陳銳澤 綜述，張 勇 審校

1.廈門醫(yī)學院臨床醫(yī)學系，福建廈門 361023；2.機能與臨床轉(zhuǎn)化福建省高校重點實驗室，福建廈門 361023

胃癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，目前其發(fā)病率在人體惡性腫瘤中排名第五，死亡率更是高居第三[1]。由于缺乏特異性的早期檢測手段，絕大多數(shù)患者確診時往往因病情惡化、延誤治療而喪失生命。絕大多數(shù)患者由于胃癌早期癥狀輕微而未重視，當身體出現(xiàn)明顯不適時才就診，此時多已發(fā)展至進展期胃癌，從而延誤最佳治療時機。據(jù)腫瘤數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示，早期胃癌患者5年生存率可達91%，隨著病情進展，腫瘤細胞侵襲至更深層組織時(如漿膜層、肌層)，患者5年生存率則降至26%[2]。當前，臨床胃癌診斷仍主要依賴于侵入性內(nèi)鏡檢查和病理活檢[3]。利用侵入性內(nèi)鏡能直觀地發(fā)現(xiàn)并評估病灶且相對無創(chuàng)，但成本及操作要求較高，同時也存在諸多禁忌證，且在孕婦、老年人等特殊群體中依從性不高且易發(fā)生并發(fā)癥，因此無法作為胃癌早期篩查的有效手段。而病理活檢雖然能夠準確判斷腫瘤大小及其分化程度，但無法較好評估患者整體病情發(fā)展狀況，再者活檢為有創(chuàng)檢查，容易出現(xiàn)并發(fā)癥，很難作為人群胃癌早期篩查的手段。這些檢測手段的局限性給早期胃癌的診斷造成不少困擾。近年來，血清腫瘤標志物的檢測廣泛應(yīng)用到臨床，通過檢測血清中相關(guān)腫瘤標志物如癌胚抗原(CEA)、糖類抗原(CA)125、CA19-9，可對部分惡性腫瘤進行篩查[4]，但由于胃癌缺乏特異性標志物，所以該技術(shù)在早期胃癌診斷中仍存在局限性。

CHEN等[5]研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)消化道腫瘤患者血漿中的脫落循環(huán)腫瘤細胞DNA(ctDNA)具有特異的甲基化水平，能夠及時且高效地對胃癌、結(jié)直腸癌等多種消化系統(tǒng)常見腫瘤進行早期診斷，從而極大提高癌癥患者早期生存率。同時，PHALLEN等[6]檢測結(jié)直腸癌患者的血漿發(fā)現(xiàn)，患者血漿中ctDNA水平明顯高于健康個體，因此對血漿中ctDNA進行分析可能有利于識別腫瘤相關(guān)特異性改變[6]。隨著對表觀遺傳學研究的不斷深入，人們在胃癌細胞中也能檢測到DNA異常甲基化，部分調(diào)控細胞基因啟動子區(qū)異常高甲基化可導致細胞中的抑癌基因失活[7]，從而導致細胞異常生長，而這對早期胃癌的診斷和預后意義重大。通過檢測體內(nèi)特異性基因異常甲基化程度有望成為一種胃癌早期無創(chuàng)性的檢測手段，從而較大程度提高胃癌患者早期檢出率。本文擬就當前DNA甲基化水平檢測在胃癌早期診斷中的研究進展進行綜述，以期為尋找胃癌早期診斷分子標志物提供新思路。

1 DNA甲基化概述

DNA甲基化指甲基基團在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)的催化作用下添加至胞嘧啶第5號碳的殘基上的修飾過程[8]，該過程多發(fā)生于富含胞嘧啶和尿嘧啶的CpG島(即具有高密度胞嘧啶-鳥嘌呤2種核苷酸的DNA區(qū)域)中。DNA甲基化是細胞生長發(fā)育過程重要的調(diào)控機制。有研究表明，DNA異常甲基化與多種惡性腫瘤的發(fā)生之間關(guān)系密切，尤其與細胞分裂相關(guān)的原癌基因、抑癌基因和DNA損傷修復基因[7]。DNA異常甲基化即抑癌基因啟動子區(qū)的高甲基化及原癌基因廣泛區(qū)域的低甲基化，其中高甲基化多發(fā)生于抑癌基因的5′端啟動子區(qū)域的CpG島上[9]，該區(qū)域上累積的高水平甲基胞嘧啶使抑癌基因失活，或致使調(diào)控細胞周期機制的相關(guān)蛋白如p27表達下調(diào)，從而導致細胞過度生長[10]；而低甲基化多發(fā)生于全基因組的原癌基因區(qū)域[11]，大量的原癌基因低甲基化導致原本應(yīng)當沉默的基因被異常激活，從而增加DNA信息傳遞過程中的不穩(wěn)定性，加速腫瘤的演進。通常DNA低甲基化與抑癌基因高甲基化往往是相伴發(fā)生的，只是發(fā)生區(qū)域有所不同。目前對人類Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子-3(RUNX3)基因、hMLH1基因、RASSF1A基因和SEPTIN9基因的高甲基化與胃癌的發(fā)生機制研究較多。

2 DNA高甲基化與胃癌發(fā)生的相關(guān)機制

DNA異常甲基化可能與腫瘤細胞的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和侵襲關(guān)系密切[12]。正常機體內(nèi)的各種細胞新陳代謝受多種基因共同調(diào)控，其中與腫瘤細胞密切相關(guān)的包括原癌基因和抑癌基因。后者在細胞周期、DNA損傷修復、細胞分化等過程中均起到重要作用。體內(nèi)DNA異常甲基化主要發(fā)生在富含CpG島的啟動子區(qū)域，該區(qū)域的異常高甲基化會阻礙轉(zhuǎn)錄因子與啟動子結(jié)合，從而使抑癌基因無法轉(zhuǎn)錄或者轉(zhuǎn)錄水平降低。抑癌基因的沉默易導致胃癌細胞生長分裂不受控制，甚至使腫瘤細胞有更多機會脫離原位細胞基質(zhì)侵襲擴散至外周，從而促進胃癌的進一步發(fā)展[12]。

3 胃癌中幾種常見異常甲基化的基因

3.1RUNX3基因 RUNX3基因主要位于人染色體1p36.11，其表達的RUNX3蛋白是轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)信號轉(zhuǎn)導通路中Runt轉(zhuǎn)錄因子的重要組成部分[13]，同時RUNX3蛋白也是重要的腫瘤抑制因子[14]，其在細胞分化、細胞周期調(diào)控、細胞凋亡和惡性轉(zhuǎn)移過程中意義重大。有研究表明，RUNX3蛋白能夠調(diào)節(jié)胃黏膜上皮細胞的增殖和凋亡過程[15]，抑制正常胃組織細胞過度生長。而RUNX3基因啟動子區(qū)域高甲基化會導致該蛋白表達下降，同時降低TGF-β信號轉(zhuǎn)導通路敏感性。LU等[16]對胃癌患者血清中游離RUNX3基因啟動子區(qū)DNA甲基化程度檢測發(fā)現(xiàn)，該基因在胃癌細胞血清中的甲基化水平高達75.2%。HU等[17]對比正常胃上皮組織與胃腫瘤組織發(fā)現(xiàn)，RUNX3基因啟動子區(qū)域甲基化程度與胃腫瘤細胞侵襲深度呈正相關(guān)。因此，RUNX3基因有望成為胃癌早期診斷的重要標志物[18]。

3.2hMLH1基因 hMLH1基因位于人染色體3q21-23，是人類DNA修復基因中的重要成員[19]，它能夠編碼DNA錯配修復酶，從而調(diào)控細胞內(nèi)源性修復功能，維持基因組的穩(wěn)定性。同時，當機體DNA大量損傷時，hMLH1基因編碼的修復酶能夠進一步被激活，修復錯配的堿基對，防止DNA損傷的累積，從而抑制癌細胞的發(fā)展。有研究表明，hMLH1基因啟動子區(qū)異常高甲基化是正常胃黏膜細胞發(fā)生微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)現(xiàn)象，甚至發(fā)展為胃癌的重要因素[20]。因此，檢測標本中hMLH1基因甲基化程度對胃癌早期診斷有重要意義。WANI等[21]研究發(fā)現(xiàn)，hMLH1基因在胃癌中的甲基化率為72.9%，同時YE 等[22]對2 182例胃癌病例及對照組進行Meta分析發(fā)現(xiàn)，胃癌組織或血清中hMLH1基因啟動子異常甲基化與胃癌發(fā)生呈正相關(guān)，且在腫瘤中晚期(發(fā)展至淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)表達明顯下調(diào)，表明hMLH1基因啟動子甲基化常發(fā)生在胃癌的發(fā)展階段，且隨著胃癌由癌前病變到腫瘤的發(fā)展過程中甲基化程度不斷升高。因此，hMLH1基因甲基化程度或可作為胃癌診斷的指標之一。

3.3RASSF1A基因 RASSF1A基因?qū)儆趓as家族的重要組成部分，其主要通過抑制細胞周期蛋白D1從而引起細胞周期阻滯，限制細胞無限制地分裂生長[23]。以胃癌為主的原發(fā)性腫瘤細胞中常能夠捕捉到RASSF1A基因的高甲基化[24]，而在腸化生、胃腺瘤等其他胃疾病中均未發(fā)現(xiàn)其異常甲基化的發(fā)生。對比不同腫瘤TNM分期患者胃癌細胞RASSF1A甲基化程度發(fā)現(xiàn)，Ⅲ和Ⅳ期胃癌患者胃癌細胞甲基化頻率明顯高于Ⅰ和Ⅱ期胃癌患者胃癌細胞[25]，因此RASSF1A基因甲基化程度可能與胃癌分期聯(lián)系密切，可作為胃癌診斷及治療效果的監(jiān)測指標之一。

3.4SEPTIN9基因 SEPTIN基因可分為13種亞型，其中位于17q25.3的SEPTIN9基因與多種原發(fā)性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。腫瘤細胞SEPTIN9基因5′端的CpG島多可檢測出異常高甲基化[26]。由SEPTIN9基因表達的SEPTIN9蛋白能調(diào)控細胞生長，防止其生長過快或不受控制性生長。而當SEPTIN9基因啟動子區(qū)因高水平甲基化而沉默時，基因表達停止，正常細胞便不斷向腫瘤細胞方向發(fā)展。SEPTIN9基因高甲基化的檢測已應(yīng)用于結(jié)直腸癌的早期篩查、診斷、病理分期乃至術(shù)后預后判斷中[27]。有研究發(fā)現(xiàn)，胃癌的發(fā)生與SEPTIN9基因聯(lián)系密切，這可能與SEPTIN9蛋白參與胃癌發(fā)展中的MSI現(xiàn)象密切相關(guān)[26]。隨著對該基因與胃癌關(guān)系更深入的研究，SEPTIN9基因有望成為胃癌早期診斷的指標之一。

4 DNA甲基化水平檢測技術(shù)的進展

4.1甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(MSP) MSP是傳統(tǒng)的DNA甲基化水平檢測技術(shù)，其針對特定甲基化位點兩端設(shè)計引物，以亞硫酸鹽化的待測樣品為模板(亞硫酸化可將未甲基化的胞嘧啶可轉(zhuǎn)化為尿嘧啶)，利用實時定量PCR技術(shù)，實現(xiàn)待測標本甲基化水平的定量分析。由于DNA異常甲基化在腫瘤細胞中常有發(fā)生[28]，因此MSP在腫瘤監(jiān)測中簡便快捷，靈敏度較高。但由于定量PCR技術(shù)依賴于標準曲線進行絕對定量，因此要求所測基因需要有標準品。這給甲基化水平檢測造成了一定的局限性。

4.2數(shù)字PCR(dPCR) dPCR技術(shù)能夠?qū)吮揪鶆蚍指艉箅S機分配至不同腔室內(nèi)進行檢測，依據(jù)泊松分布的原理實現(xiàn)檢測結(jié)果絕對定量[29]。dPCR能夠不依賴標準品實現(xiàn)甲基化水平檢測結(jié)果的絕對定量。同時，dPCR能夠極大地提高DNA甲基化水平檢測的特異度和靈敏度。但是，dPCR局限于測定DNA上單一位點的甲基化水平，不能實現(xiàn)高通量的多位點甲基化水平測定。

4.3二代測序(NGS) NGS主要依據(jù)DNA測序技術(shù)能夠檢測標本中的DNA片段的序列及其含量，具有極高的檢測通量及靈敏度。對標本進行亞硫酸鹽處理后能夠?qū)崿F(xiàn)特定基因的甲基化水平檢測。該技術(shù)能有效克服待測標本DNA含量少、檢測位點單一等問題，實現(xiàn)甲基化水平檢測微量化、高通量化，壓縮了檢測時間。此外，隨著基于分子條形碼(UMI)超深度NGS(即針對不同標本加入特異性堿基序列，從而分辨識別假陽性標本)的發(fā)展，NGS檢驗的靈敏度和特異度也在不斷提高[30]。然而，該方法成本高昂，不適宜大規(guī)模推廣[31]。

5 小結(jié)與展望

隨著對表觀遺傳學的深入探討，越來越多的研究支持人體內(nèi)DNA異常甲基化與胃癌的發(fā)生關(guān)系密切。然而，異常甲基化導致胃癌的機制尚未完全闡明，仍需要大量的隨機對照研究來佐證。此外，DNA異常甲基化與不同腫瘤發(fā)生之間也存在非特異性和不統(tǒng)一性。因此，胃癌的早期診斷仍需更高特異度的DNA異常甲基化水平模型支持輔助診斷。加強對胃癌DNA異常甲基化位點的研究，更深入研究特異性分子標志物在胃癌發(fā)生中的機制意義重大。此外，DNA甲基化水平檢測缺少同時具備高特異度和靈敏度的分析方法，MSP、dPCR及NGS法檢測基因甲基化水平各有短板，深入探索更多特定甲基化位點，定制胃癌特異性DNA甲基化水平檢測基因芯片或有望克服現(xiàn)階段的弊端。同時，DNA異常甲基化水平的檢測不僅對胃癌早期診斷有幫助，在相關(guān)腫瘤的治療、預后判斷中也發(fā)揮重要作用[26]。目前，SEPTIN9基因異常甲基化水平已運用于判斷結(jié)直腸癌治療的預后[27]。因此，進一步闡明DNA異常甲基化在胃癌中的機制，探索特異性的分子標志物不僅能提高胃癌的早期診斷率，還能夠輔助判斷癌癥進展，為臨床治療提供更多幫助。