎng)屏訓(xùn)練在尺寸60×60cm，網(wǎng)格1cm2，距地面約50cm處，訓(xùn)練大鼠四肢抓握；跑籠為圓形，直徑40cm，內(nèi)徑8cm，訓(xùn)練大鼠籠內(nèi)奔跑；平衡木的尺寸120cm×4cm，水平置于地面上方40cm處，訓(xùn)練大鼠在平衡木上行走，下方鋪以軟墊保護大鼠。所有訓(xùn)練均10min/次，1次/d，連續(xù)14d。空白組、模型組大鼠不予任何康復(fù)訓(xùn)練。

1.3 評定標準 ①神經(jīng)行為學(xué)Longa評分：4分為神經(jīng)功能嚴重受損，自發(fā)行走能力缺失；3分為向?qū)?右)側(cè)傾倒，行走困難；2分為行走時向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；1分為不能充分伸展對側(cè)上肢，但可自由行走；0分為無神經(jīng)功能缺失癥狀[7]。②免疫組織化學(xué)Beclin-1檢測：干預(yù)7d及14d，Longa評分結(jié)束后，每組隨機各取5只大鼠麻醉后斷頭取腦，4%多聚甲醛液固定，右側(cè)海馬區(qū)腦組織石蠟包埋切片，每例組織取4張厚度約5μm切片。采用SABC法行免疫組織化學(xué)Beclin-1檢測：切片按步驟磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)沖洗及滴加山羊血清封閉液，室溫20min，滴加一抗(兔多克隆抗體，工作濃度1∶100)，4℃過夜，滴加生物素化二抗，37℃ 30min，PBS水洗3次，每次5min；PBS代替一抗為陰性對照，二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzidine，DAB)顯色[8]。光鏡下陰性細胞呈藍色，底物呈白色，陽性細胞呈黃色或棕黃色，Beclin-1陽性產(chǎn)物主要分布在細胞質(zhì)及細胞間質(zhì)。每張切片400倍光鏡下隨機選取4個視野，視野互不疊加，采集陽性細胞圖像的光密度(optical density，OD)，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測定所采集全部圖像的光密度和面積，計算每張圖像的平均光密度(average optical density，AOD)，并得出每例樣本的平均光密度。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)行為學(xué)Longa評分 造模大鼠死亡及Longa評分<2分各1只，剔除后隨機補充2只大鼠，以相同方法造模成功。干預(yù)7d和14d后，高壓氧組、康復(fù)訓(xùn)練組、聯(lián)合干預(yù)組大鼠Longa評分較非干預(yù)模型組同時間點比較均明顯下降(均P<0.05)，康復(fù)訓(xùn)練組和聯(lián)合干預(yù)組較高壓氧組組同時間點比較，Longa評分均更低(均P<0.05)，聯(lián)合干預(yù)組較康復(fù)訓(xùn)練組同時間點比較，Longa評分均更低(均P<0.05)。干預(yù)14d后，高壓氧組、康復(fù)訓(xùn)練組、聯(lián)合干預(yù)組的Longa評分均較干預(yù)7d時更低(均P<0.05)。見表1。

表1 4組大鼠Longa評分比較 分，

2.2 免疫組化檢測情況 如圖1，干預(yù)7d和14d后，非干預(yù)模型組大鼠右側(cè)海馬區(qū)腦細胞Beclin-1陽性反應(yīng)較空白組同時間點比較均顯著增強(均P<0.01)，高壓氧組、康復(fù)訓(xùn)練組、聯(lián)合干預(yù)組大鼠腦Beclin-1陽性反應(yīng)較非干預(yù)模型組同時間點比較均明顯下降(均P<0.05)，聯(lián)合干預(yù)組的下降幅度均大于高壓氧組和康復(fù)訓(xùn)練組(均P<0.05)，高壓氧組與康復(fù)訓(xùn)練組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。干預(yù)14d后，高壓氧組、康復(fù)訓(xùn)練組、聯(lián)合干預(yù)組Beclin-1表達水平均較干預(yù)7d時進一步下降(均P<0.05)。見表2。

a.非干預(yù)模型組(細胞質(zhì)及間質(zhì)陽性反應(yīng)顯著增強) b.高壓氧組(陽性反應(yīng)下降)

c.康復(fù)訓(xùn)練組(陽性反應(yīng)下降) d.聯(lián)合干預(yù)組(陽性反應(yīng)顯著下降)

表2 5組大鼠右側(cè)海馬區(qū)Beclin-1表達(AOD值)比較

3 討論

Beclin-1蛋白包含有450個氨基酸序列，是對自噬的發(fā)生、發(fā)展起著重要的調(diào)控作用的相關(guān)基因，同時也是檢測自噬程度的的主要標志因子之一[10]。本研究采用微量膠原酶Ⅶ型注入大鼠尾狀核區(qū)域，模擬人腦出血病程，誘發(fā)腦出血，神經(jīng)行為學(xué)Longa評分均≥2分，神經(jīng)功能明顯缺失，造模成功。相較空白組，模型組大鼠腦Beclin-1表達水平顯著增強，提示腦出血后腦細胞自噬機制激活，且反應(yīng)強烈。自噬是細胞依賴溶酶體途徑的自我降解過程[11]，生理狀態(tài)下對維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)有重要作用[12]，在受到損傷、缺氧缺血等應(yīng)激情況下，自噬機制啟動可降解和清除受損的細胞器、蛋白質(zhì)以維持正常細胞供能，提高細胞的抗損能力，一定程度上對細胞起著保護作用，但受到嚴重傷害性刺激而過度激活的自噬則可能促進細胞死亡，損傷機體[13]。近年來，自噬在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用得到廣泛研究和驗證。有研究顯示自噬在腦損傷過程中呈時間相關(guān)性作用，因溶酶體功能障礙所致的自噬體清除功能失常，與神經(jīng)元的死亡密切相關(guān)[14]。缺血性腦損傷后自噬機制如受到破壞或抑制，會導(dǎo)致失活細胞器及蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)積聚，引發(fā)神經(jīng)元死亡，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激反應(yīng)和自噬機制的激活則有利于腦損傷的緩解[15]。有學(xué)者應(yīng)用糖苷類藥物干預(yù)大腦中動脈閉塞模型大鼠，抑制過度激活的自噬機制，減少神經(jīng)元死亡，證實了通過抑制過度自噬可保護神經(jīng)細胞[16]。

從造模后第3天開始，給予高壓氧組、康復(fù)組、聯(lián)合干預(yù)組大鼠高壓氧治療和(或)康復(fù)訓(xùn)練，時機上處于腦出血急性期，契合超早期康復(fù)理念。治療進程中觀察到大鼠的精神狀態(tài)、反應(yīng)力、活動、進食等逐步改善。高壓氧干預(yù)方案參照了人類普遍治療模式，即勻速加壓至2.0個絕對大氣壓后穩(wěn)壓持續(xù)低流量吸純氧40 min，再勻速減壓，從入艙到出艙共80 min。結(jié)果顯示，高壓氧治療7d和14d，高壓氧組大鼠不但Longa評分均明顯低于非干預(yù)模型組，而且右側(cè)海馬區(qū)腦細胞免疫組化Beclin-1陽性反應(yīng)亦較非干預(yù)模型組明顯降低。組內(nèi)比較，14d的評分及檢測結(jié)果優(yōu)于7d。說明高壓氧治療可有效降低腦細胞自噬相關(guān)蛋白表達，調(diào)節(jié)過度激活的自噬機制，改善腦出血大鼠的神經(jīng)行為學(xué)功能，兩者呈正相關(guān)性，隨著療程的延長，治療作用可進一步顯著表現(xiàn)。高壓氧調(diào)節(jié)腦細胞自噬機制可能與高壓氧改善腦細胞氧代謝，清除氧自由基，抑制炎性及變態(tài)反應(yīng)，調(diào)節(jié)腦微循環(huán)等有關(guān)[17-18]。

康復(fù)訓(xùn)練在腦出血的干預(yù)方面已有較多研究，大多應(yīng)用于腦出血恢復(fù)期，此期病情穩(wěn)定，相對較為安全，但在腦出血超早期介入的方面少有報道[19-21]。對處于腦出血急性期的大鼠予軟毛刷本體感覺刺激、跑籠、平衡木及網(wǎng)屏等康復(fù)訓(xùn)練措施，40min/次，1次/d，全程無大鼠死亡或病情加重現(xiàn)象。訓(xùn)練7d和14d后，康復(fù)訓(xùn)練組大鼠Longa評分均明顯低于非干預(yù)模型組，右側(cè)海馬區(qū)腦細胞Beclin-1陽性反應(yīng)亦較非干預(yù)模型組明顯下降，組內(nèi)比較，14d的評分及檢測結(jié)果優(yōu)于7d。組間比較，康復(fù)訓(xùn)練組的Longa評分甚至優(yōu)于高壓氧組。說明腦出血超早期康復(fù)介入可安全有效地降低腦細胞自噬相關(guān)蛋白表達，調(diào)節(jié)過度活躍的自噬水平，改善神經(jīng)行為學(xué)功能，兩者呈正相關(guān)性，且隨著康復(fù)介入進程，其治療作用呈增強趨勢。聯(lián)合干預(yù)組大鼠在造模第3天開始，給予相同方案的高壓氧和康復(fù)訓(xùn)練聯(lián)合干預(yù)，干預(yù)7d和14d，聯(lián)合干預(yù)組的Longa評分和右側(cè)海馬區(qū)腦細胞Beclin-1陽性反應(yīng)均低于高壓氧組和康復(fù)訓(xùn)練組，組內(nèi)比較，14d同樣優(yōu)于7d，說明高壓氧聯(lián)合康復(fù)訓(xùn)練對腦出血超早期的干預(yù)模式，在調(diào)節(jié)腦細胞自噬相關(guān)蛋白表達，抑制腦細胞自噬機制過度激活和改善神經(jīng)行為功能方面，均較單純高壓氧或康復(fù)訓(xùn)練具有更加明顯的作用。

高壓氧聯(lián)合早期康復(fù)腦出血急性期的干預(yù)優(yōu)勢，在于將高壓氧與早期康復(fù)訓(xùn)練的治療作用有效結(jié)合，二者相互益彰，產(chǎn)生更大的協(xié)調(diào)促進效應(yīng)，對神經(jīng)行為功能的顯著改善作用，可能與進一步調(diào)節(jié)腦細胞受損致過高的自噬水平有關(guān)。