李芳瑜,劉曉輝,崔 舜

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院風(fēng)濕科,武漢 430022

骨骼與免疫系統(tǒng)兩者之間互相聯(lián)系又相互作用,共享許多調(diào)節(jié)分子,這種關(guān)系近年稱之為骨免疫學(xué)[1]。由成骨細(xì)胞分泌的核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL),也稱腫瘤壞死因子相關(guān)激活誘導(dǎo)細(xì)胞因子(TNF-related activation-induced cytokine,TRANCE),屬于腫瘤壞死因子超級家族成員,可介導(dǎo)破骨細(xì)胞形成,激活成熟破骨細(xì)胞,促進(jìn)骨吸收[2]。RANKL是明確連接這兩個(gè)系統(tǒng)的最重要的細(xì)胞因子之一,越來越多的證據(jù)表明RANKL在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮多種作用,包括淋巴結(jié)發(fā)育和胸腺上皮細(xì)胞分化[1]。由免疫系統(tǒng)分泌的促炎細(xì)胞因子,如白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、IL-6、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)可以增強(qiáng)破骨細(xì)胞的活性,促進(jìn)骨吸收[3]。補(bǔ)體系統(tǒng)是固有免疫系統(tǒng)的重要成分,與骨骼系統(tǒng)也有著緊密的聯(lián)系,補(bǔ)體C3、C5、補(bǔ)體受體C3aR、C5aR以及膜結(jié)合調(diào)節(jié)蛋白CD46、CD55、CD59在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、成骨細(xì)胞以及破骨細(xì)胞等中均有表達(dá)[4]。

在骨代謝過程中,通過成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成與破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收來維持骨骼礦化平衡及自身結(jié)構(gòu)的完整,此過程即骨重塑(bone remodeling)[5-6]。在骨重塑中,破骨細(xì)胞所介導(dǎo)的骨吸收需要由成骨細(xì)胞進(jìn)行填補(bǔ)以維持骨質(zhì)、骨量和骨結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定,這一在時(shí)間和空間上協(xié)調(diào)的成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞精確平衡又稱為骨偶聯(lián)(bone coupling)[7]。骨偶聯(lián)失衡,可導(dǎo)致骨代謝性疾病,如骨質(zhì)疏松癥、骨硬化癥和炎癥性骨侵蝕[8]。研究表明,補(bǔ)體可以通過直接和間接途徑影響破骨細(xì)胞的生成與分化[9]。補(bǔ)體還可以調(diào)節(jié)炎癥環(huán)境中成骨細(xì)胞對炎癥的反應(yīng),并通過改變成骨細(xì)胞增殖分化過程中所產(chǎn)生的細(xì)胞因子影響破骨細(xì)胞的增殖[10]。本文綜述了補(bǔ)體系統(tǒng)與骨偶聯(lián)之間的作用關(guān)系,旨在揭示補(bǔ)體系統(tǒng)對骨偶聯(lián)的影響及作用機(jī)制,為骨代謝相關(guān)疾病的治療提供新思路。

1 補(bǔ)體系統(tǒng)影響骨偶聯(lián)的證實(shí)

補(bǔ)體系統(tǒng)對骨偶聯(lián)的影響,是由Stao團(tuán)隊(duì)首次證實(shí),Sato等[11]早期的研究表明,當(dāng)用1,25-(OH)2-VitD3處理小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞和原代成骨細(xì)胞時(shí),培養(yǎng)液中補(bǔ)體C3逐漸增加,并且C3可以促進(jìn)破骨細(xì)胞分化。這是首次揭示補(bǔ)體在骨代謝過程中充當(dāng)“偶聯(lián)因子”的作用,也為后期補(bǔ)體在骨偶聯(lián)中的作用機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。小鼠模型骨穩(wěn)態(tài)和骨轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)一步證實(shí)了補(bǔ)體在骨結(jié)構(gòu)中的調(diào)節(jié)作用。研究顯示,C5aR1基因敲除小鼠和C5aR2基因敲除小鼠均顯示出高骨量表型,并且伴隨著骨小梁中破骨細(xì)胞數(shù)量的減少[12]。在骨軟骨活檢中,研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)體表達(dá)于骨髓、少數(shù)軟骨下骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞中,其中補(bǔ)體C3表達(dá)最多。基因表達(dá)分析顯示補(bǔ)體在軟骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞中均有表達(dá)[13]。補(bǔ)體系統(tǒng)可以通過影響骨偶聯(lián),參與骨代謝的調(diào)控。

2 補(bǔ)體系統(tǒng)影響骨偶聯(lián)的機(jī)制

2.1 補(bǔ)體系統(tǒng)的激活

補(bǔ)體是先天免疫的主要參與者之一。補(bǔ)體系統(tǒng)的激活可以通過三種不同的途徑,即經(jīng)典途徑、替代途徑和凝集素途徑。三種激活途徑都匯聚到一條共同的途徑,導(dǎo)致產(chǎn)生相同的生物活性分子:C3b調(diào)理素促進(jìn)病原體吞噬,C3a和C5a過敏毒素誘導(dǎo)血管擴(kuò)張和吞噬細(xì)胞募集到炎癥部位,引發(fā)急性炎癥反應(yīng)。補(bǔ)體還通過產(chǎn)生促進(jìn)細(xì)菌吞噬作用的C3b調(diào)理素和形成導(dǎo)致病原體直接裂解的膜攻擊復(fù)合物(membrane attack complex,MAC)參與炎癥。因此,補(bǔ)體在急性炎癥及其消退中起著有益的作用[14]。然而,補(bǔ)體激活可能會(huì)導(dǎo)致炎癥介導(dǎo)的組織損傷,從而產(chǎn)生對組織不利的影響。由組織代謝(軟骨和滑膜)引起的補(bǔ)體通路的激活,將導(dǎo)致軟骨破壞和滑膜炎癥,與骨性疾病的放射學(xué)嚴(yán)重程度相關(guān)[15]。

2.2 補(bǔ)體對成骨細(xì)胞的影響

關(guān)于補(bǔ)體對成骨細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用,研究發(fā)現(xiàn)C5aR的m RNA在成骨分化過程中顯著上調(diào),且C3a、C5a與炎癥因子IL-1β共同刺激可顯著誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分泌IL-6和IL-8,這表明補(bǔ)體調(diào)節(jié)炎癥環(huán)境中成骨細(xì)胞對炎癥的反應(yīng)[4]。在補(bǔ)體激活骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)成骨分化實(shí)驗(yàn)中,通過誘導(dǎo)第14天茜素紅染色,發(fā)現(xiàn)C3a和C5a均以C3aR和C5aR特異性方式加速鈣化[16]。為了進(jìn)一步探究補(bǔ)體如何促進(jìn)成骨細(xì)胞分化,調(diào)節(jié)骨偶聯(lián),研究者建立了成骨細(xì)胞和成熟破骨細(xì)胞的共培養(yǎng)體系,發(fā)現(xiàn)了補(bǔ)體介導(dǎo)成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞之間的偶聯(lián)途徑。研究者首次從成熟破骨細(xì)胞的條件培養(yǎng)液(conditioned medium,CM)中純化出與補(bǔ)體C3匹配的肽,并檢測出在破骨細(xì)胞分化過程中,C3逐漸增加,且C3生物活性片段C3a可以刺激成骨細(xì)胞分化。當(dāng)破骨細(xì)胞中的C3基因表達(dá)被敲低時(shí),破骨細(xì)胞的CM不能刺激成骨細(xì)胞的分化,在存在C3aR拮抗劑的情況下,CM會(huì)抑制成骨細(xì)胞的堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的活性。體外實(shí)驗(yàn)表明,小鼠在卵巢切除術(shù)(ovariectomy,OVX)或RANKL注射的高骨轉(zhuǎn)換狀態(tài)下,骨中C3基因表達(dá)增加,然而每天使用C3aR拮抗劑阻斷C3a的作用,將導(dǎo)致骨衰減增加,骨形成減少并加劇骨質(zhì)流失[17]。這些研究均揭示,CM中的C3a可以增強(qiáng)成骨細(xì)胞ALP活性,且C3a可以介導(dǎo)骨骼高轉(zhuǎn)換模型中骨吸收與形成的偶合。

2.3 補(bǔ)體對破骨細(xì)胞的影響

補(bǔ)體對破骨細(xì)胞具有重要的調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn),將抗C3抗體添加到骨髓培養(yǎng)物中不僅抑制了破骨細(xì)胞的出現(xiàn),還抑制了單核巨噬細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞的生長,且在培養(yǎng)初期加入抗C3抗體時(shí),這種抑制作用最強(qiáng),表明補(bǔ)體C3是破骨前體細(xì)胞增殖和早期分化所必需的成分[18]。補(bǔ)體C3以及補(bǔ)體受體C3aR、C5aR基因敲除小鼠的骨髓基質(zhì)細(xì)胞,誘導(dǎo)產(chǎn)生的破骨細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞集落刺激因子均明顯減少,進(jìn)一步驗(yàn)證補(bǔ)體對破骨細(xì)胞增殖分化的重要性;同時(shí),研究發(fā)現(xiàn)在破骨細(xì)胞分化過程中,骨髓基質(zhì)細(xì)胞通過補(bǔ)體激活的替代途徑局部產(chǎn)生C3a和C5a,調(diào)控破骨細(xì)胞的分化[10]。目前,關(guān)于補(bǔ)體如何促進(jìn)破骨細(xì)胞形成,有直接和間接兩種途徑。C3a和C5a對破骨細(xì)胞生成具有直接調(diào)節(jié)作用,即在不存在M-CSF和RANKL的情況下用C3a和C5a進(jìn)行破骨細(xì)胞刺激實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)即使沒有RANKL與M-CSF,C3a、C5a也會(huì)顯著誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成[19]。此外,當(dāng)C3基因敲除小鼠的骨髓基質(zhì)細(xì)胞用1,25-(OH)2-VitD3刺激后,M-CSF表達(dá)以及RANKL/OPG的比率相對于野生小鼠降低。MCSF的表達(dá)和RANKL/OPG比率的增加是破骨細(xì)胞形成必需因素,表明補(bǔ)體通過間接作用影響破骨細(xì)胞的形成。

2.4 補(bǔ)體通過特異性受體發(fā)揮作用

補(bǔ)體受體存在于不同細(xì)胞膜表面,能與補(bǔ)體激活過程中所形成的活性片段相結(jié)合,介導(dǎo)多種生物學(xué)效應(yīng)。在骨偶聯(lián)中,補(bǔ)體可通過其特異性受體在多種骨細(xì)胞中發(fā)揮作用。體外研究顯示,破骨細(xì)胞能表達(dá)補(bǔ)體受體C3aR、C5aR1和C5aR2,還能夠通過將C5切割成其活性形式C5a來激活補(bǔ)體[4]。來源于間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨細(xì)胞,表達(dá)補(bǔ)體受體C3aR和C5aR,并且可以在其細(xì)胞表面局部產(chǎn)生C3a和C5a[20]。C3aR屬于細(xì)胞膜表面的G蛋白偶聯(lián)受體,在B細(xì)胞和T細(xì)胞上表達(dá),參與調(diào)節(jié)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。C5a/C5aR1相互作用與炎癥性疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[21]。

補(bǔ)體C3與其受體C3aR結(jié)合可以影響M-CSF以及RANKL/OPG表達(dá),補(bǔ)體C5a也可參與RANKL/RANK/OPG下游信號絲裂原活化蛋白激酶MAPK(mitogen-activated protein kinase,MAPK)的基因調(diào)節(jié)[22]。MAPK是信號從細(xì)胞表面?zhèn)鲗?dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)部的重要傳遞者,在巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞中以C5a依賴性方式激活MAPK,抑制MAPK信號,可阻斷巨噬細(xì)胞系向破骨細(xì)胞分化[23]。此外,證據(jù)顯示C5aR1可刺激中性粒細(xì)胞引起ERK1/2和MAPK通路上重要的信號分子P38磷酸化從而產(chǎn)生IL-6等細(xì)胞因子,促進(jìn)破骨細(xì)胞的生成,從而增加骨吸收[22]。

2.5 補(bǔ)體可能通過共同受體發(fā)揮作用

補(bǔ)體除了作用于自身特異性受體外,越來越多的研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)體還可以作為共同配體作用于其他細(xì)胞膜受體,如晚期糖基化終產(chǎn)物的受體RAGE(receptor for advanced glycation end products,RAGE)。RAGE是一種涉及多種慢性炎癥狀態(tài)的多配體模式識別受體,在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞均有表達(dá)[24]。RAGE及其配體,不僅在固有免疫反應(yīng)中起重要作用,對破骨細(xì)胞的分化、成熟以及骨再建也有調(diào)節(jié)作用[25-26]。補(bǔ)體活性片段C3a即為RAGE的高親和性配體之一[27]。由此推測,作為高親和配體的C3a也可能通過RAGE激活下游信號通路進(jìn)而調(diào)節(jié)骨偶聯(lián)。然而,C3a-RAGE結(jié)合效應(yīng)在機(jī)制和治療靶點(diǎn)方面仍有待進(jìn)一步探究。

綜上所述,補(bǔ)體調(diào)控骨形成信號通路中的重要信號分子,調(diào)節(jié)骨偶聯(lián)相關(guān)多種細(xì)胞因子,參與骨偶聯(lián)過程中成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的生成、分化、增殖,對維持骨骼礦化平衡和自身結(jié)構(gòu)完整發(fā)揮重要作用。

3 補(bǔ)體對骨代謝相關(guān)疾病的治療前景

早期研究已經(jīng)表明,補(bǔ)體是先天性和獲得性免疫應(yīng)答的重要組成部分,三種補(bǔ)體激活途徑中產(chǎn)生的裂解產(chǎn)物均可引起炎癥和組織破壞[28]。隨著骨免疫學(xué)領(lǐng)域的研究以及補(bǔ)體與骨骼相互作用的研究進(jìn)展,越來越多的證據(jù)顯示,補(bǔ)體在生理和病理?xiàng)l件下均可調(diào)節(jié)骨代謝,補(bǔ)體激活調(diào)節(jié)和影響多種急/慢性炎癥性疾病的發(fā)展與進(jìn)程[29-30]。因此,針對補(bǔ)體對骨生成和破壞的免疫學(xué)機(jī)制研究,不僅能夠加深我們對骨骼疾病的理解,而且為治療多種骨骼疾病提供了新思路。

3.1 補(bǔ)體治療骨質(zhì)疏松癥

骨質(zhì)疏松癥是一種嚴(yán)重影響人類健康的慢性退行性骨病,其特征是骨的微結(jié)構(gòu)破壞、骨量減低、骨的脆性增加,從而導(dǎo)致繼發(fā)性骨折風(fēng)險(xiǎn)增加。隨著對骨質(zhì)疏松癥研究的深入,骨質(zhì)疏松癥的相關(guān)治療藥物已經(jīng)從早期的骨礦物質(zhì)補(bǔ)充藥物發(fā)展到目前的調(diào)節(jié)骨偶聯(lián)的藥物。這些藥物可以抑制破骨細(xì)胞分化,減少骨吸收,改善骨微結(jié)構(gòu),增強(qiáng)骨密度,降低骨折風(fēng)險(xiǎn)[31]。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究表明,補(bǔ)體C3在卵巢切除術(shù)后參與小鼠骨內(nèi)穩(wěn)態(tài)調(diào)控,缺乏補(bǔ)體C3可減少骨質(zhì)流失,改善骨小梁微結(jié)構(gòu)及骨骼機(jī)械性能[29]。因此,基于卵巢切除術(shù)的模型,抗補(bǔ)體C3的治療可防止絕經(jīng)后的骨質(zhì)流失。

3.2 補(bǔ)體在創(chuàng)傷后骨修復(fù)中的作用

對于創(chuàng)傷后骨修復(fù),研究表明抑制補(bǔ)體過表達(dá)對減少炎癥反應(yīng)、促進(jìn)骨重塑也起著重要作用。有報(bào)道稱,在骨折愈合初期成骨細(xì)胞表達(dá)C5aR1顯著上調(diào),如在炎癥早期特異性阻斷C5aR1則可消除嚴(yán)重創(chuàng)傷對骨折愈合的負(fù)面影響[32]。然而,另一項(xiàng)研究表明,成骨細(xì)胞特異性C5aR1過度表達(dá)的小鼠中,骨折愈合受到干擾,骨含量、骨礦物質(zhì)密度和彎曲剛度顯著降低,這可能是由于破骨細(xì)胞數(shù)量顯著增加所致,表明成骨細(xì)胞中的C5aR1信號在骨折后的骨再生中起著負(fù)性作用[22]。在對補(bǔ)體過敏毒素C5a的另一受體C5aR2的研究中發(fā)現(xiàn),骨折后,C5aR1基因敲除小鼠炎癥反應(yīng)減弱,全身和肺部炎癥減少,中性粒細(xì)胞向骨折部位的募集減少;而C5aR2基因敲除小鼠的炎癥反應(yīng)增強(qiáng)。在愈合階段,C5aR1和C5aR2均可刺激破骨細(xì)胞的形成及軟骨向骨的轉(zhuǎn)化[12]。這些研究表明受體C5aR1和C5aR2在骨折后的早期免疫反應(yīng)中具有不同的作用,但二者均可影響破骨細(xì)胞分化和軟骨細(xì)胞的成骨轉(zhuǎn)化,協(xié)同參與骨折修復(fù)。這對于減少骨折后的炎癥反應(yīng),促進(jìn)骨折愈合的治療提供了新思路。目前,人們已經(jīng)開始關(guān)注破骨細(xì)胞功能調(diào)節(jié)中補(bǔ)體級聯(lián)反應(yīng)的C5a/C5aR軸,并將其作為治療骨病變的潛在治療靶標(biāo),在新合成的C5aR拮抗劑中,DF3016A可以通過抑制C5aR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄來抑制破骨細(xì)胞降解活性,對于未來臨床應(yīng)用具有重要價(jià)值[33]。

3.3 補(bǔ)體治療代謝性骨關(guān)節(jié)疾病

此外,在其他代謝性骨關(guān)節(jié)疾病中,如骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)、強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)等,有足夠的證據(jù)表明,補(bǔ)體可通過三種激活途徑參與骨關(guān)節(jié)炎的疾病過程,如骨重塑失調(diào)、骨贅形成、滑膜炎、軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)、關(guān)節(jié)退化等[34]。在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中,疾病的進(jìn)展取決于關(guān)節(jié)侵蝕以及骨重塑的平衡。在酵母聚糖誘導(dǎo)的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型鼠的研究中,在體內(nèi)注射眼鏡蛇毒因子(cobra venom factor,CVF)耗盡補(bǔ)體,發(fā)現(xiàn)補(bǔ)體缺乏導(dǎo)致滑膜和骨骼中成熟破骨細(xì)胞的數(shù)量減少,從而限制了骨吸收[35]。在關(guān)節(jié)炎模型中,抑制補(bǔ)體活性可以降低轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)和TGF-β3的表達(dá),改善晚期滑膜炎癥和骨破壞,防止骨贅形成和衰老細(xì)胞的產(chǎn)生[36]。

強(qiáng)直性脊柱炎是一種慢性軸性脊柱性關(guān)節(jié)炎,以椎間盤纖維環(huán)及其附近結(jié)締組織纖維化以及關(guān)節(jié)強(qiáng)直為特點(diǎn)的慢性炎癥性自身免疫性疾病,主要累及骶髂關(guān)節(jié)和脊柱。在AS發(fā)病原理的探究中,研究者發(fā)現(xiàn)蛋白多糖(proteoglycan,PG)誘導(dǎo)的AS小鼠模型中,補(bǔ)體系統(tǒng)被充分激活,體內(nèi)骨髓和脾臟中性粒細(xì)胞顯著增加,骨髓中的巨噬細(xì)胞減少,表明骨髓中巨噬細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化。體外實(shí)驗(yàn)還表明,補(bǔ)體激活可以增加成骨細(xì)胞或破骨細(xì)胞中TGF-β1和(或)RANKL的 水平。RANKL調(diào) 節(jié)破骨細(xì)胞分化,TGF-β1可直接刺激破骨前體分化和破骨細(xì)胞形成。通過細(xì)菌來源的補(bǔ)體抑制劑Efb-C可以抑制補(bǔ)體激活,降低成骨細(xì)胞活性,顯著延緩了小鼠AS的進(jìn)展,證實(shí)了補(bǔ)體抑制劑在AS治療中具有巨大潛力[37]。

4 小結(jié)與展望

在骨偶聯(lián)這一由多種細(xì)胞因子以及膜分子介導(dǎo)的成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞精確平衡中,補(bǔ)體及其受體扮演了重要角色。本文綜述了補(bǔ)體作為偶聯(lián)因子參與破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞之間相互作用的最新研究進(jìn)展,討論了補(bǔ)體作為偶聯(lián)因子在調(diào)節(jié)骨代謝內(nèi)平衡穩(wěn)定、外傷后的骨愈合、炎癥環(huán)境下骨重塑中發(fā)揮重要作用,為骨代謝異常相關(guān)疾病的治療提供新思路。目前關(guān)于補(bǔ)體對骨偶聯(lián)作用的相關(guān)機(jī)制研究十分有限,多種補(bǔ)體成分對于骨免疫疾病的相互作用關(guān)系及病理機(jī)制仍處于探索階段。補(bǔ)體作為固有免疫的重要成分對于骨骼系統(tǒng)生理及病理所發(fā)揮的作用具有廣闊的研究空間,補(bǔ)體對于臨床疾病的治療應(yīng)用也需進(jìn)一步探索。