王秋宇 朱軍義 許 靜 郭 哲 孫慧霞 姜 平

（南陽市中心醫(yī)院 南陽 473000）

子宮內(nèi)膜癌是雌性激素及非雄性激素誘導(dǎo)的疾病。以往研究顯示，人體子宮內(nèi)膜屬于動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)的組織，當(dāng)發(fā)病癌變時(shí)，癌細(xì)胞能夠快速侵襲周旁組織，產(chǎn)生新腫瘤病灶[1]。子宮內(nèi)膜癌具體的發(fā)病機(jī)制仍不清楚，尋找致癌基因及有效靶向治療方法對(duì)于揭示子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展具有重要作用[2]。小核仁RNA宿主基因15（small nucleolar RNA host gene 15，lncRNA SNHG15）屬于lncRNA，位于人體染色體7p13，包含百余個(gè)轉(zhuǎn)錄本，在胃癌、肺癌等惡性腫瘤中表達(dá)顯著升高，通過調(diào)節(jié)多種信號(hào)通路介導(dǎo)細(xì)胞遷移等生物活性[3]。去集蛋白-金屬蛋白酶17（adisintegrin and metalloproteinase 17，ADAM17）是近年新發(fā)現(xiàn)的多功能的的表面糖蛋白，通過EGFR-PI3K-Akt 途徑促進(jìn)癌細(xì)胞增殖及遷移[4]。LncRNA SNHG15 在子宮內(nèi)膜癌中研究機(jī)制暫無報(bào)道。本研究探討lncRNA SNHG15 對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的作用及對(duì)ADAM17 基因的影響。

1 材料和方法

1.1 子宮內(nèi)膜癌組織樣本收集

選擇2018年12月～2019年12月南陽市中心醫(yī)院通過病理確診，經(jīng)外科手術(shù)的12 例子宮內(nèi)膜癌患者組織及癌旁3 cm 的正常組織?；颊咄饪剖中g(shù)前均未接受化學(xué)治療，組織存于液氮中保存。本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)規(guī)定，并取得患者同意。

1.2 PCR 檢測(cè)子宮內(nèi)膜癌組織中及細(xì)胞中l(wèi)ncRNA SNHG15 水平

利用TRIzol 法檢測(cè)子宮內(nèi)膜癌組織及癌旁組織和細(xì)胞中總RNA，利用PrimeScript cDNA 轉(zhuǎn)錄合成cDNA，獲得反體系，進(jìn)行熒光定量PCR 反應(yīng)，以GAPDH 為內(nèi)參，根據(jù)Ct 值計(jì)算子宮內(nèi)膜癌組織 中l(wèi)ncRNA SNHG15 水 平，lncRNA SNHG15 上游引物序列為5'-CCTAGTGAGGAGTGGAGCTG A-3'，下游引物序列為5'-CTCATTCTGGAAGCAG AGAACC-3'；內(nèi)參GAPDH 上游引物序列為5'-GTC GGTGTGAACGGATTTG-3'，下游引物序列為5'-AAGATGGTGATGGGCTTCC-3'，用2-△△Ct法計(jì)量表達(dá)量。

1.3 細(xì)胞株、主要試劑

Ishikawa細(xì)胞及RPMI1640培養(yǎng)基（上海一基實(shí)業(yè)）；Lipofectamine 2000 （美國(guó) Thermofisher 公司）；lncRNA SNHG15-siRNA及對(duì)照物NC-siRNA（上海吉瑪生物）；兔抗人ADAM17多克隆抗體（北京來福賽思科技生物）；CCK-8（上?；鄯f生物科技）。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

將低溫冷藏的Ishikawa 細(xì)胞，快速移入37℃水中溶解，離心后，離棄上清液，加入培養(yǎng)基，5%CO237.5℃培養(yǎng)，貼壁生長(zhǎng)，1～2 d 更換新的培養(yǎng)液。細(xì)胞生長(zhǎng)到90%時(shí)，加入蛋白液消化，傳代保存，以備后用。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組

將5×103個(gè)的細(xì)胞平鋪到16 孔板中，按照Lipofectamine 2000 說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分別將lncRNA SNHG15-siRNA 及NC-siRNA 轉(zhuǎn)染到Ishikawa 細(xì)胞中，37.5 ℃，5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)。分為EC 組、NC 組及實(shí)驗(yàn)組，EC 組為無干預(yù)的Ishikawa 細(xì)胞，NC 組為Ishikawa 細(xì)胞轉(zhuǎn)染lncRNA SNHG15si-NC，實(shí)驗(yàn)組為Ishikawa 細(xì)胞轉(zhuǎn)染lncRNA SNHG15-siRNA。將數(shù)量為1×104個(gè) 的Ishikawa 細(xì)胞接種到96 孔中，15 h 后，待Ishikawa細(xì)胞重復(fù)融合，在EP 管中放入200 μL 轉(zhuǎn)染液體和4 μL 脂質(zhì)體，后加入5 μg 的lncRNA SNHG15-siRNA，充分混合后，轉(zhuǎn)染9 h 后，用含血清、雙抗的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.6 CCK-8 檢測(cè)Ishikawa 細(xì)胞活力

各組Ishikawa 細(xì)胞加入蛋白酶消化，按照數(shù)量5×103接種到96 孔板中，每孔200 μL，置于37.5℃，5%CO2培養(yǎng)，每組設(shè)置6 孔，培養(yǎng)0、24、48 h 及72 h 后，加入100 μL 10%的CCK-8 培養(yǎng)基，37.5℃，5%CO2下培養(yǎng)3 h，酶標(biāo)儀450 nm 下計(jì)算細(xì)胞活力，計(jì)算公式細(xì)胞活力（%）=實(shí)驗(yàn)組450 nm 吸光度/對(duì)照組450 nm 吸光度×100%.

1.7 Transwell 小室檢測(cè)Ishikawa 細(xì)胞侵襲能力

50 mg/L 的基質(zhì)膠稀釋后加入小室上層，37℃下呈凝膠狀態(tài)，Ishikawa 細(xì)胞數(shù)目為1×105/mL，上室中加入細(xì)胞懸液，下室中加入少量胎牛血清培養(yǎng)基，拭去殘留細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫染色，計(jì)算Ishikawa 細(xì)胞侵襲的數(shù)量。

1.8 流式細(xì)胞儀檢測(cè)Ishikawa 細(xì)胞凋亡

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的Ishikawa 細(xì)胞加入PBS 溶液中，予以洗滌，再離心，5 min，運(yùn)用100 μL 結(jié)合緩沖液，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行重懸，用 5 μL 標(biāo)記FITC 的Annexin Ⅴ與5 μL PI 染色混勻，無光條件下，孵育15 min 后注入400 μL 結(jié)合緩沖液混勻，予以洗滌，次數(shù)3 次，記錄細(xì)胞凋亡情況。

1.9 免疫印跡檢測(cè)兔抗人ADAMl7 蛋白水平

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)Ishikawa 細(xì)胞，胰蛋白酶消化，高速離心后，保留血清樣本。進(jìn)行電泳，PVDF 膜TBS 浸泡10 min，反復(fù)PBS 沖洗，每次5 min，分別加入兔抗人單克隆抗體兔抗人ADAM17、GAPDH 抗體（1∶500 ）、過氧化物酶標(biāo)記二抗（1∶2 000），分別雜交，PBS 沖洗。后將膜浸入ECL 工作液，隨后進(jìn)行檢測(cè)，獲取圖像。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 23.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，子宮內(nèi)膜癌組織及癌旁組織中l(wèi)ncRNA SNHG15 水平，Ishikawa 細(xì)胞活性、凋亡、侵襲及ADAM17 蛋白水平指標(biāo)結(jié)果采用±s表示，組間比較用t檢驗(yàn)，3 組間比較采用方差分析，P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 子宮內(nèi)膜癌組織及癌旁組織中l(wèi)ncRNA SNHG15水平

lncRNA SNHG15 在子宮內(nèi)膜癌癌旁組織和癌組織的表達(dá)量分別為1.00±0.06、2.15±0.23，在子宮內(nèi)膜癌組織中水平顯著高于癌旁組織（P<0.05）。

2.2 各組Ishikawa 中l(wèi)ncRNA SNHG15 水平

EC 組、NC 組及實(shí)驗(yàn)組中l(wèi)ncRNA SNHG15 水平分別為1.00±0.00、0.98±0.03 和0.52±0.09，實(shí)驗(yàn)組中l(wèi)ncRNA SNHG15 顯著低于EC 組和NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說明轉(zhuǎn)染成功。

2.3 各組Ishikawa 細(xì)胞活力

CCK-8 檢測(cè)結(jié)果顯示，0、24、48、72 h 時(shí)，EC 組及NC 組Ishikawa 細(xì)胞活力OD 值比較均無差異（P>0.05）；24、48、72 h 時(shí)，實(shí)驗(yàn)組與EC 組相比，Ishikawa 細(xì)胞活力OD 值明顯降低（P<0.05），表明敲低lncRNA SNHG15 能夠抑制Ishikawa 細(xì)胞活力（表1）。

表1 各組Ishikawa 細(xì)胞活力OD 值（±s）

表1 各組Ishikawa 細(xì)胞活力OD 值（±s）

*P<0.05 vs EC 組；#P<0.05 vs NC 組

組別 0 h 24 h 48 h 72 h EC 組 0.500±0.06 0.889±0.100 1.204±0.200 1.673±0.160 NC 組 0.497±0.08 0.880±0.012 1.150±0.220 1.650±0.180實(shí)驗(yàn)組 0.503±0.04 0.614±0.070*# 0.771±0.090*# 0.997±0.150*#

2.4 各組Ishikawa 細(xì)胞侵襲數(shù)目

Transwell 小室檢測(cè)結(jié)果顯示，EC 組，NC 組及實(shí)驗(yàn)組Ishikawa 細(xì)胞侵襲數(shù)分別為（79.67±8.79）個(gè)，（76.02±9.30）個(gè)及（33.26±4.30）個(gè)，3 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），EC 組與NC 組侵襲數(shù)相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），實(shí)驗(yàn)組Ishikawa 細(xì)胞侵襲數(shù)目低于EC 組及NC 組（P<0.05）（圖1）。

圖1 各組Ishikawa 細(xì)胞侵襲數(shù)目。A：EC 組；B：NC 組；C：實(shí)驗(yàn)組.

2.5 Ishikawa 細(xì)胞凋亡率

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，EC 組、NC 組及實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率分別（5.32±1.23）%、（6.21±1.15）%及（19.06±2.40）%，3 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），EC 組與NC 組細(xì)胞凋亡率相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），實(shí)驗(yàn)組Ishikawa 細(xì)胞凋亡率高于EC 組及NC 組（P<0.05）（圖2）。

圖2 各組Ishikawa 細(xì)胞凋亡率。A：EC 組；B：NC 組；C：實(shí)驗(yàn)組.

2.6 ADAM17 蛋白表達(dá)量

免疫印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，EC 組、NC 組及實(shí)驗(yàn)組子宮內(nèi)膜癌中ADAM17 蛋白表達(dá)水平分別為1.00±0.12、0.97±0.15 及0.47±0.08，3 組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），EC 組與NC 組ADAM17 蛋白表達(dá)相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），實(shí)驗(yàn)組ADAM17 蛋白表達(dá)低于EC 組及NC組（P<0.05）（圖3）。

圖3 各組ADAM17 蛋白電泳圖

3 討論

LncRNA 是由聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的長(zhǎng)鏈非編碼RNA，無翻譯蛋白質(zhì)作用，但對(duì)蛋白質(zhì)翻譯后修飾等作用具有影響。隨著基因工程技術(shù)的問世，發(fā)現(xiàn)LncRNA 與多種疾病病理改變具有相關(guān)性[6-7]。lncRNA SNHG15 屬于lncRNA 其中之一，以往研究表明能夠?qū)δz質(zhì)瘤及甲狀腺癌細(xì)胞具有加快增殖的作用，但是對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的影響暫未見文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究通過體外培養(yǎng)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染lncRNA SNHG15-siRNA 觀察其細(xì)胞活性，并探討其發(fā)生機(jī)制。

本研究通過收集本院外科手術(shù)切除子宮內(nèi)膜癌組織及癌旁組織，通過PCR 檢測(cè)顯示，在子宮內(nèi)膜癌組織中l(wèi)ncRNA SNHG15 表達(dá)顯著高于癌旁組織，說明lncRNA SNHG15 表達(dá)升高與子宮內(nèi)膜癌患者癌細(xì)胞發(fā)生侵襲及轉(zhuǎn)移相關(guān)。LncRNA SNHG15 是一個(gè)被公認(rèn)的lncRNA，染色體體7p13，包含837bp 轉(zhuǎn)錄本，是多種惡性腫瘤中潛在的分子標(biāo)志物[9]。LncRNA SNHG15 在不同惡性腫瘤中發(fā)揮的作用存在差異，其產(chǎn)生與多因素、多基因及多通路相關(guān)[10]。LncRNA SNHG15 具有調(diào)節(jié)癌細(xì)胞生長(zhǎng)及凋亡的能力[11]。在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染lncRNA SNHG15 模擬物能夠通過抑制miR-153 加快細(xì)胞遷移，當(dāng)敲低lncRNA SNHG15 后miR-153水平升高，表示lncRNA SNHG15 能夠增加膠質(zhì)瘤細(xì)胞活性與特異性結(jié)合血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）因子相關(guān)，加快腫瘤血管生長(zhǎng)，惡化病情。在結(jié)腸癌細(xì)胞中敲低lncRNA SNHG15 能夠加快線粒體凋亡途徑，增加胃癌細(xì)胞凋亡的同時(shí)，具有抑制炎癥因子等作用[12]。在EC 中敲低lncRNA SNHG15，細(xì)胞增殖能力減弱，凋亡加劇，結(jié)果提示lncRNA SNHG15 與EC 增殖及侵襲密不可分，能夠通過多種信號(hào)調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜癌基因。

ADAM17 是ADAM 超家族成員之一，位于人體染色體2p25，由824 個(gè)氨基酸組成，主要以非活化酶原形式存在，當(dāng)受到外界刺激時(shí)，能夠產(chǎn)生EGFR 配體，通過生長(zhǎng)因子介導(dǎo)EGFR 水平升高，發(fā)揮介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞惡性侵襲、腫瘤血管生成等作用[13-14]。子宮內(nèi)膜癌侵襲生理活動(dòng)較強(qiáng)，可以發(fā)生腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其中腫瘤細(xì)胞粘連、基質(zhì)內(nèi)增殖等貫穿了整個(gè)侵襲的過程。ADAM 與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系已有眾多文獻(xiàn)，但是與子宮內(nèi)膜癌之間的關(guān)系研究較少。子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制首先是癌細(xì)胞之間黏附能力降低，減少接觸性抑制，后發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，ADAM17 在其中發(fā)揮重要作用，腫瘤細(xì)胞生成的重要基礎(chǔ)物質(zhì)例如血管生成因子等均是ADAM17 重要底物，ADAM17 能夠減除細(xì)胞間的黏性作用，為子宮內(nèi)膜癌發(fā)展發(fā)揮促進(jìn)作用[15]。楊潔玉[16]研究表示，在EC 組織中ADAM17 呈現(xiàn)強(qiáng)陽性表達(dá)，顯著高于子宮內(nèi)膜增生組織中ADAM17的水平，顯示其水平高低能夠直接反映子宮內(nèi)膜癌病理分期及是否發(fā)生肌層浸潤(rùn)等[17]。本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組EC通過敲低lncRNA SNHG15后免疫印跡檢測(cè)ADAM17水平顯著低于NC組及內(nèi)膜癌組，說明敲低lncRNA SNHG15能夠抑制ADAM17表達(dá)，其機(jī)制可能在于抑制lncRNA SNHG15表達(dá)水平能夠降低子宮內(nèi)膜癌血管生成，減少VEGF水平，間接抑制ADAM17活性[18]。在以往研究中[7]，肝癌細(xì)胞的ADAM17能夠誘導(dǎo)TNF-α介導(dǎo)VEGF水平升高，活性肝癌細(xì)胞活性，加快侵襲，惡化病情，敲低lncRNA SNHG15水平能夠下調(diào)VEGF，從而改善腫瘤發(fā)生發(fā)展。LncRNA SNHG15降低后能夠改變子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生物活性的機(jī)制也可能與調(diào)節(jié)線粒體信號(hào)通路相關(guān)，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)si-lncRNA SNHG15可下調(diào)Bcl-2和caspase-3表達(dá)水平，上調(diào)Bax、c-caspase3和Cyt-C表達(dá)水平，而同時(shí)抑制lncRNA SNHG15和miR-153表達(dá)可減弱抑制lncRNA SNHG15對(duì)Bcl-2、caspase-3、Bax、c-caspase3和Cyt-C 表達(dá)影響，提示lncRNA SNHG15調(diào)控miR-153對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡影響可能是通過線粒體途徑實(shí)現(xiàn)的[19]。

本研究也有一定的不足，由于成本、時(shí)間等問題，未進(jìn)行RNA 測(cè)序及生物信息學(xué)分析ADAM17包含的主要信號(hào)通路，可能產(chǎn)生的結(jié)果有一定偏差，存在局限性，在今后的研究中應(yīng)加入更多的實(shí)驗(yàn)方法為子宮內(nèi)膜癌的治療提供更有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。綜上所述，敲低lncRNA SNHG15 能夠抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖及侵襲，凋亡加劇，作用機(jī)制可能與降低ADAM17 水平相關(guān)。