張琦君，殷書敏，車勇，祝利民，羅振東，郭玉剛，徐振曄*

(1.上海市虹口區(qū)江灣醫(yī)院/上海健康醫(yī)學院附屬第一康復醫(yī)院，上海 200434；2.上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院，上海 200032)

原發(fā)性支氣管肺癌是當前全球最常見的惡性腫瘤之一，居惡性腫瘤病死率第1位。我國肺癌發(fā)病率近幾十年來呈現激增的趨勢，五年患病率已達130.2(1/10萬)，其中男性患病率居惡性腫瘤第2位；女性患病率居惡性腫瘤第4位[1]。目前肺癌的治療除了手術、放化療、靶向治療外，隨著抗PD-1/PD-L1等免疫療法藥物的出現，讓人們看到了肺癌治療的新突破，同時也認識到在腫瘤發(fā)生及惡性進展的過程中，腫瘤浸潤性髓樣細胞(Tumor-infiltrating myeloid cells, TIMs)發(fā)揮了重要的作用，這些細胞一旦被招募到腫瘤微環(huán)境中，可以促進腫瘤細胞向惡性發(fā)展，發(fā)生免疫逃逸，最終促進腫瘤的進展，還可以導致抗腫瘤治療失敗或耐藥發(fā)生，成為目前腫瘤研究的熱點。腫瘤浸潤性髓樣細胞表現為髓系起源，分化不成熟的特點，包括髓源性抑制細胞(Myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)、腫瘤相關性巨噬細胞(Tumor-associated macrophages, TAMs)等一類粒系或單核系來源的細胞群，大量存在于實體瘤基質中，在受到腫瘤、炎癥等刺激后，在腫瘤細胞、各種細胞因子、趨化因子等作用下，通過內源性基因驅動或外源性途徑激動，被招募至腫瘤組織，分化成具有免疫抑制活性的一類髓樣細胞，對T淋巴細胞產生潛在的免疫抑制作用，表現出明顯的免疫抑制活性，使得腫瘤細胞獲得干擾宿主免疫功能的作用，導致了腫瘤免疫逃逸的出現，刺激腫瘤細胞增殖，促進腫瘤侵襲轉移[2-3]。無論在動物實驗還是臨床研究中均證實MDSCs、TAMs的數量與腫瘤的惡性程度及患者的不良預后相關，通過對MDSCs、TAMs的阻斷可在一定程度上恢復機體抗腫瘤反應，抑制腫瘤的生長[4]。

腫瘤免疫治療，與手術切除腫瘤、放化療或靶向藥物殺傷腫瘤細胞不同，通過人體自身的免疫系統(tǒng)來調節(jié)干預腫瘤微環(huán)境的方式以消滅癌細胞。中醫(yī)藥整體觀念的思路與腫瘤免疫治療的理念不謀而合，通過對機體免疫微環(huán)境的調節(jié)及重塑，逆轉腫瘤免疫逃逸的狀態(tài)，改善腫瘤微環(huán)境中的關鍵細胞及其功能，從而發(fā)揮抗腫瘤、抗轉移復發(fā)的作用。徐振曄教授根據長期臨床觀察，基于現代肺癌患者發(fā)病特點，結合中醫(yī)基礎理論中“金水相生”的概念，發(fā)揮張景岳補腎學術思想，在國內首次提出肺癌治療的“精氣理論”，根據“益氣養(yǎng)精，解毒散結”的治療大法，研制中藥復方肺巖寧方，臨床研究提示使肺癌患者生存期、臨床癥狀方面獲益明顯[5],體外實驗證實肺巖寧方顆粒劑具有調節(jié)TAMs極化及其分泌的細胞因子，抑制Lewis肺癌細胞遷移的作用[6]。本實驗通過動物體內實驗，進一步觀察肺巖寧方對肺癌局部腫瘤微環(huán)境中腫瘤浸潤性髓樣細胞MDSCs、TAMs的調控作用，挖掘其抑瘤作用的免疫基礎，深入探索其內在機制，為其今后臨床開發(fā)應用提供研究基礎。

1 材料

1.1 細胞與動物

小鼠Lewis肺癌細胞株購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。SPF級C57BL/6純系小鼠38只，雄性，體質量(20±2)g，由上海中醫(yī)藥大學動物實驗中心代購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號:SYXK(滬)-2014-008。小鼠在動物實驗中心SPF級動物房飼養(yǎng)，室溫(25±2)℃，采用食飼料飼養(yǎng)方式，自由進食與飲水。動物實驗經上海中醫(yī)藥大學實驗動物福利與倫理委員會審查，符合實驗動物福利與倫理相關規(guī)范，倫理編號：PZSHUTCM190628010。

1.2 藥品及試劑

肺巖寧方組方：生黃芪30 g，白術9 g，石見穿30 g，山慈菇12 g，蜂房9 g，干蟾皮6 g，仙靈脾15 g，黃精30 g，山茱萸15 g，靈芝15 g，七葉一枝花9 g，14貼中藥共計生藥2 520 g，于上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院中藥房進行標準化水煎提，水煎液經醇提后將藥物濃縮至生藥含量為2 g/mL、4 g/mL[7]，-80 ℃保存?zhèn)溆?。IL-4 ELISA試劑盒(Cat:SD0168，Lot:20190315)、IL-10 ELISA試劑盒(Cat:SD0170，Lot:20190315)購自上海司鼎生物科技有限公司；小鼠CD16/32單抗(Cat:553142)購自BD公司；小鼠F4/80-PE-cy5(Cat:123110)、CD86-PE(Cat:105008)、CD206-FITC(Cat:141704)、CD11b-APC(Cat:101212)、Gr1-PE(Cat:108408)單克隆抗體購自Biolegend公司；PD-1(Cat:ab214421)、PD-L1(Cat:ab238697)蛋白Marker購自Abcam公司；PI3K(Cat:5405S)、C/EBPβ(Cat:3082S)蛋白 Marker購自CST公司。

1.3 實驗儀器

DMI3000B熒光倒置顯微鏡(Leica公司)；RM2235型病理切片機(上海徠卡儀器有限公司)；HS1125型組織攤片機(浙江省金華市華速科技有限公司)；5810R型冷凍離心機(Eppendorf 公司)；F50型酶標檢測儀(Tecan公司)；FACSVerse流式細胞儀(BD公司)；qRCR儀Stepone plus型(ABI公司)；1645050 型電泳儀(BIO-RAD 公司)；V370型掃描儀(EPSON 公司)。

2 實驗方法

2.1 造模與分組

小鼠在動物實驗中心SPF級動物房飼養(yǎng)，適應性喂養(yǎng)1周后開始實驗。采用隨機數字表法取8只C57BL/6小鼠分為正常組，取余下30只C57BL/6小鼠進行造模，造模方法：取對數生長期小鼠Lewis肺癌細胞，消化、離心、重懸后制備成細胞密度為5.0×106/mL的細胞懸液，取0.1 mL注射于C57BL/6小鼠尾靜脈，建立Lewis小鼠肺癌模型，接種7 d后隨機抽取6只小鼠處死剝取肺組織，福爾馬林液中固定，鏡下觀察肺組織腫瘤細胞轉移情況。判斷造模成功后，余下24只小鼠隨機分為模型組、肺巖寧低劑量組、肺巖寧高劑量組，每組8只。造模成功后開始給藥干預，正常組、模型組給予生理鹽水0.4 mL灌胃，每日1次；肺巖寧低劑量組給予肺巖寧方0.4 mL 40 g/(kg· d)灌胃，每日1次；肺巖寧高劑量組給予0.4 mL肺巖寧方80 g/(kg·d)灌胃，每日1次。各組小鼠實驗干預2周，末次灌胃后禁食12 h后2%異氟烷吸入麻醉，摘眼球取血，斷頸處死，迅速剝離肺組織，分別保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 小鼠肺組織病理學檢測

剝取小鼠肺組織進行包埋、切片、脫水、染色，中性樹脂膠封片，顯微鏡下觀察小鼠肺組織瘤灶。

2.3 流式細胞儀檢測肺組織中MDSCs、M1及M2型TAMs細胞水平

肺組織研磨后，制備小鼠肺組織單細胞懸液，1 500 r/min離心5 min，棄上清，加入PBS重懸細胞，將細胞數調整至1 × 107/mL。取100 μL細胞懸液至標記好的流式上樣管中，每管加入 2 μL(1 mg) CD16/CD32單抗，冰上避光封閉10 min。加紅細胞裂解液3 mL，冰上靜置20 min，1 500 r/min離心5 min，棄上清，加入PBS 300 μL重懸細胞。一管加入F4/80-PE-cy5、CD11b-APC、CD86-PE、CD206-FITC 各 5 μL；另一管加入CD11b-FITC、Gr1-PE各5 μL，冰上避光孵育20 min。1 500 r/min離心5 min，棄上清，PBS 300 μL重懸細胞，避光4 ℃保存，1 h內上機檢測。

2.4 ELISA法檢測血清IL-4、IL-10濃度

1.5 mL EP管收集各組小鼠血液標本，3 000 r/min，4 ℃離心20 min，收集血清，2～8 ℃保存，48 h內進行檢測。根據IL-4、IL-10試劑盒中步驟操作，樣本酶標儀下450 nm處測吸光值(OD) 。以標準品2 000、1 000、500、250、125、62.5、31.2、0 pg/mL為橫坐標，OD值為縱坐標，使用軟件作圖，畫出標準曲線。根據樣品OD值計算出相應IL-4、IL-10含量。

2.5 實時熒光PCR檢測

采用Trizol提取總RNA，利用紫外分析測定所抽提RNA的濃度，取1.0 μg總RNA利用TB Green qPCR試劑盒逆轉錄為c-DNA，逆轉錄條件為37 ℃反應15 min，85 ℃變性5 s，4℃保存。引物序列由上海生工生物工程技術服務有限公司設計并合成，以GAPDH為內參，小鼠iNOS上游引物：GTTCTCAGCCCAACA ATACAAGA-3’，下游引物：5’-GTGGACGGGTCGAT GTCAC；小鼠Arg上游引物：GAGCC ACCGTTTTACATT GTGA-3’，下游引物：5’-CTCGCCCACTAGGCAGTTC。反應條件： 95 ℃，30 s；95 ℃，5 s；60 ℃ 34 s，共40個循環(huán)，檢測熒光信號。每樣本重復3孔，各個基因的相對表達水平以2-ΔΔCt進行統(tǒng)計分析。

2.6 Western blot檢測

每組小鼠肺組織進行檢測，提取肺組織總蛋白樣品，經SDS-PAGE分離蛋白后，將蛋白轉印于PVDF膜上，5%的脫脂牛奶封閉1 h，加入一抗(1∶1 000) 4 ℃過夜，TBST洗膜3次后加入二抗(1∶3 000)室溫孵育1 h，TBST洗膜3次后顯影曝光，圖像掃描。采用Image J圖像分析軟件計算條帶灰度值，將目標條帶灰度值與內參灰度值對比表示目標蛋白相對表達量。

2.7 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 造模小鼠大體及肺組織HE染色結果

接種后7 d隨機挑選處死的6只小鼠中有2只小鼠肺表面有明顯肉眼結節(jié)形成，其中1只小鼠同時出現了肝臟遠處轉移；其余4只小鼠未發(fā)現肺表面肉眼結節(jié)形成，但病理HE染色鏡下可見肺內小結節(jié)形成，腫瘤細胞形成大小不等、排列不規(guī)則的癌巢，判斷造模成功，見圖1。

注：A.解剖可見小鼠肺部肉眼瘤結節(jié)形成；B.小鼠肺表面明顯肉眼腫瘤結節(jié)形成，箭頭所示為瘤結節(jié)；C.小鼠遠道肝表面轉移性腫瘤結節(jié)，箭頭所示為臟臟表面瘤結節(jié)；D.肺內腫瘤細胞形成大小不一、排列不規(guī)則的癌巢，箭頭所示為肺組織內癌巢形成。圖1 荷瘤小鼠大體及病理HE染色觀察

3.2 各組小鼠肺組織中MDSCs、M1及M2型TAMs細胞百分比比較

與空白組相比，模型組小鼠肺組織中M1型TAMs細胞百分比顯著降低(P<0.05)，M2型TAMs、MDSCs百分比顯著上升(P<0.05)；與模型組相比，肺巖寧低、高劑量組小鼠肺組織中M1型TAMs細胞百分比顯著上升(P<0.05)，M2型TAMs、MDSCs百分比顯著降低(P<0.05)，見表1、圖2。

表1 各組小鼠肺組織TAMs、MDSCs淋巴細胞占比比較

圖2 各組小鼠肺組織中TAMs、MDSCs細胞流式圖

3.3 各組小鼠血清中IL-4、IL-10水平

與空白組相比，模型組、肺巖寧低、高劑量組小鼠血清中IL-4、IL-10水平顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，肺巖寧低、高劑量組小鼠血清中IL-4、IL-10水平顯著降低(P<0.05)；與肺巖寧低劑量組相比，高劑量組小鼠血清中IL-4、IL-10水平顯著降低(P<0.05)，見表2。

表2 各組小鼠血清中細胞因子水平

3.4 各組小鼠肺組織中iNOS、Arg mRNA表達水平

與空白組相比，模型組小鼠肺組織中 iNOS mRNA水平顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，肺巖寧低、高劑量組小鼠肺組織中 iNOS mRNA水平顯著升高(P<0.05)。與空白組相比，模型組小鼠肺組織中Arg-1 mRNA水平顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，肺巖寧低、高劑量組小鼠肺組織中Arg-1 mRNA 水平顯著降低(P<0.05)，見表3。

表3 各組小鼠肺組織中iNOS、Arg-1 mRNA水平

3.5 各組小鼠肺組織中PD-1、PD-L1、PI3K、C/EBPβ表達水平

與空白組相比，模型組小鼠肺組織中PD-1、PD-L1、PI3K、C/EBPβ表達增加(P<0.05)；肺巖寧低劑量組小鼠肺組織中PD-1、PD-L1、PI3K表達增加(P<0.05)。與模型組相比，肺巖寧高劑量組小鼠肺組織中PD-1、PD-L1、PI3K、C/EBPβ表達下調(P<0.05)，肺巖寧低劑量組PD-L1表達下調(P<0.05)；與肺巖寧低劑量組相比，肺巖寧高劑量組小鼠肺組織中PD-L1表達下調(P<0.05)，見圖3、表4。

圖3 各組小鼠肺組織PD-1、PD-L1、PI3K、C/EBPβ表達比較

表4 各組小鼠肺組織PD-1、PD-L1、PI3K、C/EBPβ表達水平

4 討論

肺癌屬于中醫(yī)學中“肺積”“痞癖”等范疇，徐振曄教授認為中醫(yī)藥抗腫瘤的優(yōu)勢不在于“徹底消滅”腫瘤，而在于“改造”腫瘤所處的內外環(huán)境，即重塑腫瘤微環(huán)境[8]。中醫(yī)藥整體調節(jié)、辨證施治的方式，將“扶正祛邪、調和陰陽”的總體辨治思路，從“病、癥、證”的不同層面結合個體異質性施治，多靶點、多途徑改善乏氧、酸中毒、慢性炎癥及免疫抑制狀態(tài)，恰恰解釋了其通過對腫瘤微環(huán)境的調節(jié)達到抑制腫瘤抗轉移的目的。肺巖寧方中生黃芪補氣溫陽、白術甘溫健脾，兩藥相合，補肺脾腎之虛；黃精益精填髓、仙靈脾合山茱萸補腎溫陽，三藥相合，陰陽并補，陰中求陽，陽中求陰；石見穿、山慈菇、露蜂房、七葉一枝花、干蟾皮解毒散結，祛邪抗癌，諸藥相合，攻補兼施、益氣養(yǎng)精、解毒散結。全方著眼于“正氣已虛”之本，兼顧“癌毒內結”之標，以益氣養(yǎng)精之法固護機體整體正氣，扶正培本，使抗邪之氣源源不竭，“養(yǎng)正積自除”，注重脾腎先后天之本，增強機體抗病能力，并用解毒散結之品，重拳出擊，務必使邪去正安，“疏其雍滯，令上下無礙，氣血通調，則寒熱自如，陰陽調達”(《素問·至真要大論》)，攻補并蓄，總以調整整體氣血陰陽、臟腑功能的平衡為主，以運動觀念貫徹整個治療過程中。本實驗結果表明，肺巖寧方抑制MDSCs、M2 型TAMs等TIMs的增殖，促使TAMs表型向M1型轉化，同時抑制MDSCs、TAMs精氨酸的合成及免疫抑制性細胞因子IL-4、IL-10的釋放，從而達到重塑腫瘤微環(huán)境、改善腫瘤免疫抑制的目的。

免疫抑制性髓樣細胞(Immunosuppressive myeloid cells)又被稱為腫瘤浸潤性髓樣細胞(Tumor-infiltrating myeloid cells, TIMs)，大量存在于實體瘤基質中，在受到腫瘤、炎癥等刺激后被招募至腫瘤組織，分化成具有免疫抑制活性的一類髓樣細胞。典型的TIMs有MDSCs及TAMs，MDSCs是一類未分化成熟并具有免疫抑制特性的髓源性細胞，其在腫瘤組織、淋巴結或血液循環(huán)中的聚集是腫瘤逃避免疫攻擊的一個重要機制，為腫瘤的轉移提供了有利條件[9]，在NSCLC癌患者來源的異種移植瘤模型中，MDSCs浸潤通過分泌趨化因子、誘導EMT促進腫瘤轉移[10]。MDSCs利用CD45磷酸酶活性上調引起STAT3的抑制而分化為成熟的TAMs[11],兩者均屬于異質性程度較高的一類細胞群。TAM是腫瘤中浸潤的主要炎癥細胞，屬于固有免疫系統(tǒng)細胞，具有殺傷腫瘤和促瘤生長的雙重作用，根據其功能性可分為M1型(經典激活的M1型，Classically activated)及M2型(選擇活化的M2型，Alternatively activated)兩類，在腫瘤組織中，TAMs由抑瘤的M1型向M2型促瘤型分化，促進Th2淋巴細胞和Treg細胞分化和招募，促進腫瘤增殖、生長、轉移、血管生成，降低機體主動免疫反應，為腫瘤的浸潤、進展及轉移提供了適宜的免疫環(huán)境[12]。

MDSCs及M2型TAMs的免疫抑制活性主要通過對T細胞耗竭或對其活性抑制發(fā)揮作用，與其消耗T細胞增殖所必須的代謝物、產生免疫抑制性細胞因子抑制T細胞功能、阻斷T細胞檢查點激活等機制相關。在動物模型和腫瘤患者組織中均發(fā)現MDSCs高表達Arg-1消耗細胞外L-精氨酸，抑制T細胞對精氨酸的利用，使T細胞上TCR缺乏CD3ζ鏈，抑制T細胞增殖及功能，通過對T細胞的耗竭發(fā)揮免疫抑制作用[13-14]。精氨酸酶和可誘導的iNOS存在互相競爭，在TAMs中，iNOS通過Th1型細胞因子來上調表達，而M2型TAMs通過Th2型細胞因子誘導釋放高活性精氨酸酶，因此在實體瘤中招募到的M2型TAMs釋放大量具有活性的精氨酸酶產生尿素和鳥氨酸，促進腫瘤細胞的增殖和血管生成[15]。本實驗結果表明荷瘤狀態(tài)下小鼠肺組織中MDSCs及M2型TAMs大量增殖，其Arg-1 mRNA表達增高，肺巖寧方可降低小鼠肺組織中MDSCs及M2型TAMs水平及Arg-1 mRNA表達水平；同時升高M1型TAMs水平及iNOS mRNA表達水平。

MDSCs及TAMs還可以通過產生免疫抑制性炎性細胞因子發(fā)揮免疫抑制活性，這些因子初始由腫瘤細胞分泌，支持腫瘤基質中MDSCs及M2細胞表型TAMs的募集和發(fā)育，繼而形成惡性循環(huán)，維持免疫抑制環(huán)境，存在于腫瘤進展的全過程。IL-4、IL-10為Th2型細胞因子，通過激活STATs、PI3K信號通路誘導MDSCs生成及TAMs向M2型分化[16-17]。本實驗結果表明肺巖寧方能下調荷瘤狀態(tài)下小鼠外周血中IL-4、IL-10的表達，抑制MDSCs及M2型TAMs擴增，從功能層面重塑腫瘤免疫微環(huán)境。

在腫瘤中，PD-1/PD-L1信號通路異常激活，可抑制T細胞增殖及功能活化，誘導腫瘤免疫逃逸發(fā)生，腫瘤中浸潤的髓樣細胞MDSCs及TAMs的免疫抑制活性可直接介導免疫檢查點阻斷治療耐藥的發(fā)生，從而產生免疫抑制[18]。在小鼠模型中，選擇性抑制巨噬細胞PI3Kγ/C/EBPβ活性，可恢復 CD8+T細胞活化和細胞毒性，增強免疫檢查點抑制劑治療作用，抑制腫瘤生長，延長瘤鼠生存[19]，提示靶向 PI3K 通路的策略可能通過提高免疫療法療效治療腫瘤的可行性。本實驗結果表明肺巖寧方下調PD-1/PD-L1及 PI3K/C/EBPβ信號通路表達，同樣具有抑制MDSCs及M2型TAMs擴增，誘導M2型TAMs向M1型轉化的改善作用。

綜上所述，肺巖寧方重塑腫瘤免疫微環(huán)境的作用體現在針對腫瘤形成過程中局部病灶寒熱、虛實、氣血、陰陽失調的基礎，把握住致病因素與機體抗邪能力之間不平衡的關系，補其不足，損其有余，抑制肺癌局部免疫抑制性髓樣細胞MDSCs及M2型TAMs增殖，調控M2 型TAMs重塑為具有抑瘤作用的M1型TAMs，調控其功能蛋白iNOS、Arg-1合成，下調IL-4、IL-10細胞因子水平，其內在作用機制可能與其抑制PD-1/PD-L1及PI3K/C/EBPβ信號通路相關。肺巖寧方調節(jié)肺癌腫瘤微環(huán)境的作用是其“益氣養(yǎng)精，解毒散結”作用的一種外在具體體現，亟待進一步深入探討其具體分子作用機制，為今后臨床開發(fā)奠定一定的實驗基礎。