劉華元,史光軍

(青島大學(xué)附屬青島市市立醫(yī)院肝膽外科,山東 青島 266011)

鐵死亡是通過(guò)化學(xué)篩選發(fā)現(xiàn)的一種新的非程序性凋亡的細(xì)胞死亡過(guò)程[1]。多聚不飽和脂肪酸(PUFAs)、半胱氨酸和鐵的代謝都與鐵死亡的發(fā)生密切相關(guān)。多種信號(hào)通路也被發(fā)現(xiàn)參與鐵死亡調(diào)節(jié)[2]。揭示鐵死亡的抑制因素，通過(guò)藥理學(xué)干預(yù)鐵死亡的抑制因素，促進(jìn)癌細(xì)胞發(fā)生鐵死亡，這在科學(xué)研究和醫(yī)學(xué)臨床中都是非常有意義的。本文綜述了鐵死亡的啟動(dòng)機(jī)制，參與鐵死亡抑制的途徑，以及對(duì)抗鐵死亡抑制的藥物及其在腫瘤治療中的應(yīng)用，在鐵死亡抑制因素中尋找治療癌癥的新途徑。

1 鐵死亡的特點(diǎn)

鐵死亡的大致過(guò)程是通過(guò)小分子物質(zhì)的誘導(dǎo)直接或間接地激活不同的信號(hào)通路，從而降低谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPX4)的活力，抑制細(xì)胞內(nèi)抗氧化能力，導(dǎo)致細(xì)胞活性氧(ROS)累積過(guò)多而發(fā)生膜脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。鐵死亡在幾個(gè)方面區(qū)別于其他程序性細(xì)胞死亡：①在形態(tài)學(xué)特征上，主要表現(xiàn)為線粒體萎縮，線粒體膜密度增大，線粒體外膜完整性破壞，但是細(xì)胞核大小正常，沒(méi)有核濃縮現(xiàn)象[3];②生化特點(diǎn)方面，主要表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)ROS積累，還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化增加，胱氨酸/谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)抑制等[4]。

2 鐵死亡的發(fā)生機(jī)制及其抑制因素

鐵死亡的調(diào)控過(guò)程包括鐵代謝以及脂質(zhì)過(guò)氧化兩個(gè)主要方面，每個(gè)方面都涉及到多個(gè)基因的表達(dá)調(diào)控以及多個(gè)細(xì)胞信號(hào)通路的共同作用。

2.1 鐵代謝及鐵代謝過(guò)程中的鐵死亡抑制因素

鐵代謝過(guò)程涉及多個(gè)基因調(diào)控，各種能夠與鐵特異性結(jié)合的分子也會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)游離鐵的含量。首先，鐵調(diào)節(jié)蛋白1(IRP-1)和鐵調(diào)節(jié)蛋白2(IRP-2)作為細(xì)胞內(nèi)鐵的傳感器，在起始點(diǎn)開始調(diào)控鐵的代謝。IRP-1和IRP-2可以根據(jù)細(xì)胞內(nèi)鐵濃度的大小，通過(guò)結(jié)合位于mRNA的3’-或5’-非翻譯區(qū)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)來(lái)控制鐵代謝基因的表達(dá)[5]。而作為IRP-1和IRP-2的靶標(biāo)，細(xì)胞膜轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1(TFR1)則可以與胞外轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合，將與轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合的三價(jià)鐵離子(Fe3+)運(yùn)輸進(jìn)細(xì)胞內(nèi)，形成核內(nèi)體。核內(nèi)體中的Fe3+被鐵還原酶STEAP3還原為二價(jià)鐵離子(Fe2+)，F(xiàn)e2+通過(guò)二價(jià)金屬轉(zhuǎn)運(yùn)體1(DMT1，也稱為SLC11A2)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，并且過(guò)量的鐵則被存儲(chǔ)在鐵蛋白中。最后，位于細(xì)胞膜的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ferroportin，也稱為SLC11A3)可以再把細(xì)胞內(nèi)的Fe2+氧化為Fe3+并運(yùn)送出細(xì)胞外，從而使細(xì)胞內(nèi)鐵濃度維持在正常水平[6]。

鐵在線粒體電子傳遞鏈中影響ROS產(chǎn)生的過(guò)程，對(duì)某些酶和亞單位的功能具有至關(guān)重要的作用，比如NADPH氧化酶、脂氧合酶等[6]，過(guò)量游離鐵會(huì)通過(guò)Fenton反應(yīng)促進(jìn)ROS的產(chǎn)生，進(jìn)而導(dǎo)致鐵死亡的發(fā)生[7]。并且，幾乎所有的脂質(zhì)過(guò)氧化物的產(chǎn)生都可以被鐵螯合劑抑制[8]。因此可以認(rèn)為，游離鐵是鐵死亡的必須條件之一，鐵的代謝過(guò)程與鐵死亡之間有密切的聯(lián)系。

根據(jù)鐵代謝過(guò)程的特點(diǎn)，以及Ras基因突變的細(xì)胞中TFR1表達(dá)增加、鐵蛋白表達(dá)減少，從而導(dǎo)致細(xì)胞鐵死亡敏感性增高的規(guī)律[9]，可以認(rèn)為提高細(xì)胞內(nèi)游離態(tài)鐵的濃度，同時(shí)降低結(jié)合態(tài)鐵的含量，會(huì)誘發(fā)鐵死亡。因此，與游離鐵結(jié)合的鐵蛋白具有防止鐵死亡發(fā)生的作用[10-11]。同時(shí)，能夠?qū)⒓?xì)胞內(nèi)的Fe2+運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外的SLC11A3蛋白，可以有效地降低胞內(nèi)游離鐵濃度，也是一種鐵死亡的抑制因素[12]。此外，一些信號(hào)傳導(dǎo)途徑也參與調(diào)控鐵代謝，例如范可尼貧血互補(bǔ)群基因D2(FANCD2)是一種鐵死亡抑制因素，它可以影響鐵代謝基因和GPX4，從而抵抗鐵死亡[13]。

2.2 影響脂質(zhì)氧化的因素及其與鐵死亡的關(guān)系

由于脂質(zhì)氧化可以促進(jìn)鐵死亡的發(fā)生，所以在鐵死亡過(guò)程中，參與抑制脂質(zhì)氧化的一些物質(zhì)，比如GPX4以及半胱氨酸等，都是主要的鐵死亡抑制因素[14]。而一些抑制脂質(zhì)氧化促進(jìn)因素的物質(zhì)，也可以間接抑制鐵死亡。通過(guò)分析鐵死亡發(fā)生過(guò)程中抑制脂質(zhì)氧化的因素，可以有針對(duì)性地尋找對(duì)抗這些因素的策略，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞鐵死亡的發(fā)生。

2.2.1PUFAs氧化促進(jìn)脂質(zhì)過(guò)氧化物的積累 所有細(xì)胞的存活需要維持膜的流動(dòng)性，而脂膜上的PUFAs是維持這種流動(dòng)性的因素之一。鐵死亡過(guò)程中產(chǎn)生的大量ROS可以與PUFAs發(fā)生反應(yīng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂和細(xì)胞的死亡。同時(shí)，PUFAs被氧化后的產(chǎn)物可以在脂氧合酶(LOXs)的催化下，形成誘導(dǎo)鐵死亡的脂質(zhì)過(guò)氧化物[15-16]。有研究還發(fā)現(xiàn)，PUFAs氧化過(guò)程中具有催化作用的兩種脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)劑溶血磷脂酰膽堿酰基轉(zhuǎn)移酶3(LPCAT3)和?；o酶A合成酶長(zhǎng)鏈家族成員4(ACSL4)，可以促進(jìn)被GPX4抑制劑誘導(dǎo)的KBM7細(xì)胞中的鐵死亡[17]。在鐵死亡過(guò)程中PUFAs的氧化促進(jìn)因素已經(jīng)找到多個(gè)，但是負(fù)向調(diào)節(jié)其氧化并抑制鐵死亡的因素尚待研究。

2.2.2半胱氨酸在鐵死亡過(guò)程中的作用 細(xì)胞膜系統(tǒng)XC-是細(xì)胞產(chǎn)生半胱氨酸的一種重要途徑，也是抑制鐵死亡發(fā)生的一個(gè)主要因素。它以1∶1的比例將胞外的胱氨酸與胞內(nèi)的谷氨酸交換運(yùn)輸，使胱氨酸進(jìn)入到細(xì)胞中，并進(jìn)一步使胱氨酸轉(zhuǎn)化成為半胱氨酸，最終產(chǎn)生谷胱甘肽(GSH)。GSH可以對(duì)抗ROS引發(fā)的氧化作用[18]。通過(guò)抑制系統(tǒng)XC-，可以剝奪細(xì)胞半胱氨酸，使其不能用于GSH合成，進(jìn)而促進(jìn)鐵死亡[19]。目前發(fā)現(xiàn)的鐵死亡促進(jìn)劑erastin和柳氮磺胺吡啶就是通過(guò)這一途徑來(lái)促進(jìn)鐵死亡的發(fā)生[1]。此外，β-巰基乙醇則可以直接將進(jìn)入細(xì)胞的胱氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榘腚装彼?，而不依靠于系統(tǒng)XC-[20]。因此，可以產(chǎn)生β-巰基乙醇的細(xì)胞會(huì)對(duì)抗系統(tǒng)XC-抑制劑和半胱氨酸剝奪誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡[21]。其他的一些獲取半胱氨酸的替代方式，也是潛在的抑制鐵死亡的因素，比如敲除半胱氨酰tRNA合成酶后可以激活轉(zhuǎn)硫化途徑，并且細(xì)胞可以通過(guò)該途徑將蛋氨酸合成半胱氨酸，從而對(duì)抗半胱氨酸剝奪誘導(dǎo)的鐵死亡[22]。

還有一些信號(hào)通路參與了胞內(nèi)半胱氨酸水平的調(diào)節(jié)，比如核因子E2相關(guān)因子(Nrf2)，在細(xì)胞內(nèi)Nrf2的接頭蛋白Keap1與Nrf2結(jié)合，當(dāng)發(fā)生氧化反應(yīng)時(shí)，Keap1-Nrf2解聚并使Nrf2觸發(fā)一系列抗氧化反應(yīng)[23]。Nrf2可以使組成系統(tǒng)XC-的關(guān)鍵組件SLC7A11表達(dá)上調(diào)[24]，從而增加胞內(nèi)半胱氨酸水平，抑制鐵死亡。而生長(zhǎng)素響應(yīng)因子(ARF)作為一種抑癌因子，可以直接抑制Nrf2的轉(zhuǎn)錄并抑制其靶基因，包括SLC7A11[25]，使細(xì)胞對(duì)鐵死亡誘導(dǎo)劑的敏感性提高，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡。此外，自噬相關(guān)基因BECN1被AMP依賴的蛋白激酶(AMPK)磷酸化后，可以與SLC7A11相互結(jié)合，抑制SLC7A11發(fā)揮作用，抑制系統(tǒng)XC-，促進(jìn)鐵死亡[26]；抑癌基因p53也作為SLC7A11的轉(zhuǎn)錄抑制因子，直接促進(jìn)鐵死亡[27-28]。但最近的研究表明，p53還可以通過(guò)抑制DPP4活性或通過(guò)CDKN1A/P21的轉(zhuǎn)錄激活來(lái)抑制鐵死亡[29]。因此，p53在鐵死亡中的具體作用仍需進(jìn)一步探究。

2.2.3GPX4抑制細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化物的積累 GPX4可以將還原型GSH轉(zhuǎn)變?yōu)檠趸凸入赘孰?GSSG)，進(jìn)而促進(jìn)脂質(zhì)氫過(guò)氧化物被還原為脂質(zhì)醇，對(duì)抗鐵依賴的脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程，并且維持脂質(zhì)雙層膜的穩(wěn)態(tài)[30-31]。因此，通過(guò)直接或間接抑制GPX4的活性，可以導(dǎo)致鐵死亡的發(fā)生。此外，前文所述對(duì)半胱氨酸的剝奪也可以減少GSH，間接抑制GPX4發(fā)揮作用。同時(shí)，鐵死亡激動(dòng)劑RSL3可以與GPX4形成共價(jià)鍵而直接導(dǎo)致GPX4失活。

葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)是一種活躍的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白，在不同類型的癌癥中過(guò)表達(dá)，并參與腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展[32-33]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌中GRP78也可以結(jié)合GPX4，但這種結(jié)合后的作用效果與RSL3與GPX4結(jié)合的作用效果相反，可以防止GPX4蛋白降解和隨后的脂質(zhì)過(guò)氧化，從而抑制鐵死亡[34]。因此，GRP78抑制劑聯(lián)用一些傳統(tǒng)的化療藥物或者新式鐵死亡促進(jìn)劑，比如青蒿琥酯，可能是一種更好的腫瘤治療策略[35]。

2.2.4谷氨酰胺代謝對(duì)鐵死亡的影響 由于谷氨酰胺在對(duì)抗ROS及抑制鐵死亡方面具有重要作用，因此促進(jìn)其分解可以使細(xì)胞更容易發(fā)生鐵死亡。最近的研究也發(fā)現(xiàn)，谷氨酰胺分解在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEFs)鐵死亡過(guò)程中，具有不可或缺的作用[36]。而可以促進(jìn)谷氨酰胺分解的一些物質(zhì)，如谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶1(GOT1)和谷氨酰胺酶2(GLS2)，可通過(guò)將谷氨酰胺轉(zhuǎn)化為α-酮戊二酸(α-KG)或谷氨酸，從而參與調(diào)節(jié)鐵死亡進(jìn)程[37-38]。更進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，GLS2在P53依賴的鐵死亡進(jìn)程中上調(diào)，說(shuō)明參與谷氨酰胺分解的一些物質(zhì)與鐵死亡過(guò)程中的調(diào)節(jié)因子可能有較大的關(guān)聯(lián)[39]。

2.3 鐵死亡抑制蛋白1(FSP1)對(duì)鐵死亡的影響

FSP1最初名字為線粒體凋亡誘導(dǎo)因子2(AIFM2)[30]，后來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，它可以對(duì)抗由于GPX4缺失引起的鐵死亡，因此將AIFM2稱為FSP1[40]。既往研究表明，鐵死亡是由磷脂過(guò)氧化(PLPO)驅(qū)動(dòng)的，還原形式的輔酶Q10是磷脂中良好的自由基捕獲型抗氧化劑[41]；同時(shí)，AIF家族的成員已經(jīng)被證明具有還原型輔酶Ⅰ(NADH)-泛醌氧化還原酶活性[42]。推測(cè)FSP1通過(guò)還原型輔酶Q10(CoQ10)并使用NADPH自由基捕獲型抗氧化劑來(lái)抑制PLPO，調(diào)節(jié)鐵死亡的過(guò)程。最近有研究表明，在缺乏GPX4的細(xì)胞內(nèi)，F(xiàn)SP1、CoQ10有助于將NAD(P)H傳遞到脂雙層中，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的傳播。FSP1-CoQ10-NADPH途徑是一個(gè)獨(dú)立的平行系統(tǒng)，它與GPX4和GSH協(xié)同作用以抑制磷脂過(guò)氧化和鐵死亡[43]。

基于FSP1的作用機(jī)制，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)FSP1選擇性抑制劑(iFSP1)是一種有效的FSP1抑制劑，可以誘導(dǎo)過(guò)表達(dá)FSP1的GPX4敲除細(xì)胞發(fā)生鐵死亡，并且iFSP1治療使這些細(xì)胞對(duì)RSL3誘導(dǎo)的鐵死亡非常敏感[43]。

3 對(duì)抗鐵死亡抑制因素的藥物及其在腫瘤治療中的應(yīng)用

鐵死亡的抑制因素會(huì)降低腫瘤細(xì)胞鐵死亡的發(fā)生，甚至使一些主流的化療藥物，如索拉非尼[44]和順鉑[45]的治療效果大幅下降，并且一些傳統(tǒng)的化療藥物可能由于降低了腫瘤細(xì)胞內(nèi)的Fe2+水平，抑制鐵死亡的發(fā)生，從而導(dǎo)致療效不佳。所以消除鐵死亡的抑制因素，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞中鐵死亡的發(fā)生，是開發(fā)新型化療藥物的目標(biāo)之一。目前，通過(guò)減弱鐵死亡抑制因素來(lái)促進(jìn)鐵死亡發(fā)生的藥物主要有3類：第一類是直接調(diào)節(jié)游離鐵水平，削弱鐵代謝過(guò)程中存在的鐵死亡抑制因素；第二類是調(diào)節(jié)脂質(zhì)氧化水平，減少細(xì)胞內(nèi)抗氧化物質(zhì)的生成，為鐵死亡發(fā)生提供有利的高氧化水平環(huán)境；第三類是通過(guò)抑制與抗氧化功能相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)通路中的分子，間接調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的氧化水平。

3.1 調(diào)節(jié)游離鐵水平的藥物及其應(yīng)用

細(xì)胞內(nèi)游離鐵增多是鐵死亡發(fā)生的一個(gè)前提條件，而胞外轉(zhuǎn)鐵蛋白對(duì)鐵離子的運(yùn)輸減少、鐵蛋白結(jié)合游離鐵以及鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將游離鐵轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外，是3個(gè)主要的降低胞內(nèi)鐵離子水平的途徑。溶酶體破壞劑(西拉美辛)和酪氨酸激酶抑制劑(拉帕替尼)則可以通過(guò)增加細(xì)胞外轉(zhuǎn)鐵蛋白向細(xì)胞輸送鐵并且同時(shí)抑制鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主導(dǎo)的鐵離子排出，從而升高了細(xì)胞內(nèi)鐵離子水平，促進(jìn)乳癌細(xì)胞發(fā)生鐵死亡，成為治療乳癌的新型藥物[46]。此外，最近研究又發(fā)現(xiàn)，西拉美辛和拉帕替尼還可以通過(guò)降低血紅素加氧酶-1(HO-1)水平誘導(dǎo)鐵死亡[47]，這說(shuō)明升高細(xì)胞內(nèi)鐵離子水平的藥物也可以間接影響與細(xì)胞內(nèi)氧化水平調(diào)節(jié)相關(guān)的因子，從而增強(qiáng)對(duì)鐵死亡的促進(jìn)作用。因此，調(diào)節(jié)鐵代謝的抗癌藥物機(jī)制研究可能還有很大的進(jìn)步空間。

3.2 調(diào)節(jié)脂質(zhì)氧化的藥物及其應(yīng)用

迄今為止，發(fā)現(xiàn)了三大類通過(guò)解除脂質(zhì)氧化抑制從而促進(jìn)鐵死亡的藥物。第一類藥物通過(guò)抑制系統(tǒng)XC-減少胞內(nèi)半胱氨酸含量，促進(jìn)鐵死亡，比如erastin、柳氮磺胺吡啶以及索拉菲尼，其中索拉菲尼在肝癌治療方面的應(yīng)用已經(jīng)很成熟，并且其效果可以被鐵死亡抑制劑抑制[47]。第二類藥物是直接抑制或結(jié)合GPX4從而誘導(dǎo)鐵死亡，相關(guān)藥物有鐵死亡誘導(dǎo)劑FIN56、RSL3等，但尚未臨床應(yīng)用。第三類為降低胞內(nèi)GSH水平的藥物，比如順鉑，已經(jīng)用于卵巢癌、肺癌、甲狀腺癌、淋巴肉瘤等癌癥的治療。調(diào)節(jié)脂質(zhì)氧化的藥物種類較多，作用機(jī)制也逐漸清晰，已經(jīng)開始逐漸應(yīng)用于各種腫瘤的臨床治療。

3.3 調(diào)節(jié)有關(guān)信號(hào)通路分子的藥物

鴉膽子苦醇(Brusatol)是一種Nrf2抑制劑，它通過(guò)增強(qiáng)泛素化和Nrf2的降解抑制Nrf2途徑，從而降低細(xì)胞內(nèi)的半胱氨酸含量，促進(jìn)鐵死亡[48]。葫蘆巴堿(Trigonelline)也具有同樣抑制Nrf2的作用，并且其在體外實(shí)驗(yàn)的胰腺癌細(xì)胞中可以有效地抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)[49]。因此，開發(fā)更多的靶向調(diào)節(jié)信號(hào)通路分子的藥物誘導(dǎo)細(xì)胞鐵死亡，可能是一種有效的癌癥治療策略。

綜上所述，鐵死亡是一種在多種基因調(diào)控下，受到多種信號(hào)通路影響以及胞內(nèi)物質(zhì)代謝水平和氧化反應(yīng)調(diào)節(jié)的特殊死亡方式。鐵代謝的紊亂和鐵離子在細(xì)胞內(nèi)的過(guò)量積累是引發(fā)鐵死亡前提條件，也是鐵死亡的獨(dú)特之處。而鐵積累誘發(fā)的脂質(zhì)過(guò)度氧化以及GPX4、半胱氨酸和谷氨酰胺所調(diào)節(jié)的抗氧化能力的減弱，則最終誘導(dǎo)了細(xì)胞的死亡。鐵死亡這一特殊的細(xì)胞死亡方式，逐漸在多種癌細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞中鐵死亡發(fā)生成為新的腫瘤治療手段。探究鐵死亡的抑制因素，找到促進(jìn)癌細(xì)胞鐵死亡方法可能成為治療癌癥的新思路。