丁曉東，張 晴，于海燕，劉圓明，李明龍，肖佳雷

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物功能基因重點實驗室，哈爾濱 150030；2.望奎縣種子能源服務(wù)中心，黑龍江 望奎 152100）

大豆（Glycinemax）蛋白含量和出油率高，種植面積廣泛，是我國重要糧食作物之一[1-2]。其中栽培大豆對淹水脅迫較為敏感，當發(fā)生澇害時，其根系淹水漚根，葉片黃化，大豆光合速率、株高、莢果數(shù)和種子產(chǎn)量降低[3-4]。野生大豆是栽培大豆親緣種，在形態(tài)上具有發(fā)達根系和柔性藤蔓狀枝干，在基因水平上具有遺傳多樣性，對環(huán)境適應(yīng)性強，對澇害具有較強耐受性[5]。研究野生大豆淹水脅迫分子調(diào)控機制，可為大豆抗?jié)称贩N育種提供理論基礎(chǔ)。同時，來自野生大豆的優(yōu)良基因可直接應(yīng)用于栽培大豆育種，解決栽培大豆對淹水脅迫較為敏感的問題，對實現(xiàn)栽培大豆品種改良具有重要意義。

植物蔗糖非發(fā)酵-1-相關(guān)蛋白激酶-1在參與生長發(fā)育、基礎(chǔ)代謝、脅迫應(yīng)答以及碳氨代謝等多項生理活動中發(fā)揮重要作用[6-8]。Lovas等最早發(fā)現(xiàn)植物SnRK1蛋白激酶在馬鈴薯高鹽脅迫下敏感性，發(fā)現(xiàn)馬鈴薯反義StubGAL83基因在高鹽脅迫下根細胞較小比野生型更為敏感；SnRK1蛋白激酶可通過改變淀粉合成，將其回流到植物根中，從而影響地上部分植物口感，減少食草性動物食用[9]。番茄葉片中SISNF基因在干旱脅迫下表達量升高，猜想番茄SISNF基因參與干旱脅迫調(diào)控[10]。Kudahettige等發(fā)現(xiàn)在淹水處理下，擬南芥中過量表達水稻SnRK1基因，促進植物體內(nèi)淀粉降解，提升對植物細胞能量供給和植物存活能力[11]。但SnRK1如何響應(yīng)淹水脅迫，增強植物抗逆性的分子機制尚不明確。

由于栽培大豆是重要糧食作物，其野生近緣種野生大豆對環(huán)境適應(yīng)環(huán)境能力強，喜水耐濕，多生于山野以及河流沿岸、濕草地、湖邊、沼澤等地，因此野生大豆是研究耐淹水基因重要植物材料。為研究GsSnRK1.1蛋白激酶在淹水脅迫中作用與功能，在野生大豆（Glycinesoja）中克隆GsSnRK1.1基因、啟動子及點突變基因；在Col-0野生型擬南芥中超表達以35S啟動子驅(qū)動的GsSnRK1.1、GsSnRK1.1（T176A）、GsSnRK1.1（T176E）和GsSnRK1.1（K49M）基因，獲得轉(zhuǎn)基因植株；通過對野生大豆不同時間淹水處理，利用RT-qPCR分析GsSnRK1.1基因在淹水脅迫條件下時空表達模式，同時也對pGsSnRK1.1::GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥植株作GUS染色，從側(cè)面印證qRT-PCR數(shù)據(jù)正確性；將GsSnRK1.1基因在擬南芥中過量表達，測定其葉綠素、SOD和Pro等生理指標，以及ADH1（EC1.1.1.1）、PDC1（EC4.1.1.1）標記淹水應(yīng)激反應(yīng)基因在Col-0與轉(zhuǎn)基因擬南芥中基因表達。試驗對GsSnRK1.1基因功能驗證分析，為探究大豆抗?jié)称贩N選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

野生大豆為Glycine soja（G07256），擬南芥為Columbia-0，以pCAMBIA3301和pCAMBIA2300為植物表達載體。研究所用菌株為農(nóng)桿菌GV3101和大腸桿菌DH5α。以上材料均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物與環(huán)境互作實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 總RNA、總DNA提取及cDNA合成

將飽滿且無病蟲害野生大豆（G07256）種子用濃硫酸處理6～10 min去除種皮表面泥膜，倒掉濃硫酸，自來水沖洗5次。沖洗后種子放在含濕潤濾紙培養(yǎng)皿上，為其提供萌發(fā)所需水分，25℃黑暗培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為2～3 d。當種子發(fā)芽達到2 cm時，轉(zhuǎn)移至人工氣候室水培，設(shè)置溫度為25℃，營養(yǎng)液每隔2～3 d更換一次。待幼苗生長至六葉期時，使用相應(yīng)試劑盒提取總RNA/DNA以及反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.2.2 基因克隆

根據(jù)NCBI基因數(shù)據(jù)庫所提供GsSnRK1.1（KHN13196）基因及其啟動子CDS全長序列信息，使用Primer Premier 5.0設(shè)計引物。克隆所用模板為野生大豆cDNA和DNA，作基因及啟動子序列擴增。進一步根據(jù)位點設(shè)計引物，引物序列如表1所示。通過引物重疊PCR方法獲得激酶調(diào)控區(qū)域失活的轉(zhuǎn)錄本GsSnRK1.1（T176A）、激酶調(diào)控區(qū)域模擬磷酸化的轉(zhuǎn)錄本GsSnRK1.1（T176E）和催化區(qū)域失活的轉(zhuǎn)錄本GsSnRK1.1（K49M）基因片段。其中將GsSnRK1.1第176位蘇氨酸（Thr，T）密碼子替換為谷氨酸（Glu，E）與丙氨酸（Ala，A）密碼子，第49位賴氨酸（Lys，K）密碼子突變?yōu)榧琢虬彼幔∕et，M）密碼子。KpnⅠ-XbaⅠ內(nèi)切酶酶切pCAMBIA2300質(zhì)粒使之線性化，再利用T4DNA連接酶構(gòu)建超表達載體，獲得p2300-35S-Myc-GsSnRK1.1、p2300-35S-Myc-GsSnRK1.1（T176A）、p2300-35S-Myc-GsSnRK1.1（T176E）、p2300-35SMyc-GsSnRK1.1（K45M）超表達載體；Eco RⅠ-NcoⅠ內(nèi)切酶酶切pCAMBIA3301質(zhì)粒使之線性化，利用T4DNA連接酶將GsSnRK1.1基因內(nèi)源啟動子替換載體原本35S啟動子獲得p3301-GsSnRK1.1P-GUS啟動子報告表達載體；BglⅡ-BstEⅡ內(nèi)切酶酶切p3301-GsSnRK1.1P-GUS，再利用同源重組試劑盒構(gòu)建載體，獲得p3301-GsSnRK1.1P-Myc-GsSnRK1.1

1.2.3 轉(zhuǎn)基因植株獲得

利用凍融法將構(gòu)建成功的過表達載體和啟動子驅(qū)動GUS基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，而后農(nóng)桿菌侵染模式植物擬南芥，使用方法為蘸花法[12]。種植完成侵染的擬南芥種子，長出兩片子葉時開始噴灑抗生素篩選轉(zhuǎn)基因植株，其中利用卡納霉素和除草劑（Basta）分別噴灑pCAMBIA2300和pCAMBIA3301載體侵染的擬南芥。篩選過后對其作PCR和Western blot鑒定，確定是否為轉(zhuǎn)基因純合體株系。

1.2.4 表型分析及生理指標測定

為模擬長時間淹水情況，將擬南芥野生型和缺失突變體種子置于滅菌EP管中，加入1 mL 30%NaClO，消毒15 min，用滅菌ddH2O清洗種子6～8次，最后向EP管中加入適量滅菌ddH2O，4℃春化處理48 h。用滅菌牙簽將種子點在含0.8%瓊脂和1%蔗糖的1/2MS固體培養(yǎng)基試管中，將試管置于人工氣候箱中培養(yǎng)。待植物生長至四葉期時，將10 mL經(jīng)高壓滅菌過蒸餾水小心灌入每個試管中，黑暗中放置37 d，觀察其表型并測定生理指標。

1.2.5 淹水應(yīng)激反應(yīng)標記基因表達分析

對淹水脅迫處理37 d擬南芥幼苗提取總RNA，利用RT-qPCR測量乙醇脫氫酶1（ADH1；At1g77120）和丙酮酸脫羧酶1（PDC1；At4g33070）標記基因?qū)ρ退{迫的響應(yīng)。

1.2.6 野生大豆GsSnRK1.1表達特性分析

將三周齡野生大豆幼苗完全浸沒至水中處理2 d，分別在0、6、12、24及48 h不同時間點取樣；選用Plant RNA Kit（OMEGA）提取總RNA，使用ReverTra Ace qPCRRTMaster MIX with gDNA Remover cDNA試劑盒（TOYOBO）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，使用SYBRGreen試劑盒（TOYOBO）對GsSnRK1.1基因作實時熒光定量PCR，結(jié)果分析采用比較CT法（ΔΔCT法）。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生大豆GsSnRK1.1基因克隆與序列分析

PCR擴增結(jié)果見圖1，獲得GsSnRK1.1基因、啟動子及點突變基因，其中基因長度為1 548 bp，啟動子長度為1 663 bp，因此選擇DL2000 DNA Marker。經(jīng)克隆、測序確定GsSnRK1.1為所需研究基因。

圖1 野生大豆GsSnRK1.1基因克隆及點突變測序Fig.1 GsSnRK1.1 gene cloning and point mutation sequencing

2.2 野生大豆GsSnRK1.1基因表達響應(yīng)淹水脅迫

SnRK1是一種廣泛存在于植物體內(nèi)的Ser/Thr蛋白激酶，其蛋白活性對植物體生長發(fā)育、新陳代謝及非生物脅迫抗逆具有重要作用。為探究野生大豆GsSnRK1.1基因?qū)ρ退{迫的響應(yīng)，分別對野生大豆淹水處理0、6、12、24和48 h，并對不同淹水時間處理野生大豆內(nèi)源GsSnRK1.1基因作轉(zhuǎn)錄水平分析。結(jié)果如圖2所示，隨淹水處理時間增加，野生大豆中GsSnRK1.1基因轉(zhuǎn)錄水平隨之顯著升高。為進一步探究野生大豆GsSnRK1.1基因啟動子對淹水脅迫的響應(yīng)，構(gòu)建pGsSnRK1.1::GUS穩(wěn)定表達株系，GUS染色結(jié)果如圖3所示，可觀察到與未淹水處理對照組相比，淹水處理后染色效果更為明顯，說明GsSnRK1.1基因啟動子感知淹水脅迫進而促進基因轉(zhuǎn)錄。

圖2 GsSnRK1.1在淹水脅迫下表達模式Fig.2 Expression pattern of GsSnRK1.1 gene under waterlogging stress

圖3 淹水脅迫下proGsSnRK1.1:GUS轉(zhuǎn)基因幼苗GUS染色Fig.3 GUSstaining of proGsSnRK1.1::GUS transgenic seedlings under waterlogging stress

2.3 GsSnRK1.1及其點突變在擬南芥中超表達鑒定

為研究GsSnRK1.1蛋白激酶在植物抵抗淹水脅迫中功能，將GsSnRK1.1及其3個活性位點突變基因在Col-0擬南芥中超表達。以atkin10為陰性對照，利用相應(yīng)抗性篩選后獲得T1代，再利用T5 Direct PCR（plant）試劑盒對初步篩選得到的轉(zhuǎn)基因植株作基因型鑒定，如圖4所示，Col-0超表達植株對GsSnRK1.1及其3個位點突變基因作PCR鑒定，基因長度為1 548 bp。

圖4 GsSnRK1.1及其3個點突變基因超表達植株P(guān)CR鑒定Fig.4 PCR identification of overexpressed plantswith GsSnRK1.1 and three point mutated genes

從鑒定正確的T1代單個植株上收集種子，進一步對T2代作抗性和基因型篩選，獲得純合T3植株。為進一步確認轉(zhuǎn)基因超表達和回補T3代擬南芥中蛋白表達，提取擬南芥葉片蛋白，并作Western blot蛋白水平測定，結(jié)果如圖5所示，通過anti-Myc抗體驗證確定35S啟動子驅(qū)動的Myc-GsSnRK1.1、Myc-GsSnRK1.1（T176E）、Myc-GsSnRK1.1（T176A）、Myc-GsSnRK1.1（K49M）和空載體轉(zhuǎn)化的純合T3代中靶蛋白表達水平。

圖5 轉(zhuǎn)基因擬南芥Western blot蛋白水平檢測Fig.5 Western blot protein level detection of transgenic Arabidopsis thaliana

2.4 GsSnRK1.1在淹水脅迫下生理指標測定

為進一步確定GsSnRK1.1蛋白激酶在淹水脅迫中生理功能，本研究利用超表達GsSnRK1.1、GsSnRK1.1（T176A）、GsSnRK1.1（T176E）和GsSnRK1.1（K49M）研究擬南芥轉(zhuǎn)基因植株。如圖6所示，Col-0綠化程度略高于atkin10，但并不明顯；表達GsSnRK1.1蛋白激酶和模擬磷酸化GsSnRK1.1蛋白激酶（OE#T176E）的擬南芥葉片明顯呈綠色，且比Col-0綠化程度更高；而表達催化區(qū)域失活的GsSnRK1.1蛋白激酶（OE#K49M）和表達調(diào)控區(qū)域失活的GsSnRK1.1蛋白激酶（OE#T176A）的擬南芥在淹水條件下明顯葉片失綠，且比atkin10綠化程度更低；進一步測定各株系葉綠素含量，如圖7所示，葉綠素含量與表型相符，說明GsSnRK1.1蛋白激酶活性可降低擬南芥在淹水條件下葉片失綠。

圖6 淹水脅迫下轉(zhuǎn)基因株系表型Fig.6 Phenotypesof transgenic linesunder waterlogging stress

圖7 淹水脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥葉綠素含量Fig.7 Chlorophyll content of transgenic Arabidopsis thaliana under waterlogging stress

測定經(jīng)淹水脅迫處理后轉(zhuǎn)基因擬南芥體內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）和脯氨酸（Pro）含量，并計算淹水處理前后SOD和Pro含量增加倍數(shù)。如圖8A所示，經(jīng)淹水脅迫后，Col-0體內(nèi)SOD酶活增加約20倍，OE#GsSnRK1.1和OE#T176E體內(nèi)SOD酶活增加倍數(shù)約為35倍，且顯著高于Col-0；OE#T176A體內(nèi)SOD酶活增加約10倍，OE#K49M體內(nèi)SOD酶活增加約7倍，atkin10體內(nèi)SOD酶活增加約6倍，均顯著低于Col-0。如圖8B所示，淹水處理后，Col-0體內(nèi)Pro含量增加約50倍，OE#GsSnRK1.1和OE#T176E體內(nèi)Pro含量增加倍數(shù)分別約為140倍和170倍，且顯著高于Col-0株系；OE#T176A體內(nèi)Pro含量增加約23倍，OE#K49M體內(nèi)Pro含量增加約24倍，atkin10株系中Pro含量增加約20倍，且三者均顯著低于Col-0株系。由此說明，GsSnRK1.1可提高擬南芥SOD活性和Pro含量以抵抗淹水脅迫。

圖8 淹水脅迫下轉(zhuǎn)基因株系中SOD和Pro含量增加倍數(shù)Fig.8 Fold increase of SOD and Pro contents of transgenic lines under waterlogging stress

2.5 GsSnRK1.1影響淹水應(yīng)激反應(yīng)標記基因表達

乙醇脫氫酶1（ADH1）和丙酮酸脫羧酶1（PDC1）是標記淹水應(yīng)激反應(yīng)基因，為檢測SnRK1活性對氧缺乏期間基因調(diào)節(jié)的影響，測定ADH1和PDC1標記基因在淹水脅迫下表達。如圖9所示，ADH1和PDC1在Col中上調(diào)，并在表達OE#GsSnRK1.1（野生型GsSnRK1.1）和OE#GsSnRK（T176E）（表達模擬磷酸化GsSnRK1.1）轉(zhuǎn)基因植物中進一步上調(diào)，但在OE#GsSnRK1.1（T176A）和OE#GsSnRK1.1（K49M）（表達無激酶活性的GsSnRK1.1）轉(zhuǎn)基因植物中幾乎未發(fā)生ADH1和PDC1基因上調(diào)。結(jié)果表明，GsSnRK1.1誘導(dǎo)淹水應(yīng)激反應(yīng)的兩個標記基因表達，其依賴于GsSnRK1.1蛋白激酶活性。

圖9 淹水應(yīng)激反應(yīng)標記基因表達模式Fig.9 Expression pattern of marker genes for stress responseto flooding

3 討論

植物中蔗糖非發(fā)酵-1-相關(guān)蛋白激酶-1（SnRK1）與酵母SNF1和哺乳動物（AMPK）同源[11]。其中SnRK1蛋白激酶在感應(yīng)新陳代謝方面具有重要意義，可抵抗各種壓力并保持能量穩(wěn)態(tài)[12]。SnRK1在植物抵抗生物及非生物脅迫過程中發(fā)揮作用，添加葡萄糖和ABA處理時，超表達SnRK1植株對ABA敏感程度更強。PP2C被ABA降低進一步提高SnRK1活性，通過兩個互補過程相互作用增強應(yīng)激反應(yīng)，并為ABA和糖信號通路之間廣泛遺傳相互作用提供解釋[14-15]。SnRK1α植物防御機制在食草動物、真菌、細菌和病毒中扮演重要角色[16-17]。首次發(fā)現(xiàn)植物SnRK1參與脅迫響應(yīng)是反義表達StubGAL83的馬鈴薯對高鹽脅迫極其敏感[18]。AtKIN10（SnRK1.1）在擬南芥耐淹性和抗鹽信號途徑調(diào)節(jié)過程中存在拮抗作用[19]。擬南芥（Arabidopsis thaliana）SnRK1活性提升擬南芥耐淹水能力，參加控制脅迫耐受的信號途徑存在特異性，超表達失去激酶活性的OsSnRK1或者AtKIN10突變轉(zhuǎn)錄本植株，在淹水處理下其葉片明顯白化[20]。本研究發(fā)現(xiàn)GsSnRK1.1可提高轉(zhuǎn)基因擬南芥對淹水脅迫抗性，且在抵抗淹水脅迫中GsSnRK1.1蛋白激酶酶活性發(fā)揮關(guān)鍵作用。

植物受淹水脅迫后降低光合速率，進而影響其生長發(fā)育及產(chǎn)量收益，因此挖掘和利用抗逆基因資源對提高作物抗逆性非常重要。本研究選用野生大豆為植物材料，從中克隆GsSnRK1.1基因，通過多序列比對發(fā)現(xiàn)其蛋白結(jié)構(gòu)中保守的STKc-AMPK-alpha結(jié)構(gòu)域，以及對于行使蛋白激酶功能十分重要的保守氨基酸位點：K49和T176。其中第176位蘇氨酸（Thr，T）是受上游激酶調(diào)控的特異性磷酸化位點，當其被上游激酶磷酸化，則激活催化區(qū)域第49位賴氨酸（Lys，K）從而磷酸化下游底物蛋白，影響植物生長發(fā)育。在Col-0野生型擬南芥中超表達以35S啟動子驅(qū)動GsSnRK1.1、GsSnRK1.1（T176A）、GsSnRK1.1（T176E）和GsSnRK1.1（K49M）基因，獲得轉(zhuǎn)基因植株，檢測GsSnRK1.1蛋白激酶活性對淹水脅迫標記基因調(diào)節(jié)的影響，并測定ADH1和PDC1標記基因在淹水脅迫下基因表達，結(jié)果表明，野生大豆GsSnRK1.1誘導(dǎo)淹水應(yīng)激反應(yīng)的兩個標記基因表達，GsSnRK1.1基因?qū)ρ退{迫響應(yīng)，且參與淹水應(yīng)激反應(yīng)調(diào)控。有關(guān)GsSnRK1.1蛋白激酶對淹水脅迫下大豆根系乙醇脫氫酶、活性氧代謝系統(tǒng)及碳氮代謝等影響仍需進一步研究。