袁婷婷，朱成磊，李紫陽，宋新章，高志民*

(1.國際竹藤中心竹藤資源基因科學(xué)與基因產(chǎn)業(yè)化研究所，國家林業(yè)和草原局/北京市共建竹藤科學(xué)與技術(shù)重點實驗室，北京 100102；2.浙江農(nóng)林大學(xué)，浙江 杭州 311300)

氮素是植物生長發(fā)育必需的大量營養(yǎng)元素之一[1-2]。近些年，氮的利用效率倍受關(guān)注，涉及氮的吸收、運輸與同化等方面，其中，氮的吸收轉(zhuǎn)運已成為研究的熱點。研究表明，RWP-PK 家族中的NLP (NIN-like protein)轉(zhuǎn)錄因子在響應(yīng)氮饑餓、氮信號調(diào)節(jié)過程中處于中心地位[3]。NLP 家族成員都具有RWP-RK 和PB1 兩個典型的結(jié)構(gòu)域，RWPRK 結(jié)構(gòu)域具有與DNA 結(jié)合的功能，PB1 結(jié)構(gòu)域具有蛋白相互作用的功能[4]。擬南芥(Arabidopsis thaliana)中NLPs 與硝酸鹽順式作用元件NRE(Nitrate-responsive elements)結(jié)合調(diào)控硝酸鹽響應(yīng)相關(guān)基因的表達，進而影響擬南芥的生長發(fā)育[5]，如過表達擬南芥NLP7能夠通過增強氮和碳的同化，促進植物生長[6]，NLP8 則對于硝酸鹽促進種子萌發(fā)至關(guān)重要[7]。過表達OsNLP1促進水稻(Oryza sativaL.)生長，提高水稻氮素利用率和產(chǎn)量[8]。另外，在植物Nitrate-CPK-NLP (硝酸鹽-Ca2+傳感蛋白激酶-NLP)信號通路中，NLPs 協(xié)調(diào)植物對硝酸鹽信號的感知和對下游轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)運蛋白、碳氮代謝過程的調(diào)控[9]，在氮饑餓、氮磷互作以及根系生長過程中發(fā)揮著重要作用[10]。

隨著測序技術(shù)的快速發(fā)展，已經(jīng)對包括水稻[11]、擬南芥[7]、小麥(Triticum aestivumL.)[12]和玉米(Zea maysL.)[13]等多種植物中NLPs 進行全基因組鑒定和功能研究。竹子作為禾本科(Gramineae)的特殊類群，尤其是木本竹，因其生長快、材性好，已成為緩解木材供給不足的重要替代材料。毛竹(Phyllostachys edulis(Carrière) J.Houz.)林占我國竹林總面積的72.96%[14]，是最具代表性的木本竹種。氮肥顯著影響毛竹幼苗的生長[15]、筍的品質(zhì)和產(chǎn)量及其葉片生理特性[16]，施用氮肥已成為竹林增產(chǎn)的重要手段。未施氮肥的情況下，氮沉降在很大程度上補充了土壤氮，提高了毛竹光合作用效率[17-18]、增加生物量、增強抗性[19]。然而，毛竹吸收轉(zhuǎn)運氮的機制尚未見報道，其中，NLP 家族成員的調(diào)控作用更不清楚。本文以毛竹為研究對象，在全基因組水平系統(tǒng)分析NLP 分子特征的基礎(chǔ)上，研究在氮饑餓過程以及復(fù)氮后NLP基因的表達模式，以期為深入研究其功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料培養(yǎng)與處理

將毛竹種子播種于基質(zhì)(泥炭∶蛭石=7∶3)中，置于25℃的溫室中培養(yǎng)，待實生苗生長至2 個月時，選擇株高和長勢一致的植株，將種子去掉，根系用去離子水洗凈，置于全營養(yǎng)液中培養(yǎng)2 周，然后轉(zhuǎn)入缺氮木村B 營養(yǎng)液[20]中進行氮饑餓處理，并于氮饑餓72 h 后，用6 mmol·L?1的硝酸鹽(KNO3和KCl 配置而成)進行復(fù)氮處理。分別于氮饑餓處理以及復(fù)氮處理0、0.5、1、2、4、8、12 和24 h 取植株的根系，用液氮處理后保存于?80℃，用于RNA 提取，進行定量PCR (qPCR)分析，氮饑餓0 h 和72 h 的植株分別作為對照，試驗采用3 次生物學(xué)重復(fù)。

1.2 毛竹NLP 全基因組鑒定

分別從Rice Genome Annotation Project (http://rice.plantbiology.msu.edu/)和Tair (https://www.arabidopsis.org/index.jsp)數(shù)據(jù)庫下載水稻和擬南芥的NLP轉(zhuǎn)錄因子的CDS 和氨基酸序列[11,21]，作為誘餌序列在毛竹基因組數(shù)據(jù)庫BambooGDB (http://bamboo.bamboogdb.org/)中 進 行BlastP、BlastN (e-value=1 e?10)比對，獲取毛竹NLP的候選基因，對獲得的候選序列在PFAM 數(shù)據(jù)庫(http://pfam.xfam.org)逐條進行蛋白保守結(jié)構(gòu)域的鑒定和分析，僅保留具有編碼完整保守結(jié)構(gòu)域的序列，并進行基因命名。

1.3 毛竹NLP 基因序列及其編碼蛋白序列分析

使用TBtools 工具繪制毛竹NLP的基因結(jié)構(gòu)圖；使用ProtParam (http://web.expasy.org/prot-param/)和Plant-mPLoc 算法(http://www.csbio.sjtu.edu.cn)分析PeNLPs 編碼蛋白的基本理化特性及亞細(xì)胞定位；使 用MEME Version 5.1.0 (http://meme-suite.org/tools/meme)分析毛竹NLP 蛋白的保守基序。

1.4 毛竹NLP 家族成員系統(tǒng)進化分析與功能預(yù)測

使用MEGA 7.0 軟件的Clustal W 對毛竹、水稻、擬南芥、玉米、毛果楊(Populus trichocarpa(Torr.&Gray))、二穗短柄草 (Brachypodium distachyon(L.) Beauv.)和蒺藜苜蓿 (Medicago truncatulaGaertn.)的NLP 蛋白序列[22]進行同源比對分析，用鄰接法(Neighbor-joining method)、bootstrap 試驗重復(fù)1000 次、其它參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.5 毛竹NLP 的表達分析

利用本實驗室的毛竹26 個不同組織轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-Seq)數(shù)據(jù)(NCBI 的SRA 號為：SRS 1847073、SRS1847072、SRS1847071、SRS1847070、SRS1847069、SRS1847068、SRS1847067、SRS 1847066、SRS1847065、SRS1847064、SRS1847063、SRS1847062、SRS1847061、SRS1847060、SRS 1847059、SRS1847058、SRS1847057、SRS1847056、SRS1847055、SRS1847054、SRS1847053、SRS 1847052、SRS1847051、SRS1847050、SRS1847049、SRS1847048)[23]，構(gòu)建毛竹NLP基因的組織表達譜，以Log2(FPKM+1)的值進行表達量熱圖繪制[24]。

根據(jù)毛竹NLP基因序列，使用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計特異定量引物，由北京博邁德基因技術(shù)有限公司合成(表1)。用于qPCR 分析的cDNA是由1.1 節(jié)中經(jīng)過氮饑餓以及復(fù)氮處理不同時間的毛竹根系，通過TRIzol (Invitrogen)法從中提取RNA，用Promega 反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。qPCR 實驗在qTOWER2.2 系統(tǒng)上進行，體系參照Roche Light Cycler?480 SYBR Green I Master kit 試劑盒，程序為95℃預(yù)變性10 min；95℃變性10 s，60℃解鏈10 s，40 個循環(huán)。選擇PeTIP41作為內(nèi)參基因[25]，相對表達量的數(shù)據(jù)處理用2?ΔΔCT法[26]。

表1 qPCR 所用引物Table 1 Primers used in qPCR

2 結(jié)果與分析

2.1 毛竹NLP 家族基因的鑒定

在毛竹新基因組數(shù)據(jù)[23]中共鑒定出10 個編碼完整NLP 蛋白的基因，命名為PeNLP1～PeNLP10。PeNLPs 的編碼區(qū)長度為2145～2892 bp，編碼蛋白長度為714～963 aa，分子量(Molecular weight,MW)為 77.41～105.08 kDa，理論等電點(Theoretical isoelectric point,pI)為5.36～6.25，亞細(xì)胞定位預(yù)測除PeNLP9 位于葉綠體外，其余成員均位于細(xì)胞核內(nèi)（表2）。

表2 PeNLPs 編碼蛋白的基本特征Table 2 Basic characteristics of the proteins encoded by PeNLPs

2.2 PeNLPs 基因結(jié)構(gòu)及其編碼蛋白保守基序分析

基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，PeNLPs 均包含4 個內(nèi)含子，但不同基因內(nèi)含子的大小和位置存在一定的差異。依據(jù)系統(tǒng)進化關(guān)系，PeNLPs 可分為3 個組，同一個組內(nèi)的基因成員具有相似的結(jié)構(gòu)以及內(nèi)含子長度和位置，如II 組中PeNLP2和PeNLP3的基因結(jié)構(gòu)高度相似，PeNLP2的最短內(nèi)含子和最長內(nèi)含子分別為134 bp 和740 bp，PeNLP3的最短內(nèi)含子和最長內(nèi)含子分別為133 bp 和730 bp，二者非常接近，組與組之間的基因結(jié)構(gòu)差異明顯(圖1A)。

蛋白保守基序分析表明：PeNLPs 共有20 個保守基序(圖1B)，其中，Motif 1～Motif 7、Motif 9、Motif 12、Motif 13為共有基序，Motif 19、Motif 14 和Motif 16 分別為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ組成員所特有。另外，Ⅰ組成員缺少Motif 11，Ⅱ組成員缺少Motif 8 和Motif 17，Ⅲ組成員缺少Motif 15、Motif 18 和Motif 20。

圖1 PeNLPs 基因結(jié)構(gòu)(A)及其編碼蛋白保守基序(B)分析Fig.1 Gene structure (A) and the conserved motifs (B) of the proteins encoded by PeNLPs

2.3 PeNLPs 的進化分析

為了解不同物種間NLP 的進化關(guān)系，預(yù)測PeNLPs 的潛在功能，構(gòu)建了基于毛竹、水稻、擬南芥、玉米、毛果楊、二穗短柄草和苜蓿NLP 蛋白氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹。結(jié)果表明：60 個NLPs 分成了3 個組（Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ），雙子葉植物NLPs 主要分布在Ⅰ組中，而單子葉植物NLPs 則在3 個組中均有分布(圖2)，這與前人的研究一致[22]。PeNLPs 分布在Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的成員個數(shù)分別為4、2、4 個，這和其它單子葉植物成員在3 個組的個數(shù)分布情況相似。在每個組中，多數(shù)PeNLPs與水稻NLPs 聚類在較近的分支，其次是二穗短柄草的NLPs，這說明毛竹與水稻、二穗短柄草在進化上的親緣關(guān)系較近，而與擬南芥、毛果楊等雙子葉植物的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖2 NLP 家族成員的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.2 Phylogenetic analysis of NLP family members

共線性分析發(fā)現(xiàn)，9 個PeNLPs 存在共線關(guān)系，并組成6 個共線性基因?qū)Γ碢eNLP1和PeNLP8、PeNLP2和PeNLP3、PeNLP4和PeNLP7、PeNLP4和PeNLP10、PeNLP5和PeNLP6、PeNLP7和PeNLP10(圖3A)，且共線性基因的Ka/Ks均小于1 (圖3B)，說明這些基因在進化中經(jīng)歷了純化選擇。此外，有9 個PeNLPs 與5 個OsNLPs 之間存在共線性，具有共線關(guān)系的PeNLPs 數(shù)量多于OsNLPs 數(shù)量，這可能與毛竹進化過程中發(fā)生過基因組加倍事件有關(guān)[27]。

圖3 毛竹與水稻的NLP 家族基因共線性分析Fig.3 Collinearity analysis of NLP family genes between Ph.edulis and O.sativa

2.4 PeNLPs 的組織特異性表達

利用毛竹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對PeNLPs 的組織表達特異性進行分析。結(jié)果表明：PeNLPs 部分成員的表達具有組織特異性(圖4)，如PeNLP2在葉片、葉鞘和籜片中特異表達，PeNLP5和PeNLP9分別在葉鞘和0.1 cm 根中特異表達，推測它們是在特定的部位發(fā)揮功能；還有部分成員呈組成型表達，如PeNLP10在26 個組織中均檢測到表達，且在各個組織中的表達量變化不大，推測它在毛竹各個部位及各個部位的不同生長階段均能發(fā)揮作用。然而，有些成員在26 個組織中檢測不到表達，如PeNLP6和PeNLP7，推測它們可能為誘導(dǎo)表達型，或是存在功能冗余基因。

圖4 毛竹不同組織中PeNLPs 的表達分析Fig.4 Expression analysis of PeNLPs in different tissues of moso bamboo

此外，PeNLPs 在同一組織的不同生長階段的表達呈現(xiàn)一定的差異性。在根中，部分PeNLPs 的表達呈現(xiàn)出在生長早期表達高于生長后期的規(guī)律，如PeNLP1、PeNLP3、PeNLP8在0.1 cm 根中的表達量高于0.5 cm、成熟根等其它生長階段的根中的表達量，在0.2 m 筍中的表達量高于1.5、6.7 m 等其它高度的筍中的表達量，這可能是由于這3 個成員主要在根和筍的生長早期發(fā)揮作用；但PeNLP4卻呈相反的表達趨勢，其在3.0 m 和6.7 m 筍中的表達量高于在0.2 m 和1.5 m 筍中的表達量。由此表明，這些PeNLPs 可能在根或筍的不同生長階段具有不同的調(diào)控作用。

2.5 氮饑餓及復(fù)氮過程中PeNLPs 的表達模式

氮饑餓及復(fù)氮過程中PeNLPs 的表達模式分析表明：在氮饑餓處理過程中，PeNLPs 的表達呈現(xiàn)不同程度的波動變化，這說明不同時間PeNLPs 對氮饑餓的響應(yīng)程度不同，且各個成員之間存在一定的差異(圖5)。在施加氮饑餓1 h 內(nèi)，PeNLP1的表達量迅速上升，且達到極顯著水平，PeNLP2、PeNLP3、PeNLP5、PeNLP8和PeNLP10則極顯著下降(p<0.01)，表明PeNLPs 對氮饑餓的響應(yīng)均較迅速。隨著氮饑餓的施加，在1～24 h 過程中，PeNLP1的表達為先下降、后上升、再下降，至氮饑餓24 h 時的表達量與開始氮饑餓時(0 h)的表達量接近；PeNLP2、PeNLP5和PeNLP10的表達為先上升、后下降、再上升，至氮饑餓24 h 時，PeNLP5 極顯著高于0 h，PeNLP2和PeNLP10則極顯著低于0 h (p<0.01)；PeNLP3和PeNLP8呈先上升、后下降、再上升、再下降、再上升的波動表達模式，至氮饑餓24 h 時，PeNLP3的表達極顯著低于0 h，PeNLP8的表達極顯著高于0 h (p<0.01)。由此推測，毛竹對氮饑餓過程的響應(yīng)可能存在不同的信號通路，PeNLPs 各成員通過不同的表達來參與毛竹對氮饑餓的響應(yīng)。

圖5 氮饑餓過程中PeNLPs 的表達分析Fig.5 Expression analysis of PeNLPs during nitrogen starvation

對氮饑餓72 h 后的毛竹進行復(fù)氮處理，在復(fù)氮過程中PeNLPs 的表達量均顯著或極顯著上調(diào)(p<0.05 或p<0.01)，說明復(fù)氮促進了PeNLPs 的表達，但呈現(xiàn)不同的波動變化(圖6)。如PeNLP1、PeNLP3、PeNLP8和PeNLP10呈現(xiàn)相似的變化趨勢，即先上升、后下降，再上升、再下降；PeNLP2和PeNLP5呈現(xiàn)相似的變化趨勢，即先上升、后下降，再上升、再下降，再上升、后下降。PeNLP1、PeNLP2、PeNLP3、PeNLP5和PeNLP10的表達量基本是在復(fù)氮處理后12 h 達到峰值，在處理后24 h 較12 h都顯著下降，而PeNLP8則是在處理后24 h 達到峰值，較處理后12 h 顯著上升，說明它們的表達可能存在晝夜節(jié)律，各個成員響應(yīng)硝酸鹽表達的波動差異，表明不同PeNLPs 對硝酸鹽的響應(yīng)可能具有不同的信號通路。

圖6 復(fù)氮過程中PeNLPs 的表達分析Fig.6 Expression analysis of PeNLPs during nitrogen resupply

3 討論

本研究基于毛竹新基因組數(shù)據(jù)，共鑒定到10 個毛竹NLP基因家族成員，比水稻(6 個)、玉米(9 個)、二穗短柄草(7 個)和苜蓿(5 個)等單子葉植物中成員數(shù)量多，而少于雙子葉植物毛果楊(14 個)中的成員，這可能與不同物種在進化過程中經(jīng)歷的基因組加倍或基因丟失有關(guān)[28]。亞細(xì)胞定位預(yù)測10 個PeNLPs 有9 個定位在細(xì)胞核中，這符合轉(zhuǎn)錄因子的特性，而PeNLP9 定位在葉綠體中，這可能是NLP 家族的核穿梭現(xiàn)象[29]，與擬南芥、水稻NLP 的核穿梭特征[20]類似。系統(tǒng)進化分析表明，60 個NLPs 分為3 個組，各組成員功能相似但也出現(xiàn)了一定的功能分化，如Ⅰ組中擬南芥和水稻成員主要參與硝酸鹽信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和氮素營養(yǎng)調(diào)控植物生長發(fā)育[30]，Ⅱ組成員中AtNLP8呈組成型表達，當(dāng)硝酸鹽存在時，AtNLP8 可以直接結(jié)合到編碼ABA 分解代謝酶基因CYP707A2的啟動子區(qū)，降低種子中ABA 含量并促進種子萌發(fā)[7]；Ⅲ組中成員個數(shù)相對較多，AtNLP6/7 能夠結(jié)合硝酸鹽響應(yīng)基因ANR1、CIPK8的啟動子，調(diào)控氮吸收、同化和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[31]。雖然可以根據(jù)已知功能的同源蛋白預(yù)測PeNLPs 的功能，但要對PeNLPs 在氮素利用率(NUE)中的作用給出明確的結(jié)論，尚有待于實驗驗證。

氮素利用效率受氮感知、吸收、轉(zhuǎn)運、同化和再利用效率等因素的影響，其調(diào)控是一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，其中，NLP 轉(zhuǎn)錄因子是硝態(tài)氮吸收利用的核心轉(zhuǎn)錄因子[32]。擬南芥中AtNLP6/7 通過感知硝酸鹽信號后活性被誘導(dǎo)，進而結(jié)合到高親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運基因蛋白(NRT2.1)、亞硝酸還原酶(NIR1)等基因的啟動子區(qū)和硝酸還原酶(NIA1)基因的3′側(cè)翼區(qū)的氮應(yīng)答DNA 元件(NRE)上[33]。AtNLP6/7還可以和TCP20 相互作用形成異源二聚體，正向調(diào)控氮同化及氮信號途徑中的基因NRT1.1、NIA1和NIA2的表達，參與硝酸鹽的同化和信號傳遞[34]，此外，NLPs 還能靶向LBD37-39 和NIGT1 兩類轉(zhuǎn)錄因子基因，通過觸發(fā)二級轉(zhuǎn)錄事件協(xié)同響應(yīng)硝酸鹽過程[35]。蒺藜苜蓿MtNLP1 在細(xì)胞核中與MtNIN互作，阻礙MtNIN 激活CRE1和NF-YA1，進而抑制了根瘤菌感染以及節(jié)的形成[36]。另外，作為轉(zhuǎn)錄因子，NLP 也受到其它轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，如擬南芥AtNLP3 受到bZIP1 的“非綁定”的調(diào)控方式來快速響應(yīng)硝酸鹽[37]。

NLPs 除與上游的轉(zhuǎn)錄因子互作、下游基因結(jié)合來參與調(diào)控響應(yīng)硝酸鹽外，還通過自身表達的變化來響應(yīng)氮饑餓及復(fù)氮誘導(dǎo)過程。在毛竹根中PeNLPs 的表達對氮饑餓作出快速反應(yīng)，如在氮饑餓1 h 時，PeNLP1的表達量上升至對照的30 倍，而PeNLP3的表達量則降低至對照的0.2 倍，這與硝酸鹽處理玉米時ZmNLPs 的表達變化趨勢相類似[38]。而在氮饑餓后復(fù)氮處理過程中，所有PeNLPs的表達均顯著上調(diào)，說明硝酸鹽誘導(dǎo)PeNLPs 的表達，這與前人在水稻、擬南芥和玉米等物種中的研究結(jié)果一致[39]。此外，依據(jù)擬南芥中的NRE 元件以及水稻中鑒定的NRE-like 元件，對PeNLPs 的下游靶基因進行預(yù)測，結(jié)果表明：毛竹NPF 家族的PeNPF2.4、PeNPF2.5、PeNPF2.7、PeNPF4.1、PeNPF4.6、PeNPF6.2、PeNPF6.5、PeNPF6.8和PeNPF8.19的啟動子區(qū)有TGACCC…N…AAGAG序列[8,40]，推測它們可能是PeNLPs 的靶基因，但還有待于進一步驗證。目前，對于NLPs 的認(rèn)知主要是基于擬南芥、水稻和豆類[41]等草本植物，而對于木本植物NLPs 的功能驗證鮮有報道，木本植物的生長需要大量的氮[42]，且多年生長處于復(fù)雜的環(huán)境中，它們可能比草本植物具有更加復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在氮饑餓及復(fù)氮處理過程中，PeNLPs 表達的波動變化表明其參與調(diào)控的復(fù)雜性。因此，要揭示非草非木的竹子中NLPs 的功能，尚需更廣泛的深入研究。

4 結(jié)論

本研究從毛竹中鑒定出10 個NLP 家族成員(PeNLP1～ PeNLP10)，依據(jù)蛋白序列差異它們可分成3 個組，分別具有4、2、4 個成員。PeNLPs 在毛竹各個組織的生長早期呈現(xiàn)高表達，這可能與各組織早期快速生長需要大量的氮素有關(guān)。氮素誘導(dǎo)PeNLPs 的表達，在氮饑餓和復(fù)氮過程中呈現(xiàn)波動變化模式，表明毛竹對氮饑餓過程的響應(yīng)可能存在不同的信號通路，PeNLPs 各成員通過不同的表達來參與毛竹對氮饑餓的響應(yīng)。研究結(jié)果為深入探索PeNLPs 的功能，解析其調(diào)控分子機制奠定了基礎(chǔ)。