王欽?司華新?伏蓉?孔彩華?劉克娜?隋世燕

【摘要】目的 研究喙尾琵琶甲乙醇提取物（BRFAE）對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的卵巢早衰小鼠的保護(hù)作用，初步探索沉默信息調(diào)節(jié)因子1 /腫瘤相關(guān)蛋白53 （SIRT1/p53）信號(hào)通路在此過程中的作用。方法 將40只無特定病原體級(jí)雌性KM小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和BRFAE低劑量和高劑量組。模型組和BRFAE低、高劑量組予腹腔注射環(huán)磷酰胺160 mg/kg，對(duì)照組則注射等體積的生理鹽水，次日對(duì)照組和模型組予生理鹽水灌胃，BRFAE低、高劑量組分別予BRFAE 100、200 mg/kg灌胃，連續(xù)14 d。干預(yù)結(jié)束后采集小鼠血液檢測(cè)小鼠血漿丙二醛、一氧化氮和超氧化物歧化酶（SOD）水平，摘取卵巢稱重并制作HE切片進(jìn)行卵泡計(jì)數(shù)，同時(shí)檢測(cè)卵巢組織中SIRT1和p53 mRNA及蛋白表達(dá)。結(jié)果 低、高劑量的BRFAE均能改善環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的卵巢增重和卵巢指數(shù)降低（P均<0.01），增加原始、初級(jí)卵泡和各級(jí)卵泡總數(shù)并減少閉鎖卵泡的數(shù)量（P均< 0.05），其卵巢體積增大、黃體纖維化和血管減少，一氧化氮和丙二醛的水平降低，SOD活力升高（P均< 0.01），且高劑量BRFAE各項(xiàng)指標(biāo)改善效果比低劑量BRFAE更為明顯（P均<0.05）。免疫組織化學(xué)染色顯示，與對(duì)照組相比，模型組SIRT1蛋白表達(dá)減弱（P < 0.01），而p53蛋白表達(dá)增強(qiáng)（P < 0.01），經(jīng)BRFAE治療后SIRT1蛋白表達(dá)增強(qiáng)（P < 0.01），而p53蛋白表達(dá)減弱（P < 0.01）。SIRT1和p53的qPCR檢測(cè)結(jié)果與免疫組織化學(xué)染色結(jié)果基本一致。結(jié)論 BRFAE能夠通過抗氧化作用抑制環(huán)磷酰胺所致的小鼠卵巢早衰，SIRT1/p53信號(hào)通路可能參與了其抗卵巢早衰作用。

【關(guān)鍵詞】喙尾琵琶甲乙醇提取物;SIRT1/p53通路;KM小鼠;卵巢早衰

Protective effect of Blaps Rynchopetera Fairmaire alcohol extract on cyclophosphamide-induced premature ovarian failure in mice Wang Qin， Si Huaxin， Fu Rong， Kong Caihua， Liu Kena， Sui Shiyan. School of Public Health， Dali University， Dali 671000， China

Corresponding author， Sui Shiyan， E-mail： sysui569@163.com

【Abstract】Objective To evaluate the effect of Blaps Rynchopetera Fairmaire alcohol extract （BRFAE） on cyclophosphamide （CP）-induced premature ovarian failure in mouse models and investigate the role of SIRT1/p53 signaling pathway in this process. Methods Forty SPF female KM mice were randomly divided into the control， model， low- and high-dose BRFAE groups. Mice in the model， low- and high-dose BRFAE groups were given with CP at a dose of 160 mg/kg， and those in the control group were given with normal saline. On the next day， mice in the control and model groups were intragastrically administered with normal saline， and those in the low- and high-dose BRFAE groups were intragastrically administered with BRFAE （100 mg/kg and 200 mg/kg） for 14 consecutive d. After intragastric administration， mouse plasma samples were taken to detect the levels of malondialdehyde （MDA）， nitric oxide （NO） and superoxide dismutase （SOD）. The ovarian tissues were collected， weighed and prepared for HE staining. The quantity of follicles was counted. The expression levels of SIRT1 and p53 mRNA and proteins in the ovarian tissues were also determined. Results Administration of low- and high-dose BRFAE significantly improved the CP-induced increase in ovarian weight and the reduction of ovarian index （all P < 0.01）， significantly increased the total quantity of primitive， primary and all stages of follicles， and significantly reduced the quantity of atretic follicles （all P < 0.05）. In both low- and high-dose BRFAE groups， the ovarian volume was significantly increased， the corpus luteum fibrosis and blood vessels were significantly decreased， the NO and MDA levels were significantly declined， and the activity of SOD enzyme was significantly elevated （all P < 0.001）. The improvement effect of high-dose BRFAE was more pronounced compared with that of low-dose BRFAE （all P <

0.05）. The results of immunohistochemistry showed that compared with the control group， the expression level of SIRT1 protein in the model group was significantly down-regulated （P < 0.01）， whereas that of p53 protein was significantly up-regulated （P < 0.01）. After BRFAE treatment， the expression level of SIRT1 was significantly up-regulated （P < 0.01）， whereas that of p53 was significantly down-regulated （P < 0.01）. The expression levels of SIRT1 and p53 mRNA detected by q-PCR were basically consistent with the results of immunohistochemistry. Conclusion BRFAE inhibits CP-induced premature ovarian failure in mice through its antioxidant effect， and the SIRT1/p53 signaling pathway may be involved in its anti-premature ovarian failure effect.

【Key words】Blaps Rynchopetera Fairmaire alcohol extract; SIRT1/p53 signaling pathway;

KM mouse; Premature ovarian failure

卵巢早衰指婦女40歲之前由于某些原因引起的卵巢功能衰竭，其表現(xiàn)有閉經(jīng)、不育、雌激素缺乏，以及促性腺激素水平升高[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，近幾年來卵巢早衰的發(fā)病率在1%～3%[2]。無論哪種原因?qū)е碌穆殉苍缢?，在前期均?huì)產(chǎn)生顆粒細(xì)胞的凋亡[3]。氧化應(yīng)激即抗氧化系統(tǒng)的平衡被破壞[4]。女性衰老、肥胖等因素可引起女性卵巢氧化應(yīng)激，進(jìn)而誘導(dǎo)其卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡，導(dǎo)致卵巢早

衰[5-7]。因此，尋找一種能夠減輕人卵巢氧化應(yīng)激引起的顆粒細(xì)胞凋亡進(jìn)而抑制卵巢早衰的抗氧化物質(zhì)對(duì)改善卵巢功能有重要意義。喙尾琵琶甲（BRF）是一種攜帶臭味的昆蟲，大多分布在云南滇中、滇東高原，俗稱打屁蟲，其活性成分含量頗豐，藥用價(jià)值較高[8]。肖懷[9]研究發(fā)現(xiàn)BRF具有顯著的抗氧化活性成分。前期研究發(fā)現(xiàn)BRF流浸膏能夠改善亞硝酸鹽所致雄性小鼠生殖損傷，保護(hù)機(jī)制與抗氧化密切相關(guān)，但是其分子機(jī)制還不清楚，筆者尚未見報(bào)道BRF與卵巢早衰相關(guān)的機(jī)制研究。沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）是一種組蛋白去乙?；竅10]。SIRT1可以通過使腫瘤相關(guān)蛋白53 （p53）去乙?；档推浔磉_(dá)進(jìn)而抑制細(xì)胞衰老反應(yīng)[11]。但是，BRFAE是否通過影響SIRT1/p53通路抑制小鼠卵巢早衰有待進(jìn)一步研究。為此，本研究探討B(tài)RF乙醇提取物（BRFAE）對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的卵巢早衰小鼠的保護(hù)作用，并觀察SIRT1/p53信號(hào)通路在此過程中的作用，現(xiàn)報(bào)告如下。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雌性KM小鼠，6周齡，體質(zhì)量22～25 g，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定樣本量為40只，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[小鼠生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-004，大理大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（滇）2018-0002]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處死和組織取樣按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查指南GB/T 35892-2018》進(jìn)行。

二、試 劑

BRFAE由成年BRF鮮蟲或干蟲（批號(hào)202102 21-7）粉碎后加95%的乙醇冷浸提取4次后去脂，-20℃冷凍備用。環(huán)磷酰胺購(gòu)自江蘇恒瑞醫(yī)藥，丙二醛、一氧化氮、超氧化物歧化酶（SOD）、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒和一抗稀釋液購(gòu)自碧云天生物，SIRT1和p53兔多抗（稀釋比例均為1∶50）及兔二抗（稀釋比例均為1∶500）購(gòu)自美國(guó)Bioworld Technology，TRIzol試劑購(gòu)自美國(guó)Life Technologies，實(shí)時(shí)定量PCR（q-PCR）試劑盒購(gòu)自上海普洛麥格生物，含SYBR Green DNA聚合酶的PCR試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技，10%水合氯醛麻醉劑和10%中性甲醛固定液購(gòu)自北京雷根生物技術(shù)，肝素鈉購(gòu)自北京索萊寶。引物由蘇州金唯智生物公司合成。

三、方 法

1.造模及給藥

小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為4組：對(duì)照組、模型組、BRFAE低劑量和BRFAE高劑量組（治療組），每組各10只。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，模型組和BRFAE組予腹腔注射環(huán)磷酰胺160 mg/kg，對(duì)照組則注射等體積的生理鹽水。第2日對(duì)照組和模型組小鼠予生理鹽水灌胃，治療組予BRFAE灌胃，低、高劑量分別為100 mg/kg和200 mg/kg[12]。連續(xù)灌胃14 d，每日記錄小鼠日常行為（包括毛發(fā)、情緒、進(jìn)食、飲水、二便及應(yīng)激等）。

2. 血清氧化、抗氧化指標(biāo)檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，小鼠禁食24 h，腹腔注射水合氯醛麻醉后眼球采血（肝素鈉抗凝），1000×g離心10 min，吸取上清，根據(jù)試劑盒說明書測(cè)定血清中SOD、一氧化氮和丙二醛的水平。

3. 卵泡計(jì)數(shù)和免疫組織化學(xué)染色（IHC）

頸部脫臼處死小鼠后，摘取小鼠雙側(cè)卵巢用于計(jì)算卵巢指數(shù)（雙側(cè)卵巢質(zhì)量/體質(zhì)量，mg/g），每組選取5個(gè)卵巢進(jìn)行固定，每個(gè)卵巢制作成5個(gè)層面，HE染色后雙人盲法閱片，分別計(jì)數(shù)原始卵泡、初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡、竇卵泡和成熟卵泡的數(shù)目，最后計(jì)數(shù)各級(jí)卵泡的總數(shù)和閉鎖卵泡數(shù);其余卵巢組織置于-80℃冰箱凍存?zhèn)溆?。使用SIRT1和p53抗體進(jìn)行IHC染色，顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性結(jié)果（特定區(qū)域內(nèi)的棕黃色被視為陽(yáng)性）。按說明書應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0計(jì)算陽(yáng)性組織的校正累積光密度值，并以此為蛋白相對(duì)表達(dá)量[13]。

4. q-PCR

使用TRIzol試劑提取卵巢組織的總RNA，并用2 μg 總RNA進(jìn)行了逆轉(zhuǎn)錄。PCR反應(yīng)體系：2.5 μL cDNA，1.5 μL目的RNA或內(nèi)參RNA上下游引物，8 μL RNase-free ddH2O，0.5 μL 50倍稀釋的ROX 參比染料，12.5 μL含SYBR Green的DNA聚合酶，共25 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性15 min;95 ℃變性10 s，60 ℃退火和延伸32 s，共40個(gè)循環(huán)[14]。使用2-ΔΔCt法分析PCR結(jié)果[15]。SIRT1引物序列為上游5’-CCAGACCTCCCAGACCCTCAAG-3’，下游5’-G

TGACACAGAGACGGCTGGAAC-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度

120 bp;p53引物序列為上游5’-GGAAGCCGCCG

AAGAAGATGAG-3’，下游5’-GCTATCATTGCTCT

CCGTGTCCTC-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度82 bp;內(nèi)參GAPDH引物序列為上游5’-AGGTTGTCTCCTGCGACTTCA-

3’，下游5’-TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度184 bp。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 21.0處理數(shù)據(jù)。定量資料以表示，多組比較行單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、BRFAE對(duì)卵巢早衰模型小鼠體質(zhì)量、卵巢質(zhì)量和卵巢指數(shù)的影響

實(shí)驗(yàn)開始和實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)4組小鼠的體質(zhì)量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F值分別為0.106、0.129，P均> 0.05）。與對(duì)照組相比，模型組小鼠的卵巢質(zhì)量和卵巢指數(shù)均減少（P均< 0.01）;與模型組相比，2個(gè)治療組小鼠的卵巢質(zhì)量和卵巢指數(shù)均增加（P均< 0.01），且2個(gè)治療組之間及其與對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均> 0.05），見圖1。

二、BRFAE對(duì)卵巢早衰模型小鼠卵巢形態(tài)改變和卵泡數(shù)量的影響

與對(duì)照組相比，模型組小鼠卵巢體積減小、形態(tài)不規(guī)則，且黃體纖維化嚴(yán)重、血管較少、各級(jí)卵泡明顯較少，經(jīng)低、高劑量BRFAE治療后，小鼠卵巢均有不同程度的恢復(fù)，其原始卵泡和各級(jí)卵泡總數(shù)均有所增加（P均< 0.01），高劑量的BRFAE還能增加初級(jí)卵泡的數(shù)目（P < 0.05）。從卵巢大小而言，BRFAE高劑量組的恢復(fù)比低劑量組更為顯著。模型組的原始卵泡數(shù)、初級(jí)卵泡數(shù)和各級(jí)卵泡總數(shù)均低于對(duì)照組，而閉鎖卵泡數(shù)多于對(duì)照組（P < 0.01），見圖2、3。

三、BRFAE對(duì)卵巢早衰模型小鼠血清脂質(zhì)氧化指標(biāo)和抗氧化指標(biāo)的影響

與對(duì)照組相比，模型組小鼠血清中一氧化氮和丙二醛水平升高（P均< 0.01），而SOD活力降低（P < 0.01）。經(jīng)低、高劑量的BRFAE治療后，2個(gè)治療組的一氧化氮和丙二醛水平均降低（P均<

0.01），而SOD活力升高（P均< 0.01），且高劑量組降低丙二醛的效果優(yōu)于低劑量組（P < 0.01），見圖4。

四、BRFAE對(duì)卵巢早衰模型小鼠卵巢組織SIRT1和p53蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，模型組小鼠卵巢SIRT1蛋白表達(dá)下調(diào)且卵巢被環(huán)磷酰胺破壞嚴(yán)重未見各級(jí)卵泡形態(tài)，而經(jīng)BRFAE治療后，SIRT1蛋白表達(dá)上調(diào)，并且強(qiáng)于模型組。與BRFAE低劑量組比較，高劑量組的SIRT1蛋白表達(dá)增強(qiáng)更顯著。與對(duì)照組相比，模型組p53蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，而BRFAE治療后，2個(gè)治療組的p53蛋白表達(dá)均低于模型組，高劑量組的p53表達(dá)下調(diào)效果比低劑量組更顯著（P < 0.01），且與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），見圖5。

五、BRFAE對(duì)卵巢早衰模型小鼠卵巢組織SIRT1和p53 mRNA表達(dá)的影響

4組小鼠卵巢組織SIRT1和p53的mRNA表達(dá)與各自蛋白表達(dá)結(jié)果基本一致。與對(duì)照組相比，模型組SIRT1 mRNA相對(duì)表達(dá)量下調(diào)（P < 0.01），而經(jīng)BRFAE治療后，2個(gè)治療組的SIRT1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于模型組（P均< 0.01），高劑量組高于低劑量組和對(duì)照組（P均< 0.01）。與對(duì)照組相比，模型組p53 mRNA相對(duì)表達(dá)量上調(diào)（P <

0.01），而經(jīng)BRFAE治療后，2個(gè)治療組的p53 mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于模型組（P均< 0.01），且高劑量組低于低劑量組，2組與對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均> 0.05），見圖6。

討 論

由于體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)存在一些限制，如動(dòng)物激素水平無法測(cè)量、動(dòng)物行為狀態(tài)無法觀察等，因此我們建立卵巢早衰動(dòng)物模型進(jìn)一步探討抗氧化物質(zhì)BRFAE抵抗小鼠卵巢早衰的作用及其機(jī)制。有報(bào)道，患者在使用環(huán)磷酰胺后會(huì)出現(xiàn)卵巢儲(chǔ)備功能下降相關(guān)的不良反應(yīng)，部分患者甚至出現(xiàn)卵巢早衰，因此環(huán)磷酰胺常被用于動(dòng)物卵巢早衰模型的建立 [1， 12， 16] 。本研究中，模型組與對(duì)照組相比，卵巢質(zhì)量和卵巢指數(shù)降低、卵巢體積變小且形態(tài)不規(guī)則、黃體纖維化嚴(yán)重、血管減少、各級(jí)健康卵泡數(shù)目明顯較少而閉鎖卵泡數(shù)明顯增加，與谷毅鵬等[17]的研究結(jié)果一致。

一氧化氮、丙二醛和SOD常用于評(píng)價(jià)機(jī)體內(nèi)氧化或抗氧化應(yīng)激水平[18]。本研究顯示，BRFAE能降低小鼠血清中一氧化氮和丙二醛水平且可提高小鼠血清SOD活力，表明天然物質(zhì)BRFAE具有顯著的抵抗環(huán)磷酰胺致小鼠氧化損傷的能力。

SIRT1所介導(dǎo)的一些信號(hào)通路在延緩卵巢衰老方面發(fā)揮著重要作用[19]。SIRT1的下游基因p53能夠促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡，進(jìn)而誘導(dǎo)卵巢衰老[20]。有研究者報(bào)道，在環(huán)磷酰胺所致大鼠氧化應(yīng)激的狀態(tài)下，卵巢顆粒細(xì)胞凋亡增加，SIRT1的表達(dá)下調(diào)而p53的表達(dá)則上調(diào)，白藜蘆醇處理后可以抑制此表現(xiàn)[21]。這與本研究BRFAE的治療效果相一致，模型組SIRT1蛋白低表達(dá)而p53蛋白高表達(dá)，而經(jīng)BRFAE治療后，SIRT1蛋白表達(dá)上調(diào)而p53蛋白表達(dá)下調(diào)。mRNA結(jié)果與蛋白結(jié)果基本一致，高劑量組作用比低劑量組更為明顯。

綜上所述，BRFAE能夠通過抗氧化作用抑制環(huán)磷酰胺所致的小鼠卵巢早衰，SIRT1/p53信號(hào)通路可能參與了其抗卵巢早衰作用。BRFAE抑制環(huán)磷酰胺所致的小鼠卵巢早衰量效關(guān)系尚需日后進(jìn)一步研究明確。

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（收稿日期：2021-04-30）

（本文編輯：林燕薇）