王 勇，楊 玲，溫書恒，陳燕瓊

（1.廣東植物龍生物技術股份有限公司，廣東 珠海 519090；2.國家農產品保鮮工程技術研究中心，廣東 珠海 519000）

多糖(polysaccharides)是生物合成的產物，由多個(一般超過10 個)單糖分子通過糖苷鍵連接形成的高分子化合物，通式為(C6H1206)n，在動物、高等植物、細菌和藻類等生物體內廣泛存在[1]，是一類具有多種重要生理功能的大分子物質。研究表明多糖除了具有明顯的抗氧化活性、抗腫瘤活性[2]、凈化水質[3]的能力外，還能增強細菌生物膜對環(huán)境的抵抗力，促進小麥生長的功效。

微生物胞外多糖具有生產周期短、產量高、成本相對較低等優(yōu)勢，是研究和應用較多的一類多糖，篩選新的高產胞外多糖菌株和具有良好理化性質的胞外多糖具有很大的意義。實驗室從柑橘根部土壤中篩選出一株紡錘型賴氨酸芽胞桿菌LW-3，前期研究發(fā)現(xiàn)其具有較好的溶磷解鉀效果[4]。本研究檢測發(fā)現(xiàn)，LW-3 發(fā)酵產物多為胞外多糖，產量可達20 g/L。但目前菌株LW-3 的擴繁能力較弱，采用常規(guī)細菌培養(yǎng)基，活菌濃度僅在108cfu/mL 水平上。為促進該菌的轉化應用，本研究進行了高密度發(fā)酵培養(yǎng)基成分及條件的研究，同時在10 L 發(fā)酵罐水平上進行了試驗。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株。賴氨酸芽胞桿菌LW-3，前期從柑橘根部土壤中分離篩選所得。

1.1.2 培養(yǎng)基。LB 固體和液體培養(yǎng)基[5]，蔗糖15 g/L、酵母浸膏15 g/L、碳酸鈣3 g/L、氯化鈉2 g/L、結晶硫酸鎂2 g/L、磷酸氫二鉀2 g/L、pH 值7.2～7.3。培養(yǎng)溫度32℃，轉速200 rpm，培養(yǎng)時間24 h。

1.1.3 主要儀器與設備。隔水培養(yǎng)箱（天津市泰斯特），臥式恒溫搖床（天津市泰斯特），恒溫水浴鍋（北京永光明），高速冷凍離心機（湖南湘儀），紫外可見分光光度計（上海元析），pH 計（OHAUS），超凈工作臺（蘇凈安泰），蒸汽滅菌鍋，10 L 發(fā)酵罐。

1.2 材料準備

1.2.1 LW-3 菌株活化。將保存于斜面培養(yǎng)基上的LW-3菌株劃線LB 平板活化，32℃培養(yǎng)24 h，備用。

1.2.2 LW-3 種子液制備。將LB 平板上單菌落劃線于LB斜面，32℃培養(yǎng)48 h，再用適量LB 洗脫菌苔作種子液。

1.2.3 LW-3 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)。500 mL 錐形瓶中裝入50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌后接入50 μL 的LW-3 種子液，32℃、200 r/min，培養(yǎng)26 h。

1.3 研究方法

1.3.1 菌株發(fā)酵產物的檢測鑒定。使用苯酚硫酸法[6]鑒定胞外產物：LW-3 菌株發(fā)酵液4000 rpm 離心30 min，取上清；加入2～3 倍體積95%乙醇，4℃靜置過夜；4000 rpm 離心30 min，去上清，將沉淀冷凍干燥后，即為粗多糖。粗多糖復溶于水配制成0.1%的溶液。取5 支潔凈的試管編號，1-3 號各加入100 μL 配制好的溶液，4 號加入100 μL 1%葡萄糖溶液，5號加入100 μL去離子水作為對照，然后分別加入l mL 5%苯酚，5 mL 濃硫酸，混勻后沸水浴15 min，冷卻至室溫，觀察顏色是否發(fā)生變化。

1.3.2 總活菌量和芽胞量測定。采用平板計數(shù)法測總活菌量。芽胞量測定：將發(fā)酵液在80℃水浴中保持15 min，再用檢測活菌方法測定。以活菌總量作為培養(yǎng)基優(yōu)化評判標準。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

碳源篩選優(yōu)化。在發(fā)酵基礎培養(yǎng)基中分別等質量添加玉米淀粉、豆粕粉、糖蜜、可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖，發(fā)酵結束取樣測定發(fā)酵液活菌數(shù)。每處理重復3 次，確定最佳碳源，考察不同碳源濃度對活菌數(shù)的影響。

氮源篩選優(yōu)化。在發(fā)酵基礎培養(yǎng)基中分別等質量添加酵母浸膏、牛肉膏、玉米漿粉、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、細菌學蛋白胨、黃豆粉，發(fā)酵結束取樣測定發(fā)酵液活菌數(shù)。每處理重復3 次，確定最佳氮源，考察不同氮源濃度對活菌數(shù)的影響。

無機鹽篩選優(yōu)化。在上述篩選的碳源和氮源的基礎上，分別添加不同質量硫酸亞鐵、硫酸鎂、氯化鈉、碳酸鈣、磷酸氫二鉀，發(fā)酵結束取樣測定發(fā)酵液活菌數(shù)。每處理重復3 次，確定合適的無機鹽種類及濃度。

1.3.4 液體發(fā)酵條件優(yōu)化。芽胞桿菌液體發(fā)酵涉及的因素較多，發(fā)酵條件對活菌數(shù)的影響較復雜。Plackett-Burman試驗設計是一種以不完全平衡塊為原理的實驗設計，能夠從眾多變量中快速、有效篩選出最為重要的一些因素，供進一步深入研究。同時具有數(shù)據(jù)處理簡單、適用于多個因素等優(yōu)點，可以用來進行發(fā)酵各條件的優(yōu)化篩選。本實驗選擇初始pH 值(A)、轉速(B)、接種量(C)、發(fā)酵時間(D)4 個因素，每個因素取2 個水平，以發(fā)酵液活菌數(shù)為響應值，對菌株LW-3 的發(fā)酵進行Plackett-Burman 試驗設計，確定影響菌株發(fā)酵的顯著因素。

種子液制備如1.2.2。

發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米漿粉15 g/L、豆粕粉20 g/L、NaCl 為3 g/L、MgSO4為3 g/L、CaCO3為2 g/L。培養(yǎng)溫度32℃，500 mL 三角瓶裝液量為50 mL。

1.3.5 發(fā)酵罐(10 L)擴大培養(yǎng)。將平板活化好的菌種單菌落劃斜面，培養(yǎng)至形成90%芽胞，然后水洗出，80℃水浴15 min后作為種子。10 L 發(fā)酵罐空罐滅菌操作，121℃、25 min；按6 L 裝液量調配培養(yǎng)基，并調節(jié)pH 至8.0。加入2 mL 消泡劑，滅菌，121℃、30 min。發(fā)酵罐滅菌結束，降溫至32～34℃，校正溶氧電極?；鹧嫒Ψń臃N種子液，發(fā)酵罐通氣量為0.12 m3/h，攪拌轉速初始為250 rpm，溫度設置為32℃自控。發(fā)酵前期每小時記錄發(fā)酵參數(shù)，18 h 后2 h 記錄1 次。發(fā)酵過程中溶氧不低于20%，鏡檢芽胞形成率大于90%時結束發(fā)酵。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵產物鑒定

使用苯酚硫酸法處理粗多糖復溶于水的溶液，溶液變成棕色，證明胞外產物是多糖物質。

2.2 不同碳源對菌株LW-3 液體發(fā)酵的影響

由圖1 可知，不同碳源對菌株LW-3 活菌量均有一定影響，以豆粕粉為碳源的發(fā)酵液活菌最大，為26.3×108cfu/mL，豆粕粉為最佳碳源。不同碳源濃度對活菌數(shù)的影響見圖2，表明豆粕粉最適添加濃度為20 g/L。

圖1 不同碳源對菌株LW-3 活菌量的影響

圖2 不同豆粕粉濃度對菌株LW-3 活菌量的影響

2.3 不同氮源對菌株LW-3 液體發(fā)酵的影響

由圖3 可知，以細菌學蛋白胨為氮源的發(fā)酵液活菌數(shù)最多，為21.5×108cfu/mL，以玉米漿粉為氮源的次之，考慮到成本，玉米漿粉為最佳氮源。不同氮源濃度對活菌數(shù)的影響見圖4，表明玉米漿粉最適添加濃度為15 g/L。

圖3 不同氮源對菌株LW-3 活菌量的影響

圖4 不同玉米漿粉濃度對菌株LW-3 活菌量的影響

2.4 不同無機鹽對菌株LW-3 液體發(fā)酵的影響

由圖5 可知，無機鹽種類及濃度對菌數(shù)影響不顯著。

圖5 不同無機鹽及其不同濃度對菌株LW-3 活菌量的影響

2.5 發(fā)酵工藝優(yōu)化

2.5.1 Plackett-Burman 試驗。設計表及結果如表1，從表2 可知，發(fā)酵條件中的B轉速、D發(fā)酵時間是影響菌量的顯著因素。以未編碼單位表示的回歸方程為：Y1=20.457+1.688A+3.593B-1.229C-2.979D。

表1 Plackett-Burman 試驗設計因素、水平及結果

表2 方差分析

2.5.2 搖床轉速對菌株LW-3 液體發(fā)酵的影響。微生物發(fā)酵是需能耗氧過程，有必要考察通氣量對菌株發(fā)酵的影響，在其他條件一致的情況下，采用120、150、180、200、220 r/min 等不同搖床轉速進行發(fā)酵試驗。試驗結果見圖6，200 r/min 轉速的活菌數(shù)最高，為發(fā)酵培養(yǎng)的最佳轉速。

圖6 搖床不同轉速對菌株LW-3 活菌量的影響

2.5.3 培養(yǎng)時間對菌株LW-3 液體發(fā)酵的影響。芽胞的產生于培養(yǎng)時間具有重要相關性。培養(yǎng)時間過短菌體未完全形成芽胞；培養(yǎng)時間過長，菌體可能已經衰亡。取不同培養(yǎng)時間的發(fā)酵液計芽胞數(shù)，芽胞產量最高的時間為26～30 h。從發(fā)酵效率和經濟效益來說26 h 更佳，此時芽胞數(shù)量為31.7×108cfu/mL。

圖7 不同發(fā)酵時間對菌株LW-3 活菌量的影響

2.6 發(fā)酵罐（10 L）擴大培養(yǎng)

以搖瓶發(fā)酵為基礎，進行液體發(fā)酵罐（10 L）的擴大培養(yǎng)，16 h 后每次隔2 h 取樣做鏡檢。由鏡檢結果可知，18 h 時開始形成芽胞，24 h 時已有80%芽胞率，26 h 時鏡檢芽胞形成率大于 90%時，悶罐后結束發(fā)酵。發(fā)酵罐（10 L）擴大培養(yǎng)與搖瓶發(fā)酵時間基本一致。通過計數(shù)發(fā)現(xiàn)活菌數(shù)為36.2×108cfu/mL，芽胞數(shù)為32.2×108cfu/mL。

3 結論

作為植物生防細菌和植物根系促生菌，LW-3 在農業(yè)領域有很大的應用潛力，但目前該菌的發(fā)酵水平仍然比較低，芽胞率低，是該菌工業(yè)化生產的主要限制因素。本文以提高生物量和芽胞率為目的，優(yōu)化了紡錘型賴氨酸芽胞桿菌LW-3 搖瓶發(fā)酵配方及工藝，在此基礎上進行了10 L 發(fā)酵罐水平的驗證。研究結果表明，單一因素篩選試驗明確玉米漿粉、豆粕粉、NaCl、CaCO3、MgSO4對菌株LW-3 擴繁具有較大影響，并進一步優(yōu)化出最優(yōu)添加量。發(fā)酵過程中，高密度菌劑濃度除與菌種本身特性和培養(yǎng)基所含碳源、氮源、無機鹽種類及配比有關外，還與發(fā)酵工藝參數(shù)有關，因此以上述物質為基礎成分，利用Plackett-Burman 試驗優(yōu)化培養(yǎng)條件。確定顯著影響因素為搖床轉速和培養(yǎng)時間后，進一步確定了最優(yōu)轉速和發(fā)酵時間。最后在10 L 全自動液體發(fā)酵罐水平上進行了擴大培養(yǎng)試驗，發(fā)現(xiàn)菌體發(fā)酵與搖瓶條件下一致，活菌數(shù)可達36.2×108cfu/mL，芽胞數(shù)為32.2×108cfu/mL，芽胞率為89%。