尚元元 李可心 馬春梅 李莎莎 扈容英 楊文君

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，銀川 750004； 2.寧夏醫(yī)科大學(xué)，銀川 750004)

侵襲性真菌感染(invasive fungal infection，IFI)是真菌侵入人體組織、器官或血液，并進(jìn)行生長(zhǎng)和繁殖久之造成機(jī)體組織及器官損傷、功能障礙的真菌感染性疾病，常發(fā)生于ICU、呼吸科及燒傷科的重癥疾病中[1]。近年來(lái)，IFI呈逐年上升趨勢(shì)，由于不同真菌感染其潛伏期及發(fā)病狀態(tài)不同，早期易被基礎(chǔ)疾病掩蓋，加之IFI早期快速診斷方法尚未完善，常規(guī)組織病理取材及實(shí)施難度較大且有創(chuàng)，病原微生物培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，且敏感度易受培養(yǎng)環(huán)境等多方面的影響，易延誤病情，錯(cuò)失最佳治療時(shí)間[2]。IFI病死率居高不下，尤其對(duì)免疫力低下患者的生命造成嚴(yán)重威脅，早診斷、早治療具有重要的臨床意義，探究具有高靈敏度和特異性的診斷檢測(cè)方法是IFI臨床研究的重點(diǎn)。目前，IFI的臨床診斷中以G試驗(yàn)和GM試驗(yàn)應(yīng)用最為廣泛，具有早期診斷和判斷療效的作用，但臨床實(shí)踐[3]表明，G試驗(yàn)及GM試驗(yàn)結(jié)果中假陽(yáng)性及假陰性無(wú)法規(guī)避，因此對(duì)其臨床應(yīng)用有一定的限制。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，IFI早期診斷有了新的思路和方向，實(shí)時(shí)熒光定量(realtime fluorescence quantitative PCR,RTFQ-PCR)檢測(cè)具有較高的敏感性和特異性,可以克服現(xiàn)有診斷中的多種難題，為初步探討RTFQ-PCR檢測(cè)聯(lián)合G試驗(yàn)及GM試驗(yàn)對(duì)IFI早期診斷價(jià)值，筆者對(duì)寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院60例IFI高?；颊哌M(jìn)行臨床分析，旨在為定量RTFQ-PCR應(yīng)用于IFI的早期診斷提供客觀依據(jù)。現(xiàn)匯報(bào)如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

納入2014年4月—2015年10月我院(寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院)ICU、呼吸科及燒傷科等IFI高發(fā)科室中60例IFI高?；颊撸蠭FI高?；颊呔凑铡吨匕Y患者侵襲性真菌感染診斷與治療指南》(2007 版本)[4]進(jìn)行診斷及治療。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

參照歐洲癌癥研究和治療組織/侵襲性真菌感染協(xié)作組和美國(guó)國(guó)立變態(tài)反應(yīng)和感染病研究院真菌病研究組(EORTC/MSG)共識(shí)組制訂的侵襲性真菌感染的修訂定義及中華醫(yī)學(xué)會(huì)重癥醫(yī)學(xué)分會(huì)制定的《重癥患者侵襲性真菌感染診斷與治療指南》[5]，制定的IFI診斷標(biāo)準(zhǔn)分為4種：確診、臨床診斷、擬診及排除IFI組，其中以確診、臨床診斷及擬診IFI組為陽(yáng)性病例，排除IFI組作為陰性對(duì)照病例。

1.3 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn) ①IFI高?；颊?；②醫(yī)院倫理委員會(huì)知情同意批準(zhǔn)者；③家屬及其委托代理人知情同意并自愿參與者；④自主配合且對(duì)研究相關(guān)步驟及項(xiàng)目無(wú)異議者；⑤基礎(chǔ)疾病病情穩(wěn)定無(wú)生命威脅者。

排除標(biāo)準(zhǔn) ①不屬于納入標(biāo)準(zhǔn)條件范圍內(nèi)者；②入組前未進(jìn)行相關(guān)針對(duì)性治療者；③入組前使用可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的藥物或治療者；④病歷資料不全者；⑤中途退出或轉(zhuǎn)院者。

1.4 樣本采集

按RTFQ-PCR檢測(cè)、GM試驗(yàn)和G試驗(yàn)要求分別采取血清和肝素抗凝的血漿標(biāo)本各2 mL，離心后取其血清保存在-80℃冰箱，以留備進(jìn)一步試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前將血清4℃解凍。同時(shí)對(duì)60例患者的痰、血、支氣管肺泡灌洗液等進(jìn)行真菌培養(yǎng)及真菌涂片，真菌培養(yǎng)樣本于我院真菌和真菌病研究中心和臨床檢驗(yàn)室根據(jù)形態(tài)、生理生化特性及分子生物學(xué)進(jìn)行鑒定。

1.5 主要試劑與儀器

Platelia曲霉診斷試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，GKT25M Set 動(dòng)態(tài)真菌檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京金山川科技發(fā)展公司，QIAamp DNA Blood Mini Kit 試劑盒、引物和探針購(gòu)自生工公司，白念珠菌核酸檢測(cè)試劑盒購(gòu)自泰普生物科學(xué)有限公司，ABI7500熒光定量 RTFQ-PCR儀 (美國(guó)ABI公司)，MB-80微生物動(dòng)態(tài)快速檢測(cè)系統(tǒng)(北京金山川公司)，T01- JSQ24-D12T01智能恒溫儀(美國(guó)DU PONT公司)， ELX808細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)儀(廈門鱟試劑生物科技股份有限公司)。

1.6 方法

真菌培養(yǎng) 根據(jù)標(biāo)本種類的不同接種在不同培養(yǎng)基上，25℃、37℃培養(yǎng)，每24 h觀察1次結(jié)果，根據(jù)菌落生長(zhǎng)的形態(tài)，生長(zhǎng)特點(diǎn)及色素進(jìn)行初級(jí)鑒別，如果生長(zhǎng)為酵母菌的，進(jìn)一步將酵母菌接種于科瑪嘉顯色培養(yǎng)基上進(jìn)行分離鑒定，不能顯色的酵母類及非酵母類真菌根據(jù)其鏡下菌絲、孢子特征或進(jìn)一步小培養(yǎng)的生長(zhǎng)特點(diǎn)進(jìn)行鑒定，仍不能確定的采用全自動(dòng)微生物分析儀(VITEK 2 COMPACT)進(jìn)行鑒定。

RTFQ-PCR檢測(cè) 釆用定量RTFQ-PCR Taq Man探針?lè)?，以真菌高度保守?8S rRNA為目的基因，設(shè)計(jì)合成相應(yīng)特異性引物和探針，上游引物:5＇-GTGAATCATCGAATCTTTGAAC-3＇;下游引物:5＇-TCCTC-CGCTTATTGATATGC-3＇;TapMan探針:5＇-FAM-ATTGCTTGCG-GCGGTAACGTCC-TAMRA-3＇，探針特異性很高，可特異性的結(jié)合目的基因，陽(yáng)性對(duì)照品為含目的基因質(zhì)粒，目的基因來(lái)自美國(guó)菌種保藏中心(ATCC)的原始菌株。反應(yīng)程序?yàn)?37 ℃ 2 min;94 ℃ 2 min;94 ℃ 20 s，55 ℃ 45 s，10個(gè)循環(huán);94 ℃20 s，55 ℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)。曲霉基因檢測(cè)試劑盒(RTFQ-PCR-熒光探針?lè)?反應(yīng)程序:95 ℃ 15 min; 94 ℃ 15 s，55 ℃45 s，40個(gè)循環(huán)。結(jié)果判讀：Ct值在15～35范圍內(nèi)為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)，Ct 值超出35為陰性標(biāo)準(zhǔn)[6]。為防止實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，實(shí)驗(yàn)中設(shè)立對(duì)照，分別是標(biāo)準(zhǔn)品系列，空白和陰性對(duì)照。同時(shí)收集患者的實(shí)驗(yàn)室、組織病理、影像學(xué)及危險(xiǎn)因素等臨床資料。將研究對(duì)象分為4個(gè)級(jí)別：確診、臨床診斷、擬診及排除IFI組，其中以確診、臨床診斷及擬診IFI組作為陽(yáng)性病例，排除IFI組作為陰性對(duì)照病例。

G試驗(yàn)檢測(cè) IFI高?；颊?0例(同上述定量RTFQ-PCR檢測(cè))的血清標(biāo)本，采用GKT-1M動(dòng)態(tài)真菌檢測(cè)試劑盒，混勻后3 000 r/min 離心1 min，取富含血小板血漿100 μL，取上清液200 μL，切勿有氣泡，立即插入檢測(cè)系統(tǒng)中，2～3 h即可出結(jié)果，檢測(cè)結(jié)果由MB-80微生物動(dòng)態(tài)檢測(cè)系統(tǒng)自動(dòng)計(jì)算出待測(cè)血清中BG濃度。操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。參照試劑盒說(shuō)明書的標(biāo)準(zhǔn)范圍，BG試驗(yàn)陽(yáng)性定義為血清中BG濃度≥100.0 pg/mL[7]。

GM試驗(yàn)檢測(cè) IFI高危患者60例(同上述定量RTFQ-PCR檢測(cè))的血清標(biāo)本，采用曲霉菌抗原酶免試劑盒(96T)檢測(cè)，將于100℃水浴離心后的50 μL標(biāo)本上清液與50 μL結(jié)合液加入含抗半乳甘露聚糖單克隆抗體EB-A2的微孔板，封板后 37℃孵育 90 min;加入顯色液后避光放置30 min；加入終止液后在自動(dòng)定量酶標(biāo)儀 450 nm/630 nm 處讀取吸光度值，參照美國(guó)FDA建議將閾值I大于0.5定義為陽(yáng)性[8]。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，評(píng)價(jià)RTFQ-PCR定量檢測(cè)、G及GM檢測(cè)的診斷價(jià)值并進(jìn)行ROC曲線分析。評(píng)價(jià)3種診斷方法的相關(guān)性、一致性及聯(lián)合診斷的敏感性和特異性。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 基本情況

60例患者中男性42例，女性18例，年齡12～72(46.73±6.38)歲。IFI臨床診斷情況：共有38例診斷為院內(nèi)侵襲性真菌感染，其中確診3例，男女比例(2∶1)，臨床診斷27例，男女比例(7∶2)，擬診8例，男女比例(3∶5)，排除22例，男女比例(8∶3)。

2.2 檢測(cè)結(jié)果

真菌培養(yǎng)結(jié)果 38例診斷為院內(nèi)IFI的患者(包括確診、臨床診斷和擬診)，真菌培養(yǎng)陽(yáng)性19例，標(biāo)本來(lái)自于痰液，支氣管、肺泡灌洗液，血液，尿液、腹水、鼻竇抽取液、腸道黏膜及深部組織；每例標(biāo)本均先行真菌直接涂片，后行真菌培養(yǎng)，2例深部組織同時(shí)行病理檢查。其中曲霉9例(4例為支氣管、肺泡灌洗液，其中有2例在痰液中也找到了真菌，3例為痰液，1例來(lái)自鼻竇抽取液，1例為支氣管鏡穿刺組織)，占47%；白念珠菌4例(1例為靜脈血，1例為尿液,1例為腹水， 1例為腎臟穿刺活檢組織)，占22%；熱帶念珠菌3例(1例為支氣管、肺泡灌洗液，1例為尿液，1例為腹水)，占16%；光滑念珠菌1例(標(biāo)本為尿液)，占5%；季也蒙念珠菌1例(標(biāo)本為腹水)，占5%；混合感染1例(包括念珠菌和曲霉，標(biāo)本為痰液)，占5%。2例深部組織病理檢查，在組織病理切片中找到了真菌的菌絲和孢子。

G試驗(yàn)、GM試驗(yàn)、RTFQ-PCR檢測(cè)及聯(lián)合檢測(cè)檢出陽(yáng)性率 結(jié)果顯示，G試驗(yàn)IFI確診組、臨床診斷組、擬診組及排除組檢出陽(yáng)性率分別為100%、70.37%、75.00%和54.55%；GM試驗(yàn)IFI確診組、臨床診斷組、擬診組及排除組檢出陽(yáng)性率分別為66.67%、70.37%、62.50%和45.45%；RTFQ-PCR檢測(cè)IFI確診組、臨床診斷組、擬診組及排除組檢出陽(yáng)性率分別為100%、81.48%、87.50%和22.73%。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 G試驗(yàn)、GM試驗(yàn)及RTFQ-PCR檢測(cè)及聯(lián)合檢測(cè)檢出陽(yáng)性率比較Tab.1 Comparison of positive rates of G test, GM test and RTFQ-PCR detection and combined detection

G試驗(yàn)、GM試驗(yàn)、RTFQ-PCR檢測(cè)及聯(lián)合檢測(cè)診斷IFI價(jià)值分析 以IFI確診、臨床診斷及疑診組合計(jì)38例為IFI真陽(yáng)性，以排除組22例為真陰性，RTFQ-PCR+G+GM聯(lián)合檢測(cè)陽(yáng)性以3種檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性進(jìn)行計(jì)數(shù)，經(jīng)過(guò)SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析顯示，G試驗(yàn)、GM試驗(yàn)、RTFQ-PCR檢測(cè)、RTFQ-PCR+G+GM聯(lián)合檢測(cè)敏感度、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)、陰性預(yù)測(cè)值、符合度結(jié)果見(jiàn)表2。采用SPSS17.0進(jìn)行 ROC曲線分析(見(jiàn)圖1)，結(jié)果顯示，G試驗(yàn)、GM試驗(yàn)及RTFQ-PCR檢測(cè)在診斷IFI中均具有較高的臨床價(jià)值(P均<0.05)(見(jiàn)表3)。

表2 G試驗(yàn)、GM試驗(yàn)、RTFQ-PCR檢測(cè)及聯(lián)合檢測(cè)診斷IFI價(jià)值分析Tab.2 G test, GM test, RTFQ-PCR test and combined detection of IFI

圖1 ROC曲線分析Fig.1 ROC curve analysis

表3 G試驗(yàn)、GM試驗(yàn)、RTFQ-PCR檢測(cè)診斷IFI臨床價(jià)值ROC曲線分析Tab.3 G test, GM test, RTFQ-PCR detection and diagnosis of IFI analysis

3 討 論

侵襲性真菌感染(invasive fungal infection, IFI)是指真菌侵犯皮下組織、黏膜和內(nèi)臟所引起的真菌感染性疾病[9]。近年來(lái)，隨著廣譜抗生素、抗腫瘤藥物、糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑在臨床上的廣泛應(yīng)用，器官移植及各種創(chuàng)傷性檢查和治療手段及導(dǎo)管技術(shù)的活躍開(kāi)展，自身免疫性疾病、艾滋病、惡性腫瘤和糖尿病等基礎(chǔ)疾患及人口老齡化等因素，使免疫受損人群不斷增加，IFI發(fā)病率逐年上升[10]。據(jù)最新報(bào)道念珠菌感染已上升至院內(nèi)血源感染的第四位，死亡率第一位；曲霉已為第二位常見(jiàn)侵襲性真菌病，死亡率達(dá)60%～90%[11]，如此龐大的數(shù)字足以引起醫(yī)患重視。所以IFI的早期診斷對(duì)于臨床具有極其重要的臨床價(jià)值和意義。

近年來(lái)，IFI的血清學(xué)檢測(cè)取得了較大發(fā)展，目前己用于臨床快速早期診斷。血清學(xué)檢測(cè)包括真菌(1，3)-β- D葡聚糖(BG)檢測(cè)和半乳甘露聚糖(GM)檢測(cè)[12]。(1，3)-β-D葡聚糖是真菌細(xì)胞壁的組成成分，可用于診斷多種真菌感染，包括念珠菌，曲霉菌和鐮刀菌屬，但接合菌和隱球菌除外。當(dāng)真菌進(jìn)入人體血液或深部組織后，經(jīng)吞噬細(xì)胞的吞噬、消化等處理后，(1，3)-β-D葡聚糖可從胞壁中釋放出來(lái)，從而使血液及其他體液中(1，3)-β-D葡聚糖含量增高[13]。而且各項(xiàng)研究[14]顯示，(1，3)-β-D葡聚糖水平可隨病情而動(dòng)態(tài)變化，對(duì)判斷病情和療效有一定意義。在黃耀光等[15]的相關(guān)研究中， G試驗(yàn)在侵襲性肺部真菌感染(invasive pulmonary fungal infection，IPFI)患者診斷中， 支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF) G試驗(yàn)陽(yáng)性率為77.31%，血漿G試驗(yàn)陽(yáng)性率為76.47%，均具有較高的靈敏度。張小華等[16]在對(duì)ICU中139例IPFI患者研究中指出，BALF G試驗(yàn)診斷敏感性為80.00%，二者與本研究G試驗(yàn)診斷IFI 81.58%的敏感度基本一致，此外張小華等在研究中還表示，BALF G試驗(yàn)在IPFI診斷中具有20.00%的漏診率和9.09%的誤診率。而在本研究中G試驗(yàn)診斷特異性較差，且假陽(yáng)性率高達(dá)40.91%，與有關(guān)報(bào)道基本一致。本研究中GM試驗(yàn)診斷IFI敏感度為76.32%，與陸書華等[17]研究基本一致，且較G試驗(yàn)靈敏度稍差，但其特異性有所上升，且假陽(yáng)性率有所降低，假陽(yáng)性率為31.82%。由于二者在IFI診斷中敏感度均不是十分理想，故多個(gè)研究支持在實(shí)際的臨床操作中采用二者聯(lián)合檢測(cè)，相關(guān)報(bào)道[18]表示，二者聯(lián)合檢測(cè)其敏感度和特異性有效提高。筆者對(duì)此類文獻(xiàn)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，二者聯(lián)合檢測(cè)多以二者結(jié)果其一或同時(shí)表現(xiàn)為陽(yáng)性即為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)，在此情況下可知其較高的假陽(yáng)性率仍不可避免。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，IFI早期快速診斷有了新的思路和方向，與傳統(tǒng)的培養(yǎng)及表型鑒定相比，分子診斷技術(shù)大大縮短了診斷所需時(shí)間，同時(shí)提高了敏感性和特異性，且操作簡(jiǎn)便、易于重復(fù)[19]。RTFQ-PCR是近年來(lái)發(fā)展較為迅速，且廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、農(nóng)業(yè)、食品安全等方面研究的分子生物學(xué)技術(shù)，在醫(yī)療診斷中具有以下優(yōu)點(diǎn)：①高度自動(dòng)化，全封閉狀態(tài)下對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，高效解決實(shí)驗(yàn)中污染問(wèn)題，避免出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果；②更強(qiáng)的特異性；③對(duì)初始基因精確定量，高度的敏感度；④與傳統(tǒng)的病理診斷和培養(yǎng)相比，RTFQ-PCR耗時(shí)短，發(fā)出實(shí)驗(yàn)室檢查報(bào)告僅需2 h[20]。在實(shí)際的臨床診療中時(shí)效性具有重要的意義和作用，RTFQ-PCR完全滿足臨床診療需求，并且通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)，RTFQ-PCR檢測(cè)IFI在確診組、臨床診斷組、擬診組及排除組明顯提高了IFI臨床診斷敏感性和特異性。此外，本研究在聯(lián)合檢測(cè)中以RTFQ-PCR+G+GM三種檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性進(jìn)行計(jì)數(shù)，研究結(jié)果顯示，RTFQ-PCR+G+GM聯(lián)合檢測(cè)敏感度為55.26%，特異性95.45%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值95.45%，陰性預(yù)測(cè)值55.26%，符合度為70.00%。由于聯(lián)合檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)影響，聯(lián)合檢測(cè)在IFI中的診斷敏感性較低，在臨床實(shí)際操作過(guò)程中可能存在漏診情況，但RTFQ-PCR+G+GM聯(lián)合檢測(cè)完全改善了假陽(yáng)性率高這一普遍問(wèn)題，本研究中RTFQ-PCR+G+GM聯(lián)合檢測(cè)有效提高了IFI診斷的準(zhǔn)確性。經(jīng)ROC曲線分析，G試驗(yàn)、GM試驗(yàn)、RTFQ-PCR檢測(cè)在IFI診斷中均具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值，RTFQ-PCR檢測(cè)(AUC=0.790)優(yōu)于G試驗(yàn)(AUC=0.718)和GM試驗(yàn)(AUC=0.735)。

綜上所述，G試驗(yàn)、GM試驗(yàn)、RTFQ-PCR檢測(cè)在IFI診斷中均具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值，但G試驗(yàn)、GM試驗(yàn)在IFI診斷中假陽(yáng)性率較高，故在單種方式檢測(cè)中推薦RTFQ-PCR檢測(cè)，而RTFQ-PCR+G+GM聯(lián)合檢測(cè)則能夠明顯提高IFI臨床診斷準(zhǔn)確性。