劉延波，王一菲，趙志軍，韓素娜，王賢，孫西玉,4，潘春梅

1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院(酒業(yè)學(xué)院)/河南省白酒風(fēng)格工程技術(shù)研究中心/鄭州市白酒釀造微生物技術(shù)重點實驗室，河南 鄭州 450046；

2.河南仰韶酒業(yè)有限公司 博士后科研工作站，河南 澠池 472400；

3.賒店老酒股份有限公司，河南 社旗 473300；

4.河南張弓老酒酒業(yè)有限公司，河南 寧陵 476733

0 引言

大曲是釀造白酒的重要原料，它不僅在釀酒過程中起著糖化和發(fā)酵的作用，為白酒釀造提供原動力，還為白酒提供了大量的風(fēng)味物質(zhì)及風(fēng)味前體物質(zhì)，在很大程度上影響著白酒的風(fēng)格[1-4].塊狀大曲根據(jù)形狀分為平板曲和包包曲，其中平板曲即整個曲塊為長方體，而包包曲的曲胚呈長方體，在曲胚中部的上面有似山丘般的隆起，表面積較大，培養(yǎng)溫度范圍較寬，代謝產(chǎn)物豐富[5].

白酒的品質(zhì)、產(chǎn)量及風(fēng)格的形成絕大部分取決于大曲的制作工藝和品質(zhì)[6].目前大曲品質(zhì)的鑒定包括感官特征、理化指標(biāo)及微生物指標(biāo)檢驗，其中理化指標(biāo)主要包括大曲樣品的水分含量、淀粉含量、酸度、液化力、酯化力、糖化力、發(fā)酵力等[7].對于大曲理化指標(biāo)的研究，2005年沈才洪等[8]通過對大曲的生化、理化及感官指標(biāo)的評分進(jìn)行加權(quán)，建立了以數(shù)字表征大曲品質(zhì)指標(biāo)的判斷標(biāo)準(zhǔn).2009年譚崇堯等[9]對比分析了用不同工藝生產(chǎn)的枝江大曲的理化指標(biāo)及感官指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，包包曲理化指標(biāo)中的酸度、糖化力、液化力及感官指標(biāo)均優(yōu)于平板曲.2017年呂亞楠等[10]對不同培養(yǎng)時期的大曲進(jìn)行了部分理化指標(biāo)研究發(fā)現(xiàn)，方滄州地區(qū)每年6～9月生產(chǎn)的大曲品質(zhì)更佳.2019年P(guān).H.Liu等[11]對清香型大曲在貯存期內(nèi)的理化、生化等指標(biāo)的變化進(jìn)行了監(jiān)控，并評估各時期大曲的品質(zhì)后發(fā)現(xiàn)，用貯存3個月的清香型大曲生產(chǎn)的白酒品質(zhì)更佳.

大曲中含有復(fù)雜、多樣的微生物，其中不同種類的真菌和細(xì)菌數(shù)量龐大，特別是細(xì)菌類群極為豐富[12-14].細(xì)菌在白酒釀造中至關(guān)重要，其代謝產(chǎn)物對白酒的產(chǎn)率、品質(zhì)等起著重要作用.傳統(tǒng)方法在研究大曲中細(xì)菌的數(shù)量和種類上具有局限性，而分子生物技術(shù)則是對細(xì)菌進(jìn)行相關(guān)研究更有力的工具，如近年來應(yīng)用較多的PCR-DGGE(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳)、基因文庫、高通量測序技術(shù)等[15-16].其中，高通量測序技術(shù)作為新一代的測序技術(shù)，應(yīng)用于微生物群落結(jié)構(gòu)的研究，不僅通量高、靈敏度高，還可進(jìn)行雙向測序，且工作量小、成本低[17].2017年王洪等[18]運用高通量測序技術(shù)，研究分析了在熱風(fēng)干燥條件下大曲樣品貯存期間的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)熱風(fēng)干燥大曲隨著貯存時間的增加，細(xì)菌豐度呈先增加后減小的趨勢，而細(xì)菌群落多樣性呈增加的趨勢.2018年李斌等[1]運用高通量測序技術(shù)對濃香型白酒和芝麻香型白酒大曲的微生物菌群進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，濃香型白酒中高溫酒曲的優(yōu)勢菌群主要包括乳桿菌屬(Lactobacillus)、魏斯氏菌屬(Weissella)、片球菌屬(Pediococcus)等9個屬，芝麻香型白酒高溫酒曲的優(yōu)勢菌群主要有芽孢桿菌屬(Bacillus)和別樣芽胞桿菌屬(Allobacillus).2019年戴奕杰等[19]采用高通量測序技術(shù)對醬香型白酒大曲和糟醅進(jìn)行細(xì)菌多樣性分析發(fā)現(xiàn)，高溫制曲與發(fā)酵釀酒階段的優(yōu)勢菌菌屬基本一致，即大曲是后續(xù)糟醅發(fā)酵的微生物來源.

中原地區(qū)酒企使用包包曲和平板曲的情況不一，關(guān)于生產(chǎn)用曲的選擇爭議較大，而目前對包包曲和平板曲的對比研究較少，且評估指標(biāo)不能全面分析二者之間的差異.基于此，本研究主要對包包曲和平板曲進(jìn)行感官特征和理化指標(biāo)的檢測，并運用高通量測序技術(shù)對包包曲和平板曲中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，從品質(zhì)指標(biāo)、細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)等方面更全面地對包包曲和平板曲進(jìn)行對比分析，以期為中原地區(qū)包包曲和平板曲細(xì)菌信息數(shù)據(jù)庫的建立、生產(chǎn)用曲的選擇及大曲的制作提供科學(xué)依據(jù)，并進(jìn)一步提升白酒的品質(zhì)，推動白酒行業(yè)的創(chuàng)新性發(fā)展.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 大曲樣品包包曲和平板曲樣品，均由河南賒店老酒股份有限公司生產(chǎn)制作.各取3塊樣品，將曲心、曲皮混勻，粉碎后過20目篩，一部分密封貯存于4 ℃冰箱中，用于大曲感官特征和理化指標(biāo)的檢測，另一部分密封貯存于-20 ℃冰箱中，用于大曲高通量測序.

1.1.2 主要試劑NaOH、無水葡萄糖、無水乙醇、可溶性淀粉、碘、KI，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)；H2SO4、HCl，天津市永大化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)；甲醛，天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)；酒石酸鉀鈉、CuSO4·5H2O，成都金山化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)；鄰苯二甲酸氫鉀，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn).以上試劑均為分析純.E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit試劑盒，美國Omega公司產(chǎn)；Qubit3.0 DNA檢測試劑盒，美國Life公司產(chǎn)；2×Taq Master Mix，南京諾唯贊生物科技有限公司產(chǎn)；MagicPure Size Selection DNA Beads，北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn).

1.2 主要儀器與設(shè)備

SW-CJ-2F型雙人雙面凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)；FA1104型分析天平(感量為0.000 1 g)，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)；PHS-25型精密pH計，上海雷磁有限公司產(chǎn)；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋，方科儀器(常州)有限公司產(chǎn)；DNP-9272BS-Ⅲ型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司產(chǎn)；LDZX-50KBS型立式蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)；ST16R型高速冷凍離心機，北京眾力挽生物科技有限公司產(chǎn)；GL88-B型漩渦混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司產(chǎn)；TND03-H-H型混勻干式恒溫器，深圳拓能達(dá)科技有限公司產(chǎn)；DYY-6C型電泳儀電源、DYCZ-21型電泳槽，北京市六一生物科技有限公司產(chǎn)；GelDoc-ItTS型凝膠成像系統(tǒng)，美國UVP公司產(chǎn)；Qubit?3.0型熒光計，美國Invitrogen公司產(chǎn)；GeneAmp?9700型PCR儀，賽默飛世爾科技(中國)有限公司產(chǎn).

1.3 實驗方法

1.3.1 大曲感官特征檢測由5位制曲經(jīng)驗豐富的專業(yè)人士，從外觀、斷面、氣味等方面對大曲進(jìn)行感官特征檢測.在自然光下目測其顏色、裂縫、掛衣、光潔度等外部特征；將曲塊斷開，在自然光下目測其菌絲、雜菌、顏色等斷面特征[8]；在室溫、無異味的環(huán)境下用嗅覺判斷是否有撲鼻的復(fù)合曲香味或其他酸臭等異味[20].

1.3.2 大曲理化指標(biāo)檢測大曲的水分含量、酸度、淀粉含量、氨基酸態(tài)氮含量、糖化力、液化力、酯化力、發(fā)酵力、酒化力等理化指標(biāo)的檢測參考QB/T 4257—2011[21].

1.3.3 大曲細(xì)菌DNA提取及PCR擴(kuò)增利用E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit試劑盒提取大曲中的細(xì)菌DNA，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性.

PCR擴(kuò)增V3-V4區(qū)域，引物為341F(5′-CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG(barcode)CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)和805R(5′-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTACHVGGGTATCTAATCC-3′).第1輪擴(kuò)增體系為：15 μL 2×Taq master Mix，1 μL Bar-PCR primer F(10 μmol/L)，1 μL Primer R (10 μmol/L)，10～20 ng 基因組DNA，加水至30 μL.反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，45 ℃退火20 s，65 ℃延伸30 s(進(jìn)行5個循環(huán))；94 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s(進(jìn)行20個循環(huán))；72 ℃保持5 min；10 ℃保存.第2輪擴(kuò)增體系為：15 μL 2×Taq master Mix，1 μL Primer F(10 μmol/L)，1 μL Primer R (10 μmol/L)，20 ng PCR 產(chǎn)物(上一輪)，加水至30 μL.反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s(進(jìn)行5個循環(huán))；72 ℃保持5 min；10 ℃保存.PCR擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行DNA純化回收，利用Qubit3.0 DNA檢測試劑盒對回收的DNA進(jìn)行精確定量，按照1∶1等體積混合.

1.3.4 高通量測序與數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析等體積混合后的DNA樣品由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行高通量測序，并通過數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析、OTU(Operational Taxonomic Units，操作分類單元)分析(利用Usearch軟件在97%的相似水平上進(jìn)行OTU聚類分析)、Alpha多樣性分析(利用Mothur軟件對各個樣品進(jìn)行Alpha多樣性分析)、物種分類學(xué)分析、系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹分析、物種豐度差異分析、PICRUSt功能分析(基于COG的功能分析，利用R軟件對結(jié)果進(jìn)行作圖，得到功能預(yù)測)等對包包曲和平板曲的細(xì)菌菌落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 包包曲與平板曲的感官特征分析

從大曲廠房中取樣的包包曲和平板曲樣品如圖1所示.由圖1可知，包包曲和平板曲在外觀、斷面、香味等指標(biāo)上都極為相似：外觀上，均掛衣整齊均勻，顏色整體呈灰白色，有少許裂口，表面較光滑；斷面上，均整齊，有泡氣，菌絲豐富且分布均勻；香味上，均具有較濃郁的曲香，無異味.從感官特征上看，包包曲和平板曲均屬于高品質(zhì)大曲，可以進(jìn)行更深一步的比較研究.

圖1 包包曲和平板曲樣品Fig.1 Samples of bag Daqu and brick Daqu

2.2 包包曲與平板曲理化指標(biāo)檢測結(jié)果分析

包包曲和平板曲的理化指標(biāo)測定結(jié)果如表1所示.由表1可知，包包曲和平板曲的水分含量、酸度、淀粉含量均在成品曲的標(biāo)準(zhǔn)范圍之內(nèi)[22].在制曲過程中，水分與微生物生長及酶系活力聯(lián)系緊密，也是大曲培養(yǎng)及貯存的關(guān)鍵[23].與包包曲相比，平板曲的水分較高且差異顯著(P<0.05).這可能是因為包包曲的制曲溫度(60～63 ℃)比平板曲的制曲溫度(57～60 ℃)高，有利于水分蒸發(fā)，導(dǎo)致包包曲的水分含量較低.淀粉含量越低，說明大曲中的微生物對淀粉的利用率越高，微生物代謝越旺盛[24]，本研究中包包曲和平板曲的淀粉含量無顯著差異.酸度也能反映大曲中微生物的新陳代謝情況，本研究中平板曲的酸度和氨基酸態(tài)氮含量較包包曲低且差異極顯著(P<0.01).糖化力、酯化力、液化力、發(fā)酵力和酒化力是反映大曲品質(zhì)的重要指標(biāo)，其中酯化力越高越有利于白酒中風(fēng)味物質(zhì)的形成，而發(fā)酵力包含了糖化、液化等一系列復(fù)雜過程，發(fā)酵力和酒化力均能反映大曲的產(chǎn)酒能力[25].本研究中平板曲的糖化力、液化力、酯化力、發(fā)酵力均在成品曲的標(biāo)準(zhǔn)范圍之內(nèi)，而包包曲除了發(fā)酵力低于標(biāo)準(zhǔn)范圍外，其余理化指標(biāo)均在成品曲標(biāo)準(zhǔn)范圍之內(nèi).與包包曲相比，平板曲的糖化力、液化力、酯化力、發(fā)酵力和酒化力均較高，除發(fā)酵力差異顯著外(P<0.05)，其余指標(biāo)均差異極顯著(P<0.01).本研究中包包曲的制曲溫度比平板曲的制曲溫度高，而溫度是影響糖化力的主要因素，一般情況下低溫曲比高溫曲的糖化力高[26]，這也是平板曲比包包曲糖化力高的原因之一.

表1 包包曲和平板曲的理化指標(biāo)測定結(jié)果Table 1 Measurement results of physicochemical indexes of bag Daqu and brick Daqu

2.3 包包曲與平板曲細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 高通量測序結(jié)果分析本實驗用于測序的序列中含有用來識別和區(qū)分樣品的標(biāo)簽序列，表明本實驗的測序序列為有效序列.包包曲和平板曲樣本的數(shù)據(jù)通過標(biāo)簽序列得到，對包包曲和平板曲的樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控過濾后，包包曲剩余序列數(shù)目為84 946個，原始序列平均長度為429.45 bp；平板曲的剩余序列數(shù)目為77 610個，原始序列平均長度為421.57 bp.PCR擴(kuò)增后，包包曲和平板曲產(chǎn)生的嵌合體數(shù)目分別為1508個和109個，為保證測序數(shù)據(jù)信息的分析質(zhì)量，對序列進(jìn)行剔除及錯誤校正處理后，包包曲和平板曲剩余序列數(shù)目分別為82 082個和51 537個.

2.3.2OTU分析OTU聚類分析得到包包曲的OTU數(shù)目為347個，平板曲的OTU數(shù)目為451個.運用R語言程序包VennDiagram軟件對包包曲和平板曲進(jìn)行評估，得到包包曲特有的OTU數(shù)目為178個，平板曲特有的OTU數(shù)目為282個，二者共有的OTU數(shù)目為169個.

2.3.3Alpha多樣性分析通過Alpha值可以估計樣品中細(xì)菌群落物種的豐度和多樣性，運用Mothur軟件對包包曲和平板曲進(jìn)行的細(xì)菌群落Alpha多樣性分析，結(jié)果如表2所示.通常用于微生物群落多樣性描述的Alpha多樣性指數(shù)包括Shannon指數(shù)[27]、Chaol指數(shù)、Coverage指數(shù)和Simpson指數(shù)[28].其中最為敏感的是Shannon指數(shù)，其數(shù)值越大，代表物種的豐富度越高，而Simpson指數(shù)越大，群落的多樣性則越低.由表2可知，與包包曲相比，平板曲的Shannon指數(shù)和Chaol指數(shù)均較高，而Simpson指數(shù)較低，說明平板曲中的細(xì)菌群落物種的豐度和多樣性比包包曲高.這是因為溫度過高易導(dǎo)致不耐高溫的微生物死亡，加之高溫易造成細(xì)胞水分流失，故平板曲的細(xì)菌數(shù)量比包包曲多，其水分含量也較包包曲高.除此之外，北方地區(qū)氣候干燥且空氣濕度小，而包包曲的曲胚上面有隆起，比表面積較大，水分揮發(fā)較快，而水分是微生物生長的主要因素之一，水分的減少也會導(dǎo)致細(xì)菌的數(shù)量減少[29-30].大曲樣品的文庫覆蓋率Coverage指數(shù)能夠反映實驗取樣是否合理，其數(shù)值越大，樣品中未被測出序列的概率越小，一般情況下，Coverage指數(shù)>97%被認(rèn)為實驗取樣是合理的.由表2可知，兩個樣品的Coverage指數(shù)均>99%，證明本實驗取樣合理.以Shannon指數(shù)為例，隨機抽取測序序列，并與其所代表的OTU數(shù)目構(gòu)建的Alpha指數(shù)稀釋曲線如圖2所示.由圖2可知，兩條曲線均趨于平坦，說明本實驗的測序數(shù)據(jù)量選取合理.

圖2 包包曲(A1)和平板曲(B1)的Alpha指數(shù)稀釋曲線圖Fig.2 Alpha index dilution curve of bag Daqu(A1)and brick Daqu(B1)

表2 包包曲和平板曲的細(xì)菌群落Alpha多樣性指數(shù)Table 2 Bacterial Alpha diversity index of bag Daqu and brick Daqu

2.3.4 物種分類學(xué)分析將得到的所有OTU與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，選擇相似度在97%以上的序列進(jìn)行物種分類，獲得各個OTU的分類水平，即門、綱、目、科、屬分類水平.基于高通量測序技術(shù)，包包曲和平板曲在門和屬水平上的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分布如圖3和圖4所示.

圖3 包包曲(A1)和平板曲(B1)在門水平上的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分布圖Fig.3 Distribution of bacterial community structure of bag Daqu(A1)and brick Daqu(B1) at the door level

圖4 包包曲(A1)和平板曲(B1)在屬水平上的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分布圖Fig.4 Distribution of bacterial community structure of bag Daqu(A1)and brick Daqu(B1) at the genus level

由圖3可知，從門水平上分析，包包曲中含有的平均相對豐度>0.50%的優(yōu)勢細(xì)菌門包括變形菌門(Proteobacteria，94.85%)、厚壁菌門(Firmicutes，4.10%)和放線細(xì)菌門(Actinobacteria，0.80%)，非優(yōu)勢菌門為擬桿菌門(Bacteroidetes，0.19%)和未分類細(xì)菌門(unclassified，0.05%).平板曲中除去未分類細(xì)菌門(unclassified，1.50%)，平均相對豐度>0.50%的優(yōu)勢細(xì)菌門包括變形菌門(Proteobacteria，72.52%)、厚壁菌門(Firmicutes，24.77%)、擬桿菌門(Bacteroidetes，0.58%)和放線細(xì)菌門(Actinobacteria，0.55%)，非優(yōu)勢菌門為疣微菌門(Verrucomicrobia，0.04%)、浮霉菌門(Planctomycetes，0.04%)、Candidatus Saccharibacteria(0.01%).即兩個樣品中共有的優(yōu)勢細(xì)菌門為變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和放線細(xì)菌門(Actinobacteria)，且平板曲的優(yōu)勢細(xì)菌門比包包曲多一個擬桿菌門(Bacteroidetes).本研究發(fā)現(xiàn)的優(yōu)勢細(xì)菌門與陳玲等[31]運用PCR-ARDAR和16S rRNA基因克隆測序技術(shù)研究的濃香型白酒大曲的優(yōu)勢細(xì)菌門基本相同，且本研究所檢測到的細(xì)菌門在數(shù)量上比其多3個.與姚粟等[32]運用16S rDNA克隆文庫方法研究的芝麻香型高溫大曲中的優(yōu)勢細(xì)菌門基本一致，且本研究在其基礎(chǔ)上還發(fā)現(xiàn)了擬桿菌門(Bacteroidetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、浮霉菌門(Planctomycetes)等多個菌門.

由圖4可知，從屬水平上分析，包包曲中除去未分類細(xì)菌屬(unclassified，76.15%)，平均相對豐度>1.00%的優(yōu)勢細(xì)菌屬包括假單胞菌屬(Pseudomonas，13.17%)、泛菌屬(Pantoea，2.17%)、不動桿菌屬(Acinetobacter，1.78%)、明串珠菌屬(Leuconostoc，1.78%)和乳桿菌屬(Lactobacillus，1.10%)，非優(yōu)勢細(xì)菌屬包括葡萄球菌屬(Staphylococcus，0.53%)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella，0.44%)、腸桿菌屬(Enterobacter，0.42%)、節(jié)細(xì)菌屬(Arthrobacter，0.33%)、鏈球菌屬(Streptococcus，0.32%)、考克氏菌屬(Kocuria，0.23%)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium，0.15%)、乳球菌屬(Lactococcus，0.14%)、歐文菌屬(Erwinia，0.12%)、沙雷菌屬(Serratia，0.10%)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas，0.10%)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas，0.09%)、金黃桿菌屬(Chryseobacterium，0.09%)、芽孢桿菌屬(Bacillus，0.08%)和其他細(xì)菌屬(0.72%).平板曲中除去未分類細(xì)菌屬(unclassified，61.73%)，平均相對豐度>1.00%的優(yōu)勢細(xì)菌屬包括乳桿菌屬(Lactobacillus，14.32%)、明串珠菌屬(Leuconostoc，6.84%)、泛菌屬(Pantoea，6.07%)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella，2.16%)、假單胞菌屬(Pseudomonas，1.52%)、葡萄球菌屬(Staphylococcu，1.37%)和乳球菌屬(Lactococcus，1.12%)，非優(yōu)勢細(xì)菌屬包括鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas，0.99%)、腸桿菌屬(Enterobacter，0.70%)、不動桿菌屬(Acinetobacter，0.33%)、片球菌屬(Pediococcus，0.29%)、巴那斯拉菌屬(Barnesiella，0.19%)、短小桿菌屬(Curtobacterium，0.19%)、醋酸桿菌屬(Acetobacter，0.12%)、芽孢桿菌屬(Bacillus，0.11%)、沙雷菌屬(Serratia，0.11%)、節(jié)細(xì)菌屬(Arthrobacter，0.09%)、鏈球菌屬(Streptococcus，0.09%)、魏斯氏菌屬(Weissella，0.08%)和其他細(xì)菌屬(1.57%).其中，巴那斯拉菌屬(Barnesiella)是首次從平板曲中發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌屬.本研究發(fā)現(xiàn)的優(yōu)勢細(xì)菌屬與吳樹坤等[33]利用高通量測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)的四川地區(qū)濃香型大曲中的優(yōu)勢細(xì)菌屬，以及李斌等[1]運用高通量測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)的濃香型大曲中的優(yōu)勢細(xì)菌屬基本一致.

在屬水平上，包包曲和平板曲與菌屬物種之間的對應(yīng)關(guān)系如圖5所示.由圖5可知包包曲和平板曲的優(yōu)勢菌屬的組成比例及不同優(yōu)勢菌屬在各大曲樣本上的分布比例.

圖5 屬水平上包包曲(A1)和平板曲(B1)與菌屬物種的關(guān)系圖Fig.5 Species relationship map of bag Daqu(A1) and brick Daqu(B1) at the genus level

2.3.5 系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹分析在屬水平上，通過Muscle軟件將包包曲和平板曲樣品中豐度較大的前50個OTU代表序列與數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行聚類比對分析，構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹如圖6所示.由圖6可清晰、系統(tǒng)地揭示包包曲和平板曲細(xì)菌群落及各菌株進(jìn)化的過程順序.

圖6 豐度較大的前50個OTU在屬水平上的系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹Fig.6 Cluster diagram of the top 50 OTUs with the highest abundance at the genus level

2.3.6 物種豐度差異分析在物種分類的基礎(chǔ)上，對包包曲和平板曲的菌群豐度進(jìn)行了差異分析，包包曲與平板曲的細(xì)菌屬豐度差異顯著的誤差線圖如圖7所示.由圖7可知，除未分類細(xì)菌屬外，包包曲與平板曲細(xì)菌屬豐度差異顯著的細(xì)菌屬共有24個，其中，平板曲比包包曲明顯增多的細(xì)菌屬包括乳桿菌屬、明串珠菌屬、泛菌屬、克雷伯氏菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、乳球菌屬、葡萄球菌屬、巴那斯拉菌屬、片球菌屬、短小桿菌屬、醋酸桿菌屬、狹義梭菌屬(Clostridiumsensustricto)、腸桿菌屬、Methylobacterium和Buttiauxella.其中乳桿菌屬在白酒釀造過程中能促進(jìn)發(fā)酵及美拉德反應(yīng)，具有維護(hù)和保持釀酒微生態(tài)環(huán)境平衡的作用，其代謝產(chǎn)物乳酸可形成乳酸乙酯和其他香味物質(zhì)，同時還具有增加酒體醇厚度和回甜感、降低刺激感、延長后味等作用[34-35].明串珠菌屬利用葡萄糖，通過異性乳酸發(fā)酵產(chǎn)生的D型乳酸和醋酸是乳酸乙酯和乙酸乙酯的重要前體物質(zhì).醋酸桿菌屬中產(chǎn)生的醋酸是丁酸乙酯和己酸乙酯的前體物質(zhì)[36].克雷伯氏菌屬中具有可以產(chǎn)生脂肪酶的菌種，對白酒增香具有重要作用[37].平板曲中克雷伯氏菌屬明顯增多也是平板曲比包包曲酯化力高的原因之一.另外，鞘氨醇單胞菌屬可以降解有毒物質(zhì)[38].

圖7 包包曲(A1)和平板曲(B1)菌屬豐度差異顯著的誤差線圖Fig.7 Error plot of the significant difference between bag Daqu(A1)and brick Daqu(B1)

包包曲比平板曲明顯增多的細(xì)菌屬包括假單胞菌屬、不動桿菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬、拉恩菌屬(Rahnella)、克羅諾桿菌(Cronobacter)、棒狀桿菌屬、考克氏菌屬、節(jié)細(xì)菌屬、和鏈球菌屬.孟天毅等[39]研究發(fā)現(xiàn)，假單胞菌屬屬于耐熱性較強的細(xì)菌，溫度升高會導(dǎo)致不耐熱的細(xì)菌減少，而耐熱菌成為優(yōu)勢菌，這與本研究得到的包包曲中優(yōu)勢菌屬為假單胞菌屬的結(jié)果一致；而腸桿菌屬的耐熱性較低[40]，在制曲過程中，高溫可致其失活，所以平板曲中的腸桿菌屬數(shù)量多于包包曲.

2.3.7PICRUSt功能分析為了獲知包包曲和平板曲更高層級水平上的功能情況，將其與COG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對及功能注釋，得到的功能結(jié)構(gòu)分布柱狀圖如圖8所示，兩個樣品一共涉及25個COG功能分類.包包曲與平板曲菌基于COG功能結(jié)構(gòu)的誤差線圖如圖9所示.由圖8和圖9可知，包包曲和平板曲豐度差異顯著的(P<0.05)功能有23個.其中，平板曲比包包曲明顯增多的功能主要有細(xì)胞和信號功能(細(xì)胞周期控制、細(xì)胞分裂、染色體分配、細(xì)胞壁/膜/包膜生物發(fā)生、防御機制、細(xì)胞骨架等)、代謝功能(核苷酸轉(zhuǎn)運和代謝、碳水化合物的轉(zhuǎn)運和代謝、輔酶轉(zhuǎn)運和代謝、無機離子轉(zhuǎn)運和代謝等)、信息存儲和處理功能(翻譯、轉(zhuǎn)錄、核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生)等.平板曲中數(shù)量豐富、代謝旺盛的微生物之間相互作用，促進(jìn)各反應(yīng)的生成，導(dǎo)致平板曲的糖化力、液化力、酯化力、發(fā)酵力和酒化力均比包包曲高.

圖8 包包曲(A1)和平板曲(B1)基于COG的功能結(jié)構(gòu)分布柱狀圖Fig.8 The bar chart of the functional structure distribution of bag Daqu (A1)and brick Daqu(B1)based on COG

圖9 包包曲(A1)和平板曲(B1)基于COG的功能結(jié)構(gòu)差異誤差線圖Fig.9 Functional structure difference error line of bag Daqu(A1)and brick Daqu(B1)based on COG

3 結(jié)論

本文通過對包包曲和平板曲的感官特征和理化指標(biāo)的檢測分析發(fā)現(xiàn)，二者均屬于高品質(zhì)大曲，且平板曲的水分含量、糖化力、液化力、酯化力、發(fā)酵力、酒化力均比包包曲高，而酸度和氨基酸態(tài)氮含量均比包包曲低.應(yīng)用高通量測序技術(shù)對包包曲和平板曲的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果表明：從門水平上分析，包包曲中的優(yōu)勢細(xì)菌門(平均相對豐度>0.50%)有3個，依次為變形菌門、厚壁菌門和放線細(xì)菌門；平板曲中的優(yōu)勢細(xì)菌門(平均相對豐度>0.50%)有4個，依次為變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門和放線細(xì)菌門；從屬水平上分析，包包曲中的優(yōu)勢細(xì)菌屬(平均相對豐度>1.00%)有5個，依次為假單胞菌屬、泛菌屬、不動桿菌屬、明串珠菌屬和乳桿菌屬；平板曲的優(yōu)勢細(xì)菌屬(平均相對豐度>1.00%)有7個，依次為乳桿菌屬、明串珠菌屬、泛菌屬、克雷伯氏菌屬、假單胞菌屬、葡萄球菌屬和乳球菌屬，且首次從平板曲中發(fā)現(xiàn)了巴那斯拉菌屬.另外，通過高通量測序還發(fā)現(xiàn)，平板曲的細(xì)菌群落豐度及多樣性均比包包曲高，表明在中原地區(qū)白酒的釀造過程中使用平板曲的效果優(yōu)于包包曲.本研究為中原地區(qū)制作的包包曲和平板曲建立了細(xì)菌信息數(shù)據(jù)庫，可為中原地區(qū)白酒品質(zhì)的提升及創(chuàng)新性發(fā)展提供理論依據(jù)和參考.