何 應，馬向麗，任 健，代微然，毛如志

（1. 云南農業(yè)大學動物科學技術學院，云南 昆明 650201；2. 云南農業(yè)大學科學技術處，云南 昆明 650201；3. 云南農業(yè)大學食品科學技術學院，云南 昆明 650201）

植物在生長發(fā)育過程中會受到各種脅迫因子的影響，通常分為生物和非生物脅迫因子，其中生物脅迫因子主要包括昆蟲、微生物(細菌、真菌、病毒)和線蟲等[1-2]。在這些生物脅迫中，昆蟲脅迫對植物的影響較大。為抵御害蟲，植物在長期進化過程中形成了一系列完整有效的防御策略[3]，特別是組成型抗性和誘導型抗性是植物防御害蟲的兩種重要機制[4-5]。誘導型抗性是指植物在遭受害蟲脅迫時一些防御酶基因被誘導表達，從而激活防御酶活性，并生成一些防御物質的過程[6]。該過程通過改變植物自身代謝方式以抑制或減少害蟲的危害，通常會使植物產生一些驅避害蟲的氣味或者改變揮發(fā)性次生化合物的組成和比例，以引誘害蟲的天敵捕食或寄生，該過程會使植物的某些防御酶系及其活性發(fā)生改變[7]。近年來，國內外學者已對多種植物防御酶應對害蟲脅迫的調控機制進行了一定的研究[8]。防御酶主要有超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase, PAL)、過氧化氫酶(catalase, CAT)、多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)、 脂氧合酶(lipoxygenase, LOX)以及過氧化物酶(peroxidase, POD)等。植物防御酶活性會受害蟲脅迫的影響而發(fā)生改變，并調控相關防御物質的合成[3,9]。岳文波等[10]研究發(fā)現，斜紋夜蛾(Spodoptera litura)、二斑葉螨(Tetranychus urticae)和西花薊馬 (Frankliniella occidentalis)取食菜豆(Phaseolus vulgaris)后，植物體內POD、CAT 和SOD 活性顯著升高；西花薊馬取食植物后，可誘導植物防御酶CAT、POD、PPO、LOX 和PAL 活性升高[11-13]；棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)、斜紋夜蛾和葉蟬(Empoasca kerri)取食花生(Arachis hypogaea)后，植物體內防御酶POD、PPO、LOX、PAL、SOD 和CAT 活性均升高，以應對昆蟲取食脅迫[14]。

毛花雀稗(Paspalum dilatatum)屬于多年生暖季型牧草，原產于南美洲，在我國亞熱帶地區(qū)分布較廣，具有產草量較高、適口性好、營養(yǎng)較為豐富且多年刈割不退化等特點，是建植栽培草地的優(yōu)良牧草[15-16]。毛花雀稗在種植過程中會遭受多種昆蟲取食危害，蝗蟲(Oxya chinensis)是最常見的一種，其取食是否會引起毛花雀稗植株系統(tǒng)防御尚不清楚。為此，本研究以總抗氧化能力(total antioxidant capacity, T-AOC)、8 種防御酶[POD、LOX、CAT、PPO、酪氨酸解氨酶(tyrosine ammonia- lyase, TAL)、谷胱甘肽S-轉移酶(glutathione S-transferase, GST)、PAL 和SOD]活性和植物總酚(total phenols, TP)含量為指標，研究蝗蟲取食毛花雀稗植株后不同時間內植物體內防御酶活性、總抗氧化能力和TP 含量的動態(tài)變化，探討昆蟲誘導植物防御反應的時間效應，旨在進一步揭示牧草應對昆蟲取食脅迫的防御機理，為害蟲防治提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

毛花雀稗種子采自貴陽市花溪區(qū)，在室內人工氣候箱內進行盆栽種植[(25 ± 1) ℃、相對濕度70% ±5%、光周期14 h/10 h (黑夜/白天)]，待植株長出8～10 片葉時開始處理。本試驗所用蝗蟲為中華稻蝗(Oxya chinensis)，蟲源采集于貴陽市花溪區(qū)野生草坪，在人工氣候箱內用人工種植的毛花雀稗飼養(yǎng)，取3 日齡成蟲作為供試蟲源。

1.2 試驗設計

選取健康、長勢一致的毛花雀稗植株作為試驗材料，將6 盆植株置于方形紗網籠(1.2 m × 1.2 m ×1.0 m)中，取大小一致的3 日齡蝗蟲雌成蟲15 頭饑餓24 h 后，放入籠中進行取食。對照組(CK)不放入蝗蟲。分別在蝗蟲取食24、48、72 和96 h 后，對被取食過的毛花雀稗植株葉片進行取樣。每個處理重復3 次。所有樣品用液氮速凍后置于?80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 測定指標及方法

測定指標包括總抗氧化能力(T-AOC)、抗氧化酶(POD、CAT、SOD)、酚類相關酶(TAL、PPO)、其他防御酶(LOX、PAL、GST)活性和植物總酚(TP)含量。其中，總抗氧化能力、SOD、PAL、TAL、GST 活性及植物總酚(TP)含量采用蘇州科銘生物技術有限公司生產的試劑盒測定，測定方法參照說明書。POD、CAT、PPO 和LOX 活性測定方法參考陳奕磊等[17]。

1.4 數據分析

利用Excel 2016 作圖；用SPSS 19.0 軟件采用Duncan 新復極差檢驗法分析各處理間的差異顯著性(P< 0.05)。

2 結果與分析

2.1 總抗氧化能力(T-AOC)變化

蝗蟲取食脅迫毛花雀稗植株不同時間后植物體T-AOC 有所不同。隨著取食時間的延長， T-AOC 總體上表現出先上升后降低的趨勢。與CK 相比，在24 h 時 T-AOC 顯著升高(P< 0.05)，在48、72 和96 h時 T-AOC 均顯著低于CK 組(P< 0.05)，但三者之間無顯著差異(P> 0.05) (圖1)。

圖1 蝗蟲取食不同時間后毛花雀稗的總抗氧化能力Figure 1 Total antioxidant capacity (T-AOC) of dallisgrass at different times after grasshoppers feeding

2.2 抗氧化酶POD、CAT 和SOD 活性變化

蝗蟲取食脅迫下，毛花雀稗植株中POD 活性在48、72 和96 h 時較CK 均顯著升高(P< 0.05)，分別為CK 的1.63、1.65 和1.53 倍，而取食24 h 后POD 活性變化不顯著(P> 0.05)；CAT 活性在各時段較CK 均有所升高，其中在24 和96 h 時顯著高于CK (P<0.05)，分別為CK 的1.80 和1.36 倍；SOD 活性在24 h時與CK 相比有所升高，但差異不顯著(P> 0.05)，在48、72 和96 h 時均顯著降低(P< 0.05) (圖2)。

圖2 蝗蟲取食不同時間后毛花雀稗POD、CAT 和SOD 活性Figure 2 POD, CAT and SOD activity of dallisgrass at different times after grasshoppers feeding

2.3 酚類代謝關鍵酶TAL、PPO 活性及總酚(TP)含量變化

毛花雀稗植株中TAL 活性隨蝗蟲取食脅迫時間的增加呈先升高后降低的變化趨勢，在24、48、72 和96 h 時TAL 活性均顯著高于CK (P< 0.05)。其中，在48 h 時TAL 活性達到最高，為CK 的3.71 倍；在24 h 時次之，為CK 的3.07 倍；在72 和96 h 時分別為CK 的2.14 和1.57 倍。而PPO 活性隨取食時間的延長也呈先升高后降低的趨勢，且在24、48、72 和96 h 時PPO 活性均顯著高于CK (P<0.05)，其中在72 h 時達到最高，為CK 的2.10 倍；在48 h 時次之，為CK 的1.80 倍。此外，蝗蟲取食24、48、72 和96 h 后， 毛花雀稗植株中TP 含量與CK 相比均顯著升高(P< 0.05)，且隨著取食時間的延長呈先升高后降低的趨勢。其中，在24 h 時TP 含量達到最高，為CK 的1.85 倍；在48、72 和96 h 時，分別為CK 的1.26、1.21 和1.38倍(圖3)。

圖3 蝗蟲取食不同時間后毛花雀稗TAL 和PPO 活性及TP 含量Figure 3 TAL, PPO activity and TP content of dallisgrass at different times after grasshoppers feeding

2.4 其他防御酶LOX、GST 和PAL 活性變化

蝗蟲取食脅迫24、48、72、96 h 后，毛花雀稗植株中LOX 活性隨取食時間的延長呈先升高后降低再升高的變化趨勢，除72 h 外，LOX 活性在24、48 和96 h 時均顯著高于CK (P< 0.05)，尤其是取食48 h 后LOX 活性達到最高，為CK 的1.50 倍。毛花雀稗植株中GST 活性變化更為明顯，且隨蝗蟲取食脅迫時間的延長呈先升高后降低的趨勢，與CK 相比，在取食24、48、72 和96 h 后GST 活性均顯著升高(P< 0.05)。其中，在24 h 時GST 活性達到最高，為CK 的21.25 倍；取食48 h 時GST 活性次之，為CK 的13.75 倍。相反，PAL 活性隨取食時間的推移呈先降低后升高趨勢，與CK 相比，取食24、48、72 和96 h 后PAL 活性均顯著降低(P< 0.05) (圖4)。

圖4 蝗蟲取食不同時間后毛花雀稗LOX、GST 和PAL 活性Figure 4 LOX, GST and PAL activity of dallisgrass at different times after grasshoppers feeding

3 討論

害蟲作為植物生長發(fā)育過程中的一種重要脅迫因子，能夠誘導植物體內產生大量活性氧(reactive oxygen species, ROS)毒害物質[18-19]。而總抗氧化能力是評價生物體內氧化還原狀況的有效指標，能夠反映生物體系中氧化劑與抗氧化劑之間的動態(tài)平衡關系[20]。本研究中，蝗蟲取食脅迫24 h 時，毛花雀稗植株中總抗氧化能力顯著高于對照組，說明蝗蟲取食促進了毛花雀稗植株中ROS 累積，植株體內活性氧清除系統(tǒng)的清除能力加強，以便清除多余的自由基。隨著蝗蟲取食時間的延長，總抗氧化能力呈先升高后降低再升高的趨勢，在一定程度上反映出長時間的取食脅迫使毛花雀稗植株不能有效地清除多余的自由基，從而無法抵御自由基造成的損傷[21]。

POD、CAT 和SOD 作為植物防御系統(tǒng)中主要的抗氧化酶，在清除植物體內多余氧化自由基、維持體內活性氧的平衡中起到重要作用[22-23]。例如，端大薊馬(Megalurothrips distalis)成蟲和若蟲取食脅迫菜豆 (Phaseolus vulgaris)、豇豆(Vigna unguiculata)和蠶豆(Vicia faba)后，葉片中抗氧化酶活性隨著取食時間的延長而升高[24]。在害蟲脅迫下，抗氧化酶活性的變化與植株部位、酶的種類有關。例如，綠盲蝽(Apolygus lucorum)取食脅迫冬棗(Ziziphus jujuba)后，嫩葉中SOD、CAT、POD 活性顯著升高，棗蕾中SOD 活性無明顯變化，而POD、CAT 活性顯著升高，花朵與幼果中SOD、POD 活性無顯著變化，而CAT 活性顯著升高[25]；斜紋夜蛾、二斑葉螨和西花薊馬取食脅迫菜豆植株后，植物體內抗氧化酶活性顯著升高[10]。在本研究中也發(fā)現，蝗蟲取食脅迫后，毛花雀稗植株中POD 和CAT 活性在某些取食時間下出現顯著增強，而SOD 活性在大取食時段下出現顯著降低，表明蝗蟲取食脅迫下能激發(fā)POD 和CAT 積極參與植物防御反應，以維持正常代謝。

酚類物質是植物體內代表性的防御物質，一些研究者認為植物體內酚類物質的變化與阻止害蟲取食的防御作用密切相關[26-28]。本研究中發(fā)現蝗蟲取食脅迫不同時間后毛花雀稗植株中TAL 活性和TP 含量均顯著升高，這與胡楊(Populus euphratica)、印加樹(Inga vera)幼苗植株遭害蟲脅迫后葉片中總酚的變化規(guī)律相一致[29-30]。據張紹升等[31]報道，TAL是酚類物質合成過程中的關鍵酶，其活性的升高有利于酚類物質的形成。此外，有研究表明植物遭受害蟲脅迫時，組織的腔室結構釋放出PPO，而PPO是酚類代謝系統(tǒng)中的關鍵酶，酚類物質經PPO 催化后生成木質素及醌類化合物，構成保護性屏蔽阻礙昆蟲取食，醌類物質有一定毒性，能夠對害蟲形成有力的防御作用[32-33]。在本研究中，蝗蟲取食脅迫不同時間后毛花雀稗植株中PPO 活性均顯著升高。這些結果表明毛花雀稗受到蝗蟲取食脅迫后，能通過誘導防御酶TAL 催化合成更多的酚類物質，并進一步通過提高PPO 活性以催化酚類物質生成木質素及醌類化合物來抵御蝗蟲取食為害。

植物GST 是一種普遍存在的參與多種細胞功能的蛋白酶，參與初生代謝、次生代謝，能減少除草劑毒害、使植物免受氧化損傷及隔離異源物質等[34]。本研究發(fā)現，蝗蟲取食脅迫不同時間后毛花雀稗植株中GSTs 活性均顯著升高，這利于保護植物免受氧化損傷；同時，蝗蟲在取食過程中難免會將一些唾液分泌到植株及傷口處，GST 作為異源物質的隔離保護酶能夠發(fā)揮重要作用。另外，本研究還發(fā)現蝗蟲取食后，植株中LOX 活性顯著升高(72 h 除外)，LOX 作為一種廣泛存在于植物體內的雙加氧酶，能夠催化植物體內多種多元不飽和酸發(fā)生一系列氧化反應最終生成茉莉酸(jasmonic acid)，而該途徑中生成的一系列環(huán)狀或脂肪族化合物在植物應對害蟲脅迫過程中發(fā)揮重要作用。因此，LOX 是毛花雀稗應對害蟲脅迫調控的關鍵酶之一[35-36]。此外，PAL 作為莽草酸代謝途徑中的一個限速酶，能夠催化L-苯丙氨酸脫氨基轉化為反式肉桂酸[37-38]。有研究發(fā)現害蟲脅迫能誘導PAL 活性上升[39]，而本研究中發(fā)現PAL 活性在蝗蟲取食脅迫不同時間后均顯著降低，其原因有待進一步探究。

4 結論

蝗蟲取食脅迫后，毛花雀稗體內POD、LOX、CAT、PPO、TAL、GST 活性以及TP 含量均出現在部分取食時間或所有取食時間下顯著升高。其中PPO、TAL 和GST 活性均隨取食時間的延長呈先升高后降低的變化趨勢，分別在72、48 和24 h 時達到最高，且顯著高于對照。相反，PAL 和SOD (24 h 除外)活性在蝗蟲取食脅迫下均顯著降低。總之，POD、CAT、PPO、TAL、GST 和LOX 等防御酶在毛花雀稗防御害蟲脅迫中發(fā)揮了非常重要的保護作用。