梁媛媛 涂 曄 安曉強(qiáng) 馬 琳 江 鍵△

（海軍軍醫(yī)大學(xué)，1 衛(wèi)勤系數(shù)理教研室，3 藥學(xué)院無(wú)機(jī)化學(xué)教研室，上海 200433；2 上海市東方醫(yī)院藥學(xué)部，上海 2001203；4 解放軍總醫(yī)院京西醫(yī)療區(qū)醫(yī)技保障科，北京 100041）

皮膚瘢痕疙瘩和增生性瘢痕是纖維增生性疾病，屬于病理性瘢痕。機(jī)械刺激、遺傳、全身和受傷部位局部感染等因素可導(dǎo)致皮膚傷口異常愈合，引起增生性瘢痕的生長(zhǎng)甚至形成瘢痕疙瘩[1]。目前國(guó)內(nèi)外治療瘢痕多采用藥物治療、手術(shù)治療和物理療法。但由于個(gè)體差異，各種治療方法的臨床療效有待觀察，有的所需時(shí)間長(zhǎng)、痛苦大、容易反復(fù)等[2-3]。因此，進(jìn)一步了解病理性瘢痕的發(fā)生發(fā)展機(jī)制及尋找更為有效的治療方法一直是研究重點(diǎn)[4-7]。已有研究表明，在增生性瘢痕或瘢痕疙瘩的形成過(guò)程中，一個(gè)關(guān)鍵因素是傷口局部成纖維細(xì)胞過(guò)度增生和膠原等細(xì)胞外基質(zhì)異常積聚[8]?，F(xiàn)已證明，生物組織的行為是由電荷的流動(dòng)所控制。駐極體作為一種方便易攜的“永電體”，具有長(zhǎng)期且相對(duì)穩(wěn)定的帶電特性，已有研究表明其可以影響細(xì)胞周期、血管通透性、藥物透皮吸收速率等[9-12]。本研究建立在電生理學(xué)的基礎(chǔ)上，將駐極體靜電場(chǎng)應(yīng)用于病理性瘢痕生長(zhǎng)過(guò)程，探討其對(duì)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移的影響和可能機(jī)制，為病理性瘢痕的預(yù)防和治療提供新途徑和新思路。

1 材料和方法

1.1 駐極體的制備和分組

聚丙烯（polypropylene，PP）商品膜，膜厚為13 μm （日本東麗株式會(huì)社）；駐極體的等效表面電位通過(guò)振動(dòng)電容靜電計(jì)（北京華晶科技有限公司）測(cè)量。駐極體制備方法參考文獻(xiàn)[10]。實(shí)驗(yàn)分組如下：對(duì)照組為表面電位為0 的PP 膜，5 000 V 組為表面電位為5 000 V 駐極體，-5 000 V 組為表面電位為-5 000 V 駐極體。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑

新西蘭大白兔體質(zhì)量（2～2.5）kg，購(gòu)自海軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[動(dòng)物合格證：SCXK（滬）2018-0001]。

胰酶、胎牛血清、1640 培養(yǎng)基等購(gòu)于Gibco 公司；PBS 緩沖液購(gòu)于Servicebio 公司；CCK-8 試劑盒購(gòu)于東仁化學(xué)科技（上海）有限公司；RNA 提取液購(gòu)于武漢賽維爾生物科技有限公司；烏拉坦等常用試劑均購(gòu)于中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；熒光染料碘化丙啶（PI）等購(gòu)于南京沃博生物公司。

1.3 兔耳瘢痕模型制備

碘伏消毒兔耳，20%烏拉坦（1 g/kg）耳緣靜脈注射麻醉，每只兔耳腹側(cè)用直徑10 mm 打孔器造成圓形切口，完整切除全層皮膚，骨膜分離器剝離軟骨膜，保留耳軟骨，創(chuàng)傷間距大于1 cm。術(shù)后7 d 去除結(jié)痂，造成2 次創(chuàng)面。

1.4 瘢痕增生指數(shù)測(cè)量和成纖維細(xì)胞提取

兔耳創(chuàng)面形成后，自然愈合2 周。選取創(chuàng)面色紅、質(zhì)地硬、無(wú)毛發(fā)生長(zhǎng)，高于周圍正常皮膚的明顯形成瘢痕的組織。然后按照分組分別外敷不同極性駐極體。每組隨機(jī)分配1 只兔，駐極體每3 d 更換1 次。分別按實(shí)驗(yàn)?zāi)康碾S機(jī)取不同時(shí)間點(diǎn)的4～12 個(gè)瘢痕組織，將各組取下的瘢痕組織進(jìn)行測(cè)量。

瘢痕成纖維細(xì)胞的提取方法按文獻(xiàn)[13]進(jìn)行。

1.5 細(xì)胞增殖活性檢測(cè)

采用CCK-8 法檢測(cè)瘢痕細(xì)胞增殖活性，通過(guò)檢測(cè)活細(xì)胞線粒體脫氫酶的數(shù)量反映細(xì)胞增殖率。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的成纖維細(xì)胞接種于96 孔培養(yǎng)板中，將表面電位為0 V、-5 000 V 和5 000 V 駐極體分別作用成纖維細(xì)胞48 h 后，加入CCK-8 試劑10μL，繼續(xù)培養(yǎng)1～4 h 后，振蕩搖勻后用全自動(dòng)酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各組細(xì)胞的吸光度值（OD 值，±s）。

式中空白組為無(wú)細(xì)胞的培養(yǎng)組。

1.6 細(xì)胞周期檢測(cè)

取第3 代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期瘢痕成纖維細(xì)胞，在培養(yǎng)皿中各加入1 mL 0.25%胰蛋白酶，后吸棄之，將培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱消化 2 min 后終止消化，制成2×107/mL 單細(xì)胞懸液，并接種于 6 孔培養(yǎng)板中。1640 培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞 24 h 后換液，按實(shí)驗(yàn)分組，將3 種不同表面電位的駐極體作用于瘢痕成纖維細(xì)胞，干預(yù) 48 h 后于流式細(xì)胞儀進(jìn)行瘢痕細(xì)胞的細(xì)胞周期分析。與DNA 結(jié)合的PI 熒光強(qiáng)度反映細(xì)胞內(nèi)DNA 含量的多少。

1.7 細(xì)胞遷移能力檢測(cè)

取瘢痕成纖維細(xì)胞，消化、離心后，制成細(xì)胞懸液，按5×104個(gè)/孔種植于6 孔板中，當(dāng)細(xì)胞在 6 孔板內(nèi)鋪滿至 80%時(shí)，于6 孔板中間劃痕，并用 PBS 沖洗懸浮細(xì)胞。記錄經(jīng)表面電位為0 V、5 000 V 駐極體和-5 000 V 駐極體分別作用0、12 h和24 h 后的細(xì)胞遷移情況。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用軟件 SPSS Statistics 19 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，選用方差分析（正態(tài)分布，方差齊性）。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 駐極體的電荷儲(chǔ)存穩(wěn)定性

經(jīng)常溫等離子體制備的不同表面電位正、負(fù)極性聚丙烯駐極體，其等溫表面電位衰減曲線不再贅述[10]。實(shí)驗(yàn)表明常溫充電的正、負(fù)極性聚丙烯駐極體具有良好的電荷儲(chǔ)存穩(wěn)定性，可以用于兔耳瘢痕模型。

2.2 駐極體對(duì)瘢痕增生指數(shù)的影響

圖1分別顯示了兔耳瘢痕創(chuàng)面在第1 天、第7天和第42 天的大體組織生長(zhǎng)情況。兔耳創(chuàng)面形成瘢痕組織后的第4 周、第5 周和第6 周，經(jīng)過(guò)不同極性的5 000 V 駐極體作用后，隨時(shí)間增加，對(duì)照組瘢痕增生指數(shù)逐漸增大，說(shuō)明瘢痕增生程度逐漸增加；且與對(duì)照組相比，正、負(fù)5 000V 組駐極體作用后的瘢痕增生指數(shù)均明顯降低，說(shuō)明不同極性的5 000 V 駐極體均對(duì)瘢痕生長(zhǎng)有抑制作用，不同極性的5 000 V 駐極體的抑制作用差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表1）。

圖1 兔耳瘢痕模型創(chuàng)面的大體組織生長(zhǎng)情況。

表1 創(chuàng)面形成后4～6 周各組瘢痕增生指數(shù)變化情況（n=4，±s）

表1 創(chuàng)面形成后4～6 周各組瘢痕增生指數(shù)變化情況（n=4，±s）

*P<0.05 vs 對(duì)照組

組別 4 周 5 周 6 周對(duì)照組 3.49±0.03 3.65±0.03 4.30±0.07 5000V 組 2.80±0.04* 3.08±0.06* 3.67±0.09*-5000V 組 2.79±0.05* 3.11±0.07* 3.69±0.06*

2.3 駐極體對(duì)瘢痕細(xì)胞增殖率的影響

5 000 V組和-5 000 V駐極體分別作用瘢痕成纖維細(xì)胞24 h后，與對(duì)照組比較，經(jīng)5 000 V駐極體作用24 h后，瘢痕成纖維細(xì)胞的OD值下降為0.96±0.02（P<0.05）。而經(jīng)-5 000 V駐極體作用24 h后的瘢痕成纖維細(xì)胞，其OD值上升為1.05±0.03（P<0.05）。且隨著駐極體與細(xì)胞作用的時(shí)間越長(zhǎng)，其不同極性駐極體促進(jìn)瘢痕成纖維細(xì)胞增殖或減少其增殖的作用有加強(qiáng)趨勢(shì)（表2）。提示 -5 000 V組在較短時(shí)間內(nèi)（72 h）對(duì)細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用，而5 000 V組則對(duì)細(xì)胞增殖有抑制作用。

表2 駐極體作用不同時(shí)間后瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖率變化情況（瘢痕數(shù)n=12，±s）

表2 駐極體作用不同時(shí)間后瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖率變化情況（瘢痕數(shù)n=12，±s）

*P<0.05 vs 對(duì)照組

組別 24 h 48 h 72 h對(duì)照組 1.00±0.03 1.00±0.02 1.00±0.02 5000V 組 0.96±0.02* 0.95±0.04* 0.92±0.04*-5000V 組 1.05±0.03* 1.07±0.04* 1.09±0.03*

2.4 駐極體對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞增殖周期的影響

5 000 V 組和-5 000 V 駐極體分別連續(xù)作用細(xì)胞48 h 后，與對(duì)照組比較，經(jīng)-5 000 V 駐極體作用48 h 的瘢痕成纖維細(xì)胞群中處于G1 期的細(xì)胞比例從26.81%±0.44%上升至72.26%±0.32%；而G2 期的細(xì)胞比例也顯著上升，從13.00%±0.13%增加至24.24%±0.73%，處于S 期的細(xì)胞數(shù)顯著減少（圖2）。

5 000 V 組作用成纖維細(xì)胞48 h，處于G1 期細(xì)胞的比例較對(duì)照組也有顯著上升，從26.81%±0.44%上升至80.07%±0.02%，而G2 期的細(xì)胞有比較明顯的下降，從13.00%±0.13%減少至10.07%±0.51%，處于S 期的細(xì)胞數(shù)稍有減少。這說(shuō)明正極性駐極體產(chǎn)生的外靜電場(chǎng)使細(xì)胞阻滯于G1 期而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)（圖2）。

圖2 駐極體作用于瘢痕成纖維細(xì)胞48 h 后的流式細(xì)胞圖 （n=3）。

2.5 駐極體對(duì)瘢痕細(xì)胞遷移率的影響

與對(duì)照組比較，不同極性的5 000 V 組駐極體作用于瘢痕成纖維細(xì)胞較短時(shí)間內(nèi)（12 h）后，細(xì)胞遷移程度比較有限，細(xì)胞遷移數(shù)目均較對(duì)照組減少。而-5 000 V 組駐極體作用12 h，其抑制瘢痕成纖維細(xì)胞定向遷移的效果比較明顯（圖3），說(shuō)明在短時(shí)間內(nèi)（12 h）負(fù)極性駐極體對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞的遷移有更強(qiáng)的抑制作用。

圖3 駐極體作用各組瘢痕細(xì)胞12 h 后細(xì)胞遷移的變化（n=3）。

3 討論

本研究從駐極體作用于瘢痕成纖維細(xì)胞的不同時(shí)間點(diǎn)展開(kāi)，分別利用不同測(cè)量手段和方法從不同角度研究其作用機(jī)制。結(jié)果顯示：具有良好電荷儲(chǔ)存性能的正、負(fù)5 000 V 聚丙烯駐極體所提供的靜電場(chǎng)，在傷口形成的較短時(shí)間內(nèi)，有調(diào)控瘢痕細(xì)胞增殖的作用，但較長(zhǎng)時(shí)間（4～6 周）的研究數(shù)據(jù)表明，不同極性的 5 000 V 駐極體均具有抑制瘢痕成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。此結(jié)果表明兩者在作用期間的具體機(jī)制方面可能略有不同。

-5 000 V組駐極體在12～48 h作用時(shí)間內(nèi)，可以在G1期促進(jìn)遺傳物質(zhì)的復(fù)制，使細(xì)胞增殖率增加，但在S期則抑制DNA的過(guò)度合成，推測(cè)其可能使DNA合成減少或者使細(xì)胞DNA縮短停留在S期的時(shí)間，快速進(jìn)入G2期，這與以前的研究結(jié)果有相似之處[14]。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示負(fù)極性駐極體具有更強(qiáng)地抑制瘢痕成纖維細(xì)胞遷移的能力，推測(cè)這不僅與上述促進(jìn)蛋白等物質(zhì)的合成有關(guān)，可能也與其電荷極性的調(diào)控有關(guān)[15-17]。電生理學(xué)研究表明細(xì)胞膜的電荷情況為內(nèi)負(fù)外正，負(fù)極性駐極體由于其極性與細(xì)胞膜外電荷異性，為細(xì)胞遷移提供了方向[18]。但負(fù)極性駐極體與活細(xì)胞作用后的不同時(shí)間段，兩者的相互作用隨著傷口組織的變化而產(chǎn)生不同的效果，瘢痕成纖維細(xì)胞在負(fù)極性駐極體作用4～7周的長(zhǎng)時(shí)間調(diào)控作用下，負(fù)極性駐極體顯示出強(qiáng)大的調(diào)控性，瘢痕增生減少，抑制瘢痕生長(zhǎng)。

5 000 V 駐極體在細(xì)胞增殖指數(shù)與增殖率方面與相同表面電位的負(fù)極性駐極體具有類似表現(xiàn)，而細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示正、負(fù)極性駐極體對(duì)細(xì)胞周期的作用存在差異。5 000 V 駐極體在G1 期促進(jìn)蛋白等遺傳物質(zhì)的復(fù)制后，同樣具有抑制DNA 過(guò)度合成的作用，但在G2 期的細(xì)胞數(shù)量較S 期并沒(méi)有顯著增加，推測(cè)其可能并不是通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞周期快速度過(guò)S 期進(jìn)入G2 期起作用，僅是通過(guò)正極性靜電場(chǎng)單純抑制DNA 的合成。

綜上所述，當(dāng)細(xì)胞處于外靜電場(chǎng)環(huán)境下，靜電場(chǎng)作為外源刺激因子將引起瘢痕成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)與遷移過(guò)程發(fā)生變化，且隨著駐極體作用時(shí)間的不同，正、負(fù)極性駐極體對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞的調(diào)控作用不同，正、負(fù)極性駐極體對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞的細(xì)胞周期影響也略有不同。兩種不同極性的駐極體有望分別應(yīng)用于不同時(shí)期的瘢痕生長(zhǎng)過(guò)程，最終抑制病理性瘢痕增生。