張建強(qiáng)，吳康莉，張曉夢(mèng)，李昭煜,，李佳佳，漆永紅，田永強(qiáng),

（1. 蘭州交通大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2. 蘭州交通大學(xué)研究院甘肅省植物源生物農(nóng)藥工程技術(shù)研究中心，甘肅 蘭州 730070；3. 甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，甘肅 蘭州 730070）

燕麥(Avena sativa)是禾本科燕麥屬的一年生植物，是世界上糧飼兼用的重要農(nóng)作物之一，多生長(zhǎng)在高寒、貧瘠和干旱的極端環(huán)境中，抗逆性較強(qiáng)，已經(jīng)成為寒旱地區(qū)不可替代的特色糧飼作物[1]，在世界上被廣泛種植，種植面積約1 400 萬(wàn)hm2，總產(chǎn)量2 800 萬(wàn)t[2-3]。燕麥富含蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、維生素和礦物質(zhì)等各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有降血脂、調(diào)節(jié)血糖和預(yù)防便秘等多種保健功能。燕麥莖葉飼用營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，適口性好，是農(nóng)牧區(qū)冬春補(bǔ)飼和抗災(zāi)保畜的優(yōu)良飼草。

隨著近年來燕麥種植面積不斷擴(kuò)大，水肥條件的改善和氣候變暖的影響，導(dǎo)致燕麥病害問題日益嚴(yán)重，在燕麥種植區(qū)普遍發(fā)生[1,4-5]，嚴(yán)重影響燕麥的品質(zhì)和產(chǎn)量。燕麥的病害按照病原菌的侵染部位可以分為葉部病害、根部及莖基部病害、穗部病害。其中，常見的葉部病害的病原菌主要包括燕麥內(nèi)臍蠕孢(Drechslera avenae)、 禾布氏白粉菌(Blumeria graminis)、燕麥冠銹菌(Puccinia coronata)和核腔菌(Pyrenophora avenicola)[6]；根部病害的病原菌主要包括燕麥鐮刀菌(Fusarium avenaceum)、假禾谷鐮刀菌(F. pseudograminearum)[7]和立枯絲核菌(Rhizoctoia solani)；穗部病害的病原菌主要包括燕麥散黑粉菌(Ustilago avenae)、黑粉菌(U. segetum)、層出鐮刀菌(F. proliferatum)[8-9]和雪霉微座孢(Microdochium nivale)[10-11]。

為防治因病蟲害造成的損失，大量使用化學(xué)農(nóng)藥造成了燕麥相關(guān)產(chǎn)品的農(nóng)藥殘留，也對(duì)牧區(qū)草地生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重污染，威脅著草原畜牧業(yè)生產(chǎn)和人類的健康。因此，利用微生物菌劑開展生物防治是預(yù)防植物病蟲害和解決化學(xué)農(nóng)藥污染的最理想途徑。查閱國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)燕麥根部病害的調(diào)查研究較多，且防治藥劑主要以化學(xué)農(nóng)藥為主，關(guān)于生物防治的研究鮮有報(bào)道[12]。為此，通過從健康燕麥田土壤中分離出一株對(duì)燕麥根腐病菌具有防治作用的拮抗細(xì)菌，旨在為燕麥根腐病的生防菌開發(fā)和綠色防控提供新的依據(jù)和思路。

1 材料與方法

1.1 供試病原菌

燕麥鐮孢菌(F. avenaceum)、茄腐鐮孢菌(F.solani)、番茄匍柄霉(Stemphylium lycopersici)、立枯絲核菌(R. solani)、禾谷鐮孢菌(F. graminearum)、細(xì)極鏈格孢(Alternaria tenuissima)、番茄灰霉(Botrytis cinerea)、核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)、尖孢鐮孢菌(F. oxysporum)。以上菌株由蘭州交通大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室分離、保存。

1.2 土樣采集

2020 年6 月，在甘肅省合作市卡加曼鄉(xiāng)香拉村燕麥地(35°06′22.20″ N, 102°52′6.02″ E)，用“S”型采樣法選取健康燕麥植株，土壤樣品的采集采用抖根法，先鏟去植株根際表層0 ? 5 cm 的土壤，取5 ?20 cm 附著于根毛上的土壤裝入無菌自封袋帶回實(shí)驗(yàn)室，4 ℃保存，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 培養(yǎng)基制作

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar, PDA)培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 L；馬鈴薯葡萄糖(potato dextrose broth, PDB)培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，水1 L。

1.4 拮抗菌的篩選

將土壤樣品稱取1 g，用100 mL 無菌水配置成懸液，然后將懸液梯度稀釋，采用平板涂布法吸取100 μL 濃度1×10?5的懸液均勻涂布于PDA 培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)3 d，挑取形態(tài)各異的菌落劃線純培養(yǎng)。試驗(yàn)重復(fù)3 次。

采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法進(jìn)行篩選，將培養(yǎng)5 d 的燕麥根腐病菌用打孔器(直徑6 mm)打成菌餅接種于培養(yǎng)皿中央，再用接種環(huán)將培養(yǎng)24 h 的細(xì)菌用十字交叉法接種在距菌餅2 cm 處，25 ℃黑暗培養(yǎng)5 d。能產(chǎn)生抑菌帶即為拮抗菌，并測(cè)定抑菌率[13]。抑菌率 = (對(duì)照組菌落直徑 ? 處理組菌落直徑)/對(duì)照組菌落直經(jīng) × 100% 。試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.5 拮抗菌抑菌廣譜性測(cè)定

為測(cè)定拮抗菌潛在應(yīng)用價(jià)值，測(cè)定其對(duì)8 種常見農(nóng)作物病原菌的抑菌能力。方法同上。供試病原菌：茄腐鐮孢菌、番茄匍柄霉、立枯絲核菌、禾谷鐮孢菌、細(xì)極鏈格孢、番茄灰霉孢、核盤菌、尖孢鐮孢菌。

1.6 拮抗菌鑒定

采用Ezup 柱式細(xì)菌基因組DNA 抽提試劑盒(上海生工生物工程有限公司)提取拮抗菌總DNA 后，通過測(cè)序分析其16S rDNA 基因序列進(jìn)行拮抗菌鑒定。采用細(xì)菌通用引物27F (5-AGAGTTTGATCTGG CTCG-3)和1492R (5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)擴(kuò)增16S rDNA。PCR 的反應(yīng)體系為25 μL，所用程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，共進(jìn)行30 次循環(huán)，然后以72 ℃延伸10 min 后，4 ℃保存?zhèn)溆?。送至北京華大基因完成測(cè)序工作，測(cè)序結(jié)果在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)Blast 比對(duì)分析，并用MEGA 6.0 軟件選擇最大似然法(maximum likelihood, ML)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.7 拮抗菌抑菌能力測(cè)定

1.7.1 菌株YF 發(fā)酵液對(duì)燕麥鐮孢菌菌絲的抑制作用

從活化的燕麥鐮孢菌培養(yǎng)皿中取5 個(gè)直徑為8 mm 的菌餅，接種于100 mL PDB 培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r·min?1培養(yǎng)24 h 后加入1 mL 培養(yǎng)24 h 的YF 發(fā)酵液(無菌)，對(duì)照組不接種YF 發(fā)酵液。繼續(xù)培養(yǎng)2 d 后在光學(xué)顯微鏡下觀察各組燕麥鐮孢菌菌絲的生長(zhǎng)情況。

1.7.2 菌株YF 對(duì)燕麥鐮孢菌孢子萌發(fā)的抑制作用

采用瓊脂培養(yǎng)法[14]，并做一些改進(jìn)。在潔凈無菌的載玻片上滴加含有無菌YF 發(fā)酵液的1.5%水瓊脂培養(yǎng)基，待水瓊脂凝成薄層后，將有瓊脂培養(yǎng)基的一面朝上，平放在培養(yǎng)皿中“U”形玻璃棒上，再吸取10 μL 孢子濃度為1.5 × 105個(gè)·mL?1的燕麥鐮孢菌分生孢子懸浮液均勻涂抹在水瓊脂平面上，平板底部加浸水的濾紙片保溫培養(yǎng)，置于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每個(gè)處理重復(fù)3 次。以不加發(fā)酵液的水瓊脂為空白對(duì)照。24 h 后在光學(xué)顯微鏡下觀察，每次鏡檢50 個(gè)孢子，并統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率 。萌發(fā)抑制率 =(對(duì)照組萌發(fā)率 ? 處理組萌發(fā)率) / 對(duì)照組萌發(fā)率 ×100%[15]。

1.7.3 菌株YF 防效測(cè)定

將培養(yǎng)8 d 的燕麥鐮孢菌加5 mL 無菌水，輕輕刮下孢子，置于無菌三角瓶中稀釋成孢子濃度為1.5 × 103個(gè)·mL?1的孢子懸浮液，每盆取100 mL 孢子懸浮液與滅菌土(約1 kg)拌勻后裝盆，選取顆粒飽滿的燕麥種子，用75%的乙醇消毒后分裝于花盆中，每盆10 粒，覆土1 cm 左右后置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。試驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)處理，分別為處理組[待燕麥出苗后，將YF 制成菌懸液(1 × 108cfu·mL?1) 20 mL進(jìn)行灌根處理]、對(duì)照組[待燕麥出苗后，以50%多菌靈粉劑為常規(guī)對(duì)照(稀釋倍數(shù)為800 倍)，取稀釋后的多菌靈溶液20 mL 進(jìn)行灌根處理]和空白對(duì)照組(以20 mL 無菌水進(jìn)行灌根處理)。每個(gè)處理重復(fù)3 次。灌根15 d 后調(diào)查各處理病害發(fā)生情況，用自來水將根莖部土壤沖洗干凈后，觀察記載發(fā)病程度，然后統(tǒng)計(jì)發(fā)病率并計(jì)算病情指數(shù)和防治效果。根腐病病情調(diào)查分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[16]：0 級(jí)，根部無病斑；1 級(jí)，根部出現(xiàn)淡褐色斑點(diǎn)，根系發(fā)病面積占1%～15%；3 級(jí)，部分根部變褐色至黑褐色，根系發(fā)病面積占16%～30%；5 級(jí)，多數(shù)根部變黑褐色，根系發(fā)病面積占31%～60%；7 級(jí)，根部變黑甚至腐爛，根系發(fā)病面積占60%以上。計(jì)算公式[17]：

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

利用Excel 2016 和SPSS 22.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析菌落直徑，采用Duncan 法進(jìn)行多重比較，顯著水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌的分離和篩選

以燕麥鐮孢菌為靶點(diǎn)，利用平板對(duì)峙培養(yǎng)法篩選拮抗細(xì)菌。通過篩選獲得一株抑制效果較好的菌株YF，抑菌效果明顯(圖1)，經(jīng)測(cè)定處理菌落直徑為(1.7 ± 0.3) cm，對(duì)照菌落直徑為(5.8 ± 0.4) cm，抑制率為70.69%。因此，確定以菌株YF 為燕麥鐮孢菌拮抗菌株開展后續(xù)研究。

圖1 菌株YF 對(duì)燕麥鐮孢菌的抑制效果Figure 1 Inhibitory effect of strain YF on Fusarium avenaceum

2.2 拮抗菌的抑菌廣譜性測(cè)定

采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法測(cè)定了拮抗菌YF 對(duì)8 種常見植物病原菌的抑菌作用。結(jié)果表明YF 對(duì)供試病原菌均表現(xiàn)出較好的抑菌作用(表1)。其中YF 對(duì)茄腐鐮孢菌、番茄匍柄霉、立枯絲核菌、禾谷鐮孢菌、細(xì)極鏈格孢、番茄灰霉孢、核盤菌均具有較強(qiáng)的抑菌作用，抑菌率達(dá)到70%以上，對(duì)尖孢鐮刀菌為中度拮抗作用，抑菌率為62.23%。

表1 菌株YF 抑菌廣譜性測(cè)定Table 1 Determination of broad spectrum antimicrobial activity of strain YF

2.3 拮抗菌株YF 的鑒定

菌株YF 在PDA 培養(yǎng)基上菌落為圓形，突起，乳白色，粘稠狀，不透明，表面濕潤(rùn)光滑，邊緣不整齊，具有很強(qiáng)的粘性(圖2A)；經(jīng)革蘭氏染色觀察，該菌為革蘭氏染色陽(yáng)性，菌體桿狀，大小為(0.5～2.5) μm × (1.2～8) μm (圖2B)。利用16S rDNA 基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增分析，結(jié)合最大似然法建樹進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，菌株YF (GenBank 登錄號(hào)：MW205750)與多粘類芽孢桿菌[Paenibacillus polymyxaATCC:25901 (KM051087.1)]聚集在一起(圖3)。因此，基于以上研究結(jié)果可以確定菌株YF 為多粘類芽孢桿菌。

圖2 菌株YF 形態(tài)Figure 2 Morphology of strain YF

圖3 基于16S rDNA 基因系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene

2.4 菌株YF 發(fā)酵液對(duì)燕麥鐮孢菌菌絲和孢子萌發(fā)的抑制作用

利用菌株YF 無菌發(fā)酵濾液處理燕麥鐮孢菌后通過顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，燕麥鐮孢菌菌絲生長(zhǎng)明顯受到Y(jié)F 發(fā)酵濾液的影響(圖4)。與對(duì)照組相比，處理組的燕麥鐮孢菌菌絲膨大變粗，分枝增多，節(jié)間縮小，出現(xiàn)囊泡狀畸形。采用瓊脂培養(yǎng)法研究了該菌發(fā)酵液對(duì)燕麥鐮孢菌孢子萌發(fā)的影響，結(jié)果表明，對(duì)照組萌發(fā)率為90.00%，處理組萌發(fā)率為12.67%，經(jīng)計(jì)算，該菌對(duì)燕麥鐮孢菌孢子萌發(fā)的抑制率為85.92% (表2)。

表2 孢子萌發(fā)抑制率Table 2 Rate of inhibition of spore germination

圖4 菌株YF 對(duì)燕麥鐮刀菌的抑制作用Figure 4 Inhibition of Fusarium avenaceum by strain YF

2.5 菌株YF 防效測(cè)定

為驗(yàn)證菌株YF 在田間對(duì)燕麥鐮孢菌的作用效果，模擬田間開展了室內(nèi)盆栽防效試驗(yàn)。從農(nóng)藝性狀來看，不同處理組的盆栽燕麥在出苗15 d 后表現(xiàn)出明顯差異，其中多粘類芽孢桿菌處理組燕麥長(zhǎng)勢(shì)良好，根系發(fā)達(dá)，株高和根長(zhǎng)與其他處理組間存在明顯差異(表3)，多菌靈處理組次之，空白對(duì)照組燕麥明顯長(zhǎng)勢(shì)較弱，根系較少，并且根部變褐色(圖5)。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，多粘類芽孢桿菌處理組的發(fā)病率、病情指數(shù)、防治效果均與多菌靈處理和空白對(duì)照差異顯著(P< 0.05)，其防治效果高達(dá)81.45%，明顯優(yōu)于多菌靈處理組的61.87%。

圖5 菌株YF 對(duì)燕麥生長(zhǎng)的影響Figure 5 Effect of strain YF on oat growth

表3 菌株YF 在燕麥上的防治效果Table 3 Control effect of strain YF on oat

3 討論與結(jié)論

我國(guó)燕麥主產(chǎn)區(qū)主要分布在內(nèi)蒙古、青海、陜西、山西、吉林、甘肅[18]，燕麥產(chǎn)區(qū)各種病害的發(fā)生已經(jīng)引起了重視，尤其對(duì)葉部病害的調(diào)查研究較多，但是對(duì)于燕麥根腐病的研究報(bào)道相對(duì)較少。根據(jù)《中國(guó)牧草真菌病害名錄》[19]記載，能夠引起燕麥根腐病的病原菌有燕麥鐮孢菌、大刀鐮孢菌(F.culmorum)、禾谷鐮孢菌、雪腐鐮孢菌(F. nivale)、長(zhǎng)直喙鐮孢菌(F. orthoceras)、早熟禾鐮孢菌(F. poae)、藤草鐮孢菌(F. scripi)，并且病害分布不詳。馬從[20]對(duì)甘肅省燕麥病害調(diào)查發(fā)現(xiàn)根腐病病原菌為小麥長(zhǎng)蠕孢菌(Helminthosporium tritici-repetis)。陳昊[5]通過對(duì)甘肅省燕麥真菌病害多樣性調(diào)查發(fā)現(xiàn)，燕麥根腐病病原菌為燕麥鐮孢菌、層出鐮孢菌(F.proliferatum)、雪球微座孢(M. nivale)，其中燕麥鐮孢菌的分離頻率最高，在通渭、山丹、天祝和榆中4 個(gè)地區(qū)分離率分別達(dá)到31%、30%、58%和44%，燕麥根部病害在各地發(fā)生差異較大，山丹地區(qū)相比于其他調(diào)查地區(qū)發(fā)病率最高，青引1 號(hào)燕麥品種的發(fā)病率達(dá)到2.93%，而在通渭地區(qū)根部病害發(fā)生最輕，定引1 號(hào)發(fā)病率為0.02%，在天祝、榆中地區(qū)不同品種的發(fā)病率不同，但總體發(fā)病率較低。

關(guān)于燕麥根腐病防治研究大多數(shù)是化學(xué)防治，生物防治文獻(xiàn)極少，僅有陳昊[5]和馬從[20]分別研究報(bào)道菌株Y-Y-1 與菌株LHS11 對(duì)燕麥根腐病病原菌有抑制作用，但抑菌效果并不理想，抑菌率分別為3.09%與41.2%。為了燕麥種植業(yè)的健康發(fā)展，急需開展該領(lǐng)域的綠色生物防治研究。本研究從甘肅合作市卡加曼鄉(xiāng)香拉村燕麥根際土壤中分離到一株生防菌YF，經(jīng)鑒定為多粘類芽孢桿菌，室內(nèi)活性測(cè)定發(fā)現(xiàn)該菌不僅對(duì)燕麥鐮孢菌具有較好的抑制作用，對(duì)孢子萌發(fā)抑制作用也達(dá)到85.92%。通過盆栽試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)菌株YF 對(duì)燕麥根腐病的防治效果達(dá)到81.45%，防效顯著高于化學(xué)農(nóng)藥多菌靈(61.87%)，并且對(duì)燕麥促生長(zhǎng)作用明顯。因此，多粘類芽孢桿菌YF 具備開發(fā)為燕麥根腐病生物防治菌劑的潛力。

多粘類芽孢桿菌是目前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用較為廣泛的生物菌劑?？捎糜诙喾N真菌、細(xì)菌和線蟲引起的病害防治。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，多粘類芽孢桿菌XZ-2 發(fā)酵原液10 倍稀釋液對(duì)甘薯(Dioscorea esculenta)黑斑病的防治效果最佳，達(dá)到73.62%，并且顯著地抑制其分生孢子的萌發(fā)[21]。劉珂欣等[22]研究表明，多粘類芽孢桿菌CH-23 菌劑對(duì)水稻(Oryza sativa)惡苗病具有較好的生防效果，生防指數(shù)高達(dá)68.35%。孫光忠等[23]研究表明，5 億cfu·g?1多粘類芽孢桿菌懸浮劑對(duì)小麥(Triticum aestivum)赤霉病防治效果在80%以上，增產(chǎn)效果達(dá)到14.51%～17.27%，說明多粘類芽孢桿菌可以廣泛用于小麥赤霉病的防治。多粘類芽抱桿菌已作為微生物殺菌劑產(chǎn)品進(jìn)行登記，在美國(guó)登記的商品名為Hydroguard，在韓國(guó)登記的商品名為Topseed 和NH[24]，說明多粘類芽孢桿菌具備廣譜的抗菌活性。

本研究所篩選出的拮抗菌株YF 從室內(nèi)活性測(cè)定和盆栽試驗(yàn)證明其對(duì)燕麥鐮孢菌有較好的防治效果，但還需要研究菌株YF 針對(duì)燕麥鐮孢菌作用的主要代謝產(chǎn)物及作用分子機(jī)理，闡明其作用機(jī)制，并進(jìn)一步開展田間試驗(yàn)驗(yàn)證，有望早日將該菌開發(fā)為用于防治燕麥鐮孢菌的生物防治菌劑。本研究結(jié)果可為燕麥根腐病病原菌燕麥鐮孢菌的生物防治和相應(yīng)產(chǎn)品的開發(fā)提供新的思路和途徑。