嚴(yán) 云 李博懌 王雅琦 趙蔚波 董麗丹 鄭燕飛

北京中醫(yī)藥大學(xué)，國(guó)家中醫(yī)體質(zhì)與治未病研究院（北京 100029）

勃起功能障礙（erectile dysfunction，ED）指男子在性刺激下，陰莖持續(xù)地不能達(dá)到或維持足夠硬度的勃起以完成滿意性生活，病程達(dá)3 個(gè)月以上[1]。中醫(yī)將ED稱為 “陽(yáng)痿”。疏肝益陽(yáng)膠囊是中醫(yī)男科學(xué)的創(chuàng)始人之一、學(xué)科帶頭人王琦院士根據(jù) “陽(yáng)痿從肝論治” 的理論研制的，由蒺藜、柴胡、蜂房等15 味中藥組成[2]。前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)驗(yàn)均證實(shí)疏肝益陽(yáng)膠囊可顯著改善勃起功能，尤其對(duì)心理性及輕度動(dòng)脈性勃起功能障礙具有良好療效[3]。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究疏肝益陽(yáng)膠囊治療ED 的作用機(jī)制，為后續(xù)進(jìn)行疏肝益陽(yáng)膠囊治療ED 的科學(xué)研究提供理論參考，并降低篩選靶點(diǎn)和作用通路所需的研究成本。

資料與方法

一、疏肝益陽(yáng)膠囊活性成分收集與靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

通過TCMSP[4]（https://tcmspw.com/tcmsp.php）、中國(guó)天然產(chǎn)物化學(xué)成分庫(kù)（http://pharmdata.ncmi.cn/cnpc）和TCMID[5]（http://119.3.41.228:8000/tcmid）等數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)疏肝益陽(yáng)膠囊的化學(xué)成分進(jìn)行收集，并檢索相關(guān)文獻(xiàn)[6-9]作為補(bǔ)充。再利用TCMSP 收集這些化學(xué)成分所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白，最后利用UniProt[10]（https://www.uniprot.org）數(shù)據(jù)庫(kù)，將靶點(diǎn)蛋白轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的基因名。

二、疏肝益陽(yáng)膠囊與ED 的交互靶點(diǎn)

在DrugBank[11]數(shù) 據(jù) 庫(kù)（https://www.drugbank.ca）、GeneCards[12]數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.genecards.org）、OMIM[13]數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.omim.org）和TTD[14]數(shù)據(jù)庫(kù)（https://db.idrblab.org/ttd）中進(jìn)行ED 相關(guān)基因的查詢，并匯總?cè)サ糁貜?fù)基因。最后，將疏肝益陽(yáng)膠囊靶點(diǎn)與ED 靶點(diǎn)一同導(dǎo)入Veney2.1 軟件，繪制韋恩圖，得到疏肝益陽(yáng)膠囊與ED 的交互靶點(diǎn)。

三、“藥物- 成分- 靶點(diǎn)” 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將交互靶點(diǎn)及其對(duì)應(yīng)的化學(xué)成分文件導(dǎo)入Cytoscape 3.8 軟件，繪制 “藥物- 成分- 靶點(diǎn)” 網(wǎng)絡(luò)圖，并應(yīng)用 “Analyze Network” 功能獲得網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩灾怠?/p>

四、蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）構(gòu)建

利用String 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org）對(duì)交互靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白互作分析，并把文件導(dǎo)入Cytoscape 3.8 中，繪制PPI 圖。

五、生物過程分析

在WebGestalt 2019[15]平 臺(tái)（http://www.webgestalt.org），對(duì)交互靶點(diǎn)進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析，其中GO 功能分析包括生物學(xué)過程（Biological Process，BP）、細(xì)胞成分（Cellular Component，CC）和分子功能（Molecular Function，MF），各自描述了基因產(chǎn)物可能行使的分子功能，所處的細(xì)胞環(huán)境以及參與的生物學(xué)過程。

結(jié) 果

一、疏肝益陽(yáng)膠囊與ED 的交互靶點(diǎn)篩選

篩選出116 個(gè)藥物口服生物利用度[16]（OB）≥30 和類藥性[17]（DL）≥0.18 的疏肝益陽(yáng)膠囊化學(xué)成分，再將這些化學(xué)成分所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)匯總?cè)ブ兀罱K得到266個(gè)中藥靶點(diǎn)。將各數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到的ED 疾病靶點(diǎn)匯總?cè)ブ兀玫?094 個(gè)靶點(diǎn)。最后，將疏肝益陽(yáng)膠囊靶點(diǎn)同ED 靶點(diǎn)繪制韋恩圖，獲得83 個(gè)交互靶點(diǎn)，即為疏肝益陽(yáng)膠囊治療ED 的潛在作用靶點(diǎn)，見圖1。

圖1 疏肝益陽(yáng)膠囊- 勃起功能障礙靶點(diǎn)韋恩圖

二、“藥物- 成分- 靶點(diǎn)” 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過Cytoscape3.8 軟件繪制疏肝益陽(yáng)膠囊治療ED 的 “藥物- 成分- 靶點(diǎn)” 網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。圖中字體的大小、節(jié)點(diǎn)的大小和顏色的深度均與degree 值成正比關(guān)系，degree 值排名前10 的靶點(diǎn)，見表1； 再根據(jù)Gene Cards 數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因與勃起功能障礙疾病相關(guān)性（Relevance score）對(duì)表1 中的基因進(jìn)行排序，推測(cè)雄激素受體（AR）、一氧化氮合酶2（NOS2）、一氧化氮合酶3（NOS3）等可能為疏肝益陽(yáng)膠囊治療ED 的重要作用靶點(diǎn)，見表2。根據(jù)degree 值大于10 的化學(xué)成分，可推測(cè)出quercetin、kaempferol 和beta-sitosterol 等化合物可能為疏肝益陽(yáng)膠囊治療ED 的主要化學(xué)成分，見表3。

表3 “藥物- 成分- 靶點(diǎn)” 網(wǎng)絡(luò)圖中的主要化學(xué)成分

圖2 疏肝益陽(yáng)膠囊治療ED 的 “藥物- 成分- 靶點(diǎn)” 網(wǎng)絡(luò)圖

表1 “藥物- 成分- 靶點(diǎn)” 網(wǎng)絡(luò)圖中的重要靶點(diǎn)

表2 疏肝益陽(yáng)膠囊治療ED 的重要靶點(diǎn)按相關(guān)性分?jǐn)?shù)排序

三、PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過Cytoscape3.8 軟件繪制交互靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3。結(jié)果顯示，白細(xì)胞介素6（IL-6）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（VEGFA）、腫瘤壞死因子（TNF）和和胱天蛋白酶3（CASP3）等靶點(diǎn)蛋白基因degree 值較大，表明這些靶點(diǎn)與其他靶點(diǎn)相互作用較強(qiáng)，在網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要作用。

圖3 疏肝益陽(yáng)膠囊治療ED 的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

四、GO 和KEGG 富集分析

通過WebGestal 平臺(tái)分析得到12 個(gè)最相關(guān)生物過程（Biological Process，BP）；19 個(gè)最相關(guān)細(xì)胞成分（Cellular Component，CC）；16 個(gè)分子功能（Molecular Function，MF）。其中BP 包含生物調(diào)節(jié)、對(duì)刺激的反應(yīng)、代謝、多細(xì)胞生物、細(xì)胞通訊等生物過程；CC 包含膜、內(nèi)膜系統(tǒng)、細(xì)胞外隙、核等細(xì)胞組分；MF 包含蛋白質(zhì)結(jié)合、離子結(jié)合、分子轉(zhuǎn)導(dǎo)活性等分子功能，見圖4。

圖4 GO 富集分析

通過WebGestal 平臺(tái)進(jìn)行KEGG 富集，選擇加權(quán)集合覆蓋（Weighted set cover）分析出7 條最相關(guān)信號(hào)通路，包括瘧疾、糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化終產(chǎn)物及其受體（AGE-RAGE）、白細(xì)胞介素17（IL-17）、核因子κB（NF-κB）和血流剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化等信號(hào)通路，見圖5。

圖5 KEGG 富集分析

討 論

古代醫(yī)家對(duì)陽(yáng)痿的認(rèn)識(shí)和治療，存在多種不同的學(xué)術(shù)觀點(diǎn)。其中補(bǔ)腎法和從肝論治最具影響力，尤其是補(bǔ)腎法在歷代中醫(yī)治療陽(yáng)痿上取得了諸多成果[18]。但現(xiàn)代以來，王琦院士發(fā)現(xiàn)陽(yáng)痿患者中青壯年并不少見，其年腎氣本應(yīng)旺盛，故臨床用補(bǔ)腎法往往收效不顯[19]，說明隨著人們的生活壓力和身體素質(zhì)的變化，陽(yáng)痿的病因病機(jī)同樣也在變化。疏肝益陽(yáng)膠囊是王琦院士基于“肝郁腎虛血瘀” 的病機(jī)所研制的，該藥具有 “疏肝解郁，活血通絡(luò)，補(bǔ)腎,興陽(yáng)振痿” 的作用。前期研究證實(shí)，疏肝益陽(yáng)膠囊可改善性欲及射精功能，并提高抗疲勞能力。其機(jī)理與提高雄激素、促腎上腺皮質(zhì)激素水平和縮小陰莖靜脈管腔直徑及減慢陰莖靜脈回流速度有關(guān)[20]。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法發(fā)現(xiàn)疏肝益陽(yáng)膠囊治療ED 的興陽(yáng)振痿、活血通絡(luò)功能，其機(jī)制可能與AGE-RAGE、IL-17、NF-κB、血流剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化等信號(hào)通路相關(guān)。晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）通過蛋白質(zhì)，脂質(zhì)和核酸等非酶促糖基化和氧化作用產(chǎn)生，主要是由于衰老和某些病理狀況（例如高血糖、腎功能衰竭癥） 引起[21]。AGEs 作用于細(xì)胞表面的受體（RAGE）時(shí)，可刺激內(nèi)皮細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素（IL-8），并上調(diào)IL-8mRNA 的表達(dá)，IL-8 對(duì)炎癥和免疫過程有重要的調(diào)節(jié)作用[22]。有研究表明，糖尿病狀態(tài)下AGEs與RAGE 的結(jié)合效應(yīng)可以引起大鼠陰莖海綿體組織中氧自由基的產(chǎn)生增多，抗氧化能力下降，從而加劇ED的發(fā)生發(fā)展[23]。IL-17 是一個(gè)重要的促炎癥細(xì)胞因子，在多種炎性反應(yīng)及自身免疫性疾病病理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，IL-17 通過其相應(yīng)的受體發(fā)出信號(hào)，激活包括NF-κB、c-Jun 氨基末端激酶（JNK）等在內(nèi)的下游信號(hào)通路[24]。NF-κB 是細(xì)胞內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，NF-κB信號(hào)通路在復(fù)雜的炎癥細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中起著中心調(diào)節(jié)的作用，不僅參與機(jī)體免疫、炎癥、代謝、遺傳等過程，還在細(xì)胞增殖、分化及凋亡的發(fā)生發(fā)展中也扮演著重要角色[25]。血流剪切應(yīng)力是指血流施加在血管壁內(nèi)皮表面的摩擦力，其與血液特性、血流速度和血管形態(tài)有密切關(guān)系。剪切應(yīng)力對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能的調(diào)節(jié)起主要作用[26]。Burnett[27]等研究表明陰莖脈管中血流誘導(dǎo)的流體剪切力能夠激活NOS3 大量合成內(nèi)皮來源的一氧化氮（NO），進(jìn)而維持完全勃起。由 “藥物- 成分- 靶點(diǎn)” 網(wǎng)絡(luò)圖可見疏肝益陽(yáng)膠囊治療ED 具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，相對(duì)于單分子靶點(diǎn)藥物來說，疏肝益陽(yáng)膠囊可同時(shí)調(diào)節(jié)疾病網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)中的多個(gè)環(huán)節(jié)。通過本次研究，為疏肝益陽(yáng)膠囊在 “肝郁、腎虛兼血瘀證”所致陽(yáng)痿和輕度動(dòng)脈供血不足性陽(yáng)痿的應(yīng)用進(jìn)一步提供了理論支持。但由于目前研究手段的局限性無法考慮到藥物在體內(nèi)的代謝過程等因素，因此本研究結(jié)果還有待進(jìn)一步的研究驗(yàn)證。