歐陽譚亮，武志娟，信金偉，柴志欣，王吉坤，王海波，張 明，鐘金城*

（1.青藏高原動物遺傳資源保護與利用四川省、教育部重點實驗室，成都 610041；2.省部共建青稞和牦牛種質資源與遺傳改良國家重點實驗室，拉薩 850002）

基質金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinases，MMPs）是一類在動物組織中廣泛存在、結構相近而功能復雜的Zn2+、Ca2+依賴性蛋白水解酶家族，可由骨骼肌干細胞、平滑肌細胞、成肌細胞等多種肌細胞分泌[1-2]，主要通過介導細胞外基質（Extracellular matrix，ECM）降解參與調控肌肉生長發(fā)育過程。根據(jù)MMPs降解底物及結構特征可將其分為6種類型：明膠酶、膠原酶、間質溶解素、基質溶解因子、膜型基質金屬蛋白酶及其他類型基質金屬蛋白酶。明膠類酶MMPs包含MMP-2和MMP-9兩種，在機體中主要受基質金屬蛋白酶抑制劑（Matrix metalloproteinase inhibitor，TIMP）調控，與TIMPs互作可調控肌肉組織相關功能。

研究顯示，畜禽肌肉生長發(fā)育程度與其肉品質高度相關，明膠類酶MMPs可通過降解底物調控肌肉ECM中膠原蛋白含量，參與肌肉生長發(fā)育及修復等生物過程[3-4]，影響肌肉品質。Michenlin等發(fā)現(xiàn)，富含大理石紋的牛肌肉組織ECM中含有大量膠原蛋白，且肌纖維含量高的牛肉中MMP-2酶活性也更高[5]。祁艷霞等通過分析不同年齡南陽牛背最長肌中MMP-2、MMP-3和MMP-13基因表達水平與肉質指標關系，發(fā)現(xiàn)MMP-2與肌內脂肪（Intramuscular Fat，IMF）沉積相關，且在背最長肌中表達水平隨年齡增長顯著下降[6]。Park等發(fā)現(xiàn)在閹牛和公的背最長肌中，MMP-9表達量與肌纖維含量呈正相關[7]。

牦牛具有抗逆、耐粗飼、抗病能力強等優(yōu)勢，是青藏高原不可或缺的重要畜種[8]。牦牛肉具有高蛋白、低脂肪，富含多種營養(yǎng)物質等特點，是優(yōu)質天然的綠色食品。牦牛骨骼肌生長發(fā)育，對其肉質有重要影響。研究表明，MMP-2與MMP-9對普通牛肉質均有影響，但有關牦牛MMP-2、MMP-9基因相關研究尚未見報道。此外，相關研究顯示明膠類酶MMPs在動物心肌組織中表達，可防止動物心肌肥大[9-10]，且MMP對牦牛低氧適應性也具有影響[11]。本研究通過對牦牛MMP-2和MMP-9基因測序及生物信息學分析、組織差異表達研究，探索其對牦牛肉質與肌肉生長發(fā)育的影響，以期為牦牛良種選育和改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

于四川省阿壩藏族羌族自治州紅原縣選取0.5、1.5和2.5歲健康麥洼牦牛各3頭，分別采集心臟和臀大肌組織，使用DEPC水沖洗干凈，錫箔紙包裹，將其迅速置于液氮中保存，帶回實驗室備用。

試驗主要試劑：TaqDNA聚合酶、dNTPs購自博邁德生物公司；RNA提取試劑Trizol購自Invitrogen公司；RNA反轉錄試劑盒、TBGreen Premix ExTaqⅡ均購自TaKaRa公司；瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；鼠抗MMP-2、MMP-9單克隆抗體購自美國Novus Biologicals公司。

1.2 基因克隆與測序

利用Trizol法提取組織總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA片段，紫外分光光度計檢測RNA濃度及純度，反轉錄為cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

參照GenBank中黃牛MMP-2 mRNA序列（NM_174745.2）和MMP-9 mRNA序列（NM_174744.2），選取GAPDH（XM_014482068）為內參基因，利用Primer Premier 5軟件和NCBIPrimer-BLAST在線軟件設計引物，分別擴增MMP-2和MMP-9基因CDS區(qū)，根據(jù)克隆所得序列設計實時熒光定量PCR引物（見表1），引物由北京擎科梓熙（成都）生物技術有限公司合成。

PCR擴增體系（15μL）：上下游引物各0.6μL、cDNA模板0.6μL、ddH2O 5.7μL、2×TaqPCR MasterMix 7.5μL。PCR反應條件：95℃預變性5 min，95℃變性30 s，退火溫度見表1，72℃延伸90 s，循環(huán)35次，72℃延伸7 min，4℃保存。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。測序所得序列利用DNAMAN軟件拼接組裝，獲得牦牛MMP-2和MMP-9基因序列，NCBI-BLAST在線比對工具核對CDS區(qū)。

表1 牦牛MMP-2和MMP-9基因克隆引物序列信息Table 1 Primer sequence of yak MMP-2 and MMP-9 genes for cloning

續(xù)表

1.3 組織差異表達分析

分析MMP-2、MMP-9及其相關基因和底物基因MMP-14、TIMP-2、CL1A1（Ⅰ型膠原蛋白）和CL3A1（Ⅲ型膠原蛋白）在0.5、1.5和2.5歲牦牛心肌和臀大肌組織中表達量。反應體系（10μL）：TB Green Premix ExTaqⅡ5μL、上下游引物各0.4μL、ddH2O 3.2μL、模板cDNA 1μL。反應程序：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，共40個循環(huán)。

1.4 免疫組織化學分析

將不同年齡牦牛臀大肌從4%多聚甲醛固定液中取出，制成石蠟切片，使用5%胎牛血清封閉，分別以鼠抗MMP-2、MMP-9單克隆抗體（1∶100）為一抗，4℃孵育過夜；以辣根過氧化物酶標記的多聚山羊抗鼠IgG（1∶200）為二抗。經免疫組化觀察MMP-2和MMP-9蛋白在不同年齡牦牛臀肌中表達情況。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

每個基因分別設置3個生物學重復和3個技術重復，以GAPDH為內參采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。利用SPSS22.0軟件作單因素方差分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。利用Image-Pro Plus 6.0測定肌纖維著色面積及免疫組化相對平均光密度值，并用GraphPad Prism5繪制MMP-2、MMP-9在臀大肌和心臟組織中mRNA轉錄水平和組化結果分析圖。

2 結果與分析

2.1 牦牛MMP-2和MMP-9基因CDS區(qū)大小

分別獲得牦牛MMP-2和MMP-9基因片段長度一致的清晰條帶（見圖1），通過拼接可知MMP-2基因CDS區(qū)全長為1 983 bp，開放閱讀框1 209 bp，共編碼402個氨基酸；MMP-9基因CDS區(qū)全長為2 137 bp，開放閱讀框1 329 bp，編碼442個氨基酸，序列信息已提交NCBI，MMP-2和MMP-9登錄號分別為MZ476247和MZ476248。

圖1 牦牛MMP-2和MMP-9基因PCR擴增結果Fig.1 PCRamplification resultsof MMP-2 and MMP-9 genesin yak

2.2 牦牛MMP-2和MMP-9基因似性及系統(tǒng)進化關系

利用MegAlign 7.0軟件分別將牦牛MMP-2和MMP-9基因序列與穴兔、斑馬魚、小家鼠、黃牛、家雞、獼猴、灰倉鼠、野豬、家犬、綿羊、馬、北美虹鱒魚、虎斑頸槽蛇和烏鴉相應基因序列作比對（見表2）。

由表2可知，牦牛與黃牛序列相似性最高，與斑馬魚序列相似性最低。系統(tǒng)進化樹顯示，牦牛與黃牛親緣關系最近，其次是綿羊，而與斑馬魚、北美虹鱒魚、烏鴉和虎斑頸槽蛇等動物親緣關系最遠（見圖2）。

圖2 牦牛MMP-2（左）和MMP-9（右）基因系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of MMP-2(left)and MMP-9(right)

表2 牦牛MMP-2和MMP-9基因與其他物種序列相似性比對Table 2 Comparison of MMP-2 and MMP-9 sequence similarity between yak and other species

2.3 牦牛MMP-2和MMP-9蛋白理化性質預測

使用ExPASy中Prot Param和ProtScale程序預測MMP-2和MMP-9蛋白理化性質。結果表明，MMP-2和MMP-9蛋白均為親水性酸性蛋白，二者甘氨酸（Gly）含量最高，其次為天冬氨酸（Asp）和亮氨酸（Leu）；不穩(wěn)定系數(shù)分別為34.72和42.82，故MMP-2屬于穩(wěn)定蛋白，MMP-9屬于不穩(wěn)定蛋白。通過在線軟件ExPASy-TMpred、SignalP 5.0預測，發(fā)現(xiàn)MMP-2與MMP-9蛋白均無跨膜結構，且MMP-2無信號肽。利用NetPhos 3.1 Server預測MMP-2和MMP-9蛋白序列磷酸化位點，結果顯示MMP-2基因編碼氨基酸中共發(fā)現(xiàn)8個Ser磷酸化位點、7個Thr磷酸化位點、8個Tyr磷酸化位點；MMP-9基因編碼氨基酸包含6個Ser磷酸化位點、7個Thr磷酸化位點、3個Tyr磷酸化位點。利用NetNGlyc 1.0預測其O、N糖基化位點，結果表明，MMP-2蛋白包含5個O-糖基化位點（Thr279、Thr286、Thr289、Thr291、Thr386），MMP-9蛋白存在4個O-糖基化位點（Thr27、Thr37、Thr90、Thr273）。此外，MMP-2蛋白未檢測到N-糖基化位點，MMP-9則檢測到3個N-糖基化位點（Asn38、Asn120和Asn127）。

2.4 牦牛MMP-2和MMP-9蛋白亞細胞定位及保守結構域預測

利用在線軟件PSORT II Prediction分析牦牛MMP-2和MMP-9蛋白細胞亞定位，發(fā)現(xiàn)MMP-2蛋白主要分布于細胞質（65.2%）和細胞核（17.4%），在細胞骨架、液泡、高爾基體和囊泡中分布比例均為8.7%；MMP-9蛋白主要定位于細胞外基質（66.7%），其次為液泡（22.2%）和質膜（11.1%）。利用NCBI-CD Search預測牦牛MMP-2和MMP-9蛋白氨基酸序列保守結構域（見圖3）。結果顯示，牦牛MMP-2和MMP-9蛋白均含有纖連蛋白2型結構域（Fibronectin type 2 domain，F(xiàn)N2）和基質蛋白（Matrixin）。此外，MMP-9還有3個α螺旋組成的肽聚糖結合結構域，該結構域位于細菌細胞壁降解所涉及各種酶N或C末端，具有肽聚糖結合功能。

圖3 MMP-2和MMP-9保守結構域預測Fig.3 Prediction of MMP-2 and MMP-9 conserved domain

2.5 牦牛MMP-2和MMP-9蛋白高級結構及其功能

牦牛MMP-2和MMP-9蛋白二級結構均含有α-螺旋（Hh）、β-折疊（Tt）、無規(guī)則卷曲（Cc）和延伸鏈（Ee），其中MMP-2和MMP-9無規(guī)則卷曲含量均最高。在二級結構基礎上分析其三級結構，MMP-2與1gxd.2.A結構具有87.79%相似性，MMP-9與1l6j.1.A結構相似性為84.34%。兩種蛋白三級結構預測結果與二級結構結果一致（見圖4）。

圖4 牦牛MMP-2和MMP-9蛋白高級結構預測結果Fig.4 Prediction resultsof advanced structure of yak MMP-2 and MMP-9 proteins

利用Psipred-FFPred 3預測MMP-2和MMP-9蛋白質功能。結果顯示，兩種蛋白通過與金屬離子Ca2+和Zn2+結合實現(xiàn)主要功能，且與Zn2+結合更緊密；無信號肽結構的MMP-2其內肽酶活性和轉運調節(jié)比有信號肽的MMP-9更活躍，而MMP-9主要在細胞外區(qū)域發(fā)揮作用。STRING分析發(fā)現(xiàn)（見圖5），MMP-2與基質金屬蛋白酶抑制劑2（Metalloproteinase inhibitor 2，TIMP-2）蛋白相關性高達0.999，與MMP-14和Ⅰ型膠原蛋白（Collagenα-1，COL1A1）相關性分別高達0.955和0.991；MMP-9與TIMP-1和TIMP-2相關性分別高達0.995和0.992，且與膠原類MMPs（MMP-1、MMP-8）相關性均高達0.968。

圖5 MMP-2和MMP-9蛋白網絡互作分析Fig.5 MMP-2 and MMP-9 protein network interaction analysis

2.6 牦牛MMP-2和MMP-9基因組織表達水平

通過實時熒光定量PCR檢測MMP-2、MMP-9、MMP-14、TIMP-1、TIMP-2、CL1A1和CL3A1基因在0.5、1.5和2.5歲麥洼牦牛臀大肌和心臟中mRNA表達。結果見圖6，MMP-2和MMP-9在不同年齡牦牛臀大肌組織中表達水平均隨年齡增長而上升，MMP-2在0.5～2.5歲、1.5～2.5歲呈顯著差異（P＜0.05），MMP-9在0.5～1.5歲、0.5～2.5歲呈極顯著差異（P＜0.01）。MMP-14和CL3A1隨其年齡增長表達量顯著增加（P＜0.05），然而CL1A1表達隨年齡增長而下降，其中在0.5～1.5歲、1.5～2.5歲存在顯著差異（P＜0.05）。此外，TIMP-1和TIMP-2在牦牛不同年齡臀大肌組織中表達相對穩(wěn)定，差異不顯著。

圖6 牦牛MMP-2、MMP-9、MMP-14、TIMP-1、TIMP-2、CL1A1和CL3A1基因組織表達分析Fig.6 mRNA expression of yak MMP-2,MMP-9,MMP-14,TIMP-1,TIMP-2,CL1A1 and CL3A1 genes in different tissues

MMP-2和MMP-9在不同年齡牦牛心臟組織中mRNA表達隨年齡增長而增加。其中MMP-2在0.5～1.5歲呈顯著差異（P＜0.05），0.5～2.5歲、1.5～2.5歲呈極顯著差異（P＜0.01）。MMP-9在0.5～1.5歲、0.5～2.5歲呈極顯著差異（P＜0.01）。然而，MMP-14、TIMP-1、TIMP-2、CL1A1和CL3A1在0.5、1.5、2.5歲牦牛心臟組織中表達量差異均不顯著。

MMP-2在同一年齡臀大肌mRNA表達水平均高于心臟組織，分別在0.5歲和2.5歲呈極顯著差異（P＜0.01），1.5歲呈顯著差異（P＜0.05）。MMP-9在臀大肌和心臟中的mRNA表達差異不顯著。

2.7 牦牛MMP-2和MMP-9蛋白在臀大肌中表達

采用免疫組化技術檢測MMP-2和MMP-9蛋白在不同年齡牦牛臀大肌組織中表達情況（見圖7），發(fā)現(xiàn)二者均呈隨年齡增長呈增加趨勢，其中MMP-2在0.5～1.5、0.5～2.5歲呈極顯著差異（P＜0.01），MMP-9在0.5～2.5、1.5～2.5歲呈極顯著差異（P＜0.01）。

圖7 不同年齡牦牛臀大肌中MMP-2和MMP-9蛋白表達分布Fig.7 Expression of MMP-2 and MMP-9 in gluteus maximus at different ages

3 討論

MMP-2和MMP-9基因已被證明可在牛[6-7]、豬[12]、雞[13]等畜禽肌肉生長發(fā)育調控中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)牦牛MMP-2和MMP-9編碼氨基酸中甘氨酸含量均最高，其次分別為天冬氨酸和亮氨酸。甘氨酸是保證肉質風味所必需前體氨基酸，含較多甘氨酸的肉質味道鮮美，營養(yǎng)豐富[14]。亮氨酸作為支鏈氨基酸一種，有助于促進人體訓練后肌肉損傷修復，可通過下調雄性激素或減少肌蛋白分解的方式減輕肌肉勞損并防止骨骼肌損傷[15]。本研究結果表明，明膠類酶MMPs對牦牛肉質有影響。心臟收縮所需能量來源之一是通過TCA循環(huán)氧化脂肪酸天冬氨酸合成過程，從而生成大量ATP。作為賴氨酸等其他氨基酸合成前體之一的天冬氨酸，其合成可緩解因壓力超負荷引起的心臟肥大，起改善心肌收縮功能、保護心肌作用[16]，所以明膠類酶MMPs蛋白中天冬氨酸對心臟功能也有影響。MMPs主要通過對組織ECM中膠原蛋白降解調控肌肉生長發(fā)育，同時明膠類酶MMPs作為FN2結構域（可識別、捕獲明膠）超家族分支之一，利用該結構域可增強肌肉調控等相關功能。MMP-2激活時形成pro-MMP-2/MMP-14/TIMP-2三聯(lián)體，可促進明膠酶捕獲ECM膠原，增強水解膠原能力[17]。這與本研究對牦牛明膠類酶MMPs蛋白互作預測分析結果相符。MMP-9與膠原類MMPs相關性均高達0.968，表明MMP-9對各類膠原蛋白有較強降解效果，而蛋白功能互作預測也為明膠類酶MMPs在肌肉組織ECM中對關鍵底物膠原蛋白水解提供理論依據(jù)。此外，MMP-2和MMP-9蛋白均含有多個磷酸化位點和糖基化位點，MMPs磷酸化與糖基化對酶活性調控有重要作用。Sariahmetoglu等使用堿性磷酸酶對MMP-2蛋白酶中Thr250、Tyr271、Ser32、Ser160和Ser365磷酸化位點進行去磷酸化反應，發(fā)現(xiàn)MMP-2酶活性由此提升，但MMP-9與MMP-2磷酸化產生效果存在差異[18]。Nam等研究發(fā)現(xiàn)人類胃上皮細胞被幽門螺旋桿菌感染后，細菌釋放CagA毒力因子可激活細胞ERK磷酸化信號通路中的SHP-2酪氨酸磷酸酶，侵染后細胞MMP-9活性因酪氨酸磷酸化而增強[19]。Ru等發(fā)現(xiàn)CD147（心肌細胞上廣泛表達的跨膜糖蛋白）糖基化，可誘導心臟中MMP-2和MMP-9分泌和活化，促進MMPs降解I型和III型膠原蛋白，緩解因膠原交聯(lián)引起心肌肥大[20]。明膠類酶MMPs均為分泌蛋白[21]，而本研究結果顯示MMP-2無N-糖基化位點、無信號肽，MMP-2催化域的前肽區(qū)存在一個半胱氨酸開關基序[22]，可通過磷酸化通路如ERK1/2進行激活和分泌[10]，且pro-MMP-2可在細胞膜上與MMP-14和TIMP-2結合，形成pro-MMP-2/MMP-14/TIMP-2三聯(lián)體，故經分析認為MMP-2通過此方式分泌細胞[17]。根據(jù)信號肽假說，牦牛MMP-2可能是一類非典型分泌蛋白[23]，具體研究有待進一步驗證。

牦牛MMP-2和MMP-9蛋白在細胞內、外均有分布。Yeghiazaryan等利用明膠酶譜法檢測經運動訓練后小鼠比目魚肌中活性MMP-2和MMP-9分布情況[24]，發(fā)現(xiàn)肌細胞核內MMP-2酶原和激活態(tài)以及細胞質中MMP-9激活態(tài)分布明顯上升，說明明膠類酶MMPs可參與肌肉對訓練的適應性反應，且在肌核功能調控作用中，MMP-2比MMP-9更顯著。該研究還發(fā)現(xiàn)訓練后小鼠比目魚肌細胞ECM中充滿激活的肌肉衛(wèi)星細胞或成肌細胞，表明高表達的MMP-9可激活肌肉衛(wèi)星細胞，參與骨骼肌修復。在小鼠心肌組織的平滑肌細胞和心肌細胞中均檢測出MMP-2和MMP-9蛋白表達，且無論是在胞內亞細胞器（胞質溶膠、細胞核）或是胞外蛋白（如肌節(jié)），均能檢測到MMP-2和MMP-9蛋白酶以及與心肌發(fā)育調控相關的作用底物如鈣調節(jié)蛋白-1、心肌素、α-輔肌動蛋白和MHC[25]共表達。本研究對牦牛MMP-2和MMP-9細胞亞細胞器定位預測結果與前人研究結果相符，故也可為牦牛明膠類酶MMPs在細胞層面功能驗證研究提供數(shù)據(jù)參考。

MMP-2和MMP-9基因在牦牛肌肉組織中mRNA表達隨年齡增加而顯著上升。麥洼牦牛主要分布在海拔3 700 m高原環(huán)境，而活性氧（ROS）隨血液攜氧量增加而增加[26]，牦牛較南陽牛ROS含量低，牦牛和南陽牛MMP-2和MMP-9表達水平存在差異[27]，這可能是本研究MMP-2基因表達與祁艷霞等[6]在不同年齡南陽牛肌肉組織中MMP-2表達結果相反的原因。牦牛性成熟年齡為3.5～4.5周歲，0.5～2.5歲牦牛屬于幼年期，肌肉生長發(fā)育速度較快，各類細胞干性處于最佳時期。MMP-2和MMP-9在牦牛肌肉組織中的表達與年齡增長呈顯著正相關，作為明膠類酶MMPs底物的Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白，也是影響肉品質重要蛋白質[28]，同時Ⅰ型膠原蛋白是骨骼肌中含量最高膠原[29]。兩種蛋白是MMP-2和MMP-14的主要降解對象[30]，所以幼年期牦牛臀大肌組織中CL1A1基因表達在0.5～2.5歲呈現(xiàn)顯著性下降可能與MMP-2和MMP-14表達顯著升高有關。此外，TIMP-1和TIMP-2在不同年齡麥洼牦牛肌肉組織中表達水平無顯著差異，表明MMP-2和MMP-9在基因表達水平上可能存在對CL1A1有抑制作用。此外，臀大肌免疫組織化學結果與RT-qPCR結果趨勢相似，表明明膠類酶MMPs的基因表達與組織分布有緊密關聯(lián)，后續(xù)可增加對該酶蛋白表達水平驗證試驗。

隨MMPs家族在肌肉組織及細胞中研究日益增多，已有報道證明明膠類酶MMPs對骨骼肌組織及肌細胞修復、增殖和分化等生物過程有直接影響，故MMPs對骨骼肌組織的調控作用尤為重要。目前未見牦牛不同生長階段明膠類酶MMPs基因表達水平的報道，本研究得到的MMP-2和MMP-9在不同年齡骨骼肌組織中mRNA和蛋白表達存在顯著差異，說明牦牛明膠類酶MMPs表達具有組織差異特點，也表明明膠類酶MMPs可作為潛在的牦牛骨骼肌生長發(fā)育靶點或者牦牛選育的分子標記。

4 結論

本研究首次測序獲得牦牛MMP-2和MMP-9基因序列，且發(fā)現(xiàn)MMP-2和MMP-9在牦牛臀大肌和心臟中mRNA表達與年齡呈顯著正相關，二者在臀大肌組織中基因和蛋白表達分布趨勢相似。研究結果為進一步探索牦牛明膠類酶MMPs在牦牛肉品質與肌肉生長方面調控作用提供參考。