徐 魯 馮家立 沈 昕

湖北中醫(yī)藥大學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院 (湖北 武漢， 430000)

近年來(lái)肝細(xì)胞癌(HCC)在世界范圍內(nèi)發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，WHO認(rèn)為肝癌給中國(guó)帶來(lái)的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)在所有腫瘤中排名第一[1]。HCC目前主要的有效治療方式是手術(shù)切除和肝移植。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，HCC患者的生存質(zhì)量日益提高，但術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)仍然嚴(yán)重影響HCC患者的預(yù)后。HCC病程進(jìn)展快且預(yù)后差，患者確診時(shí)多為中晚期，失去了治療的最佳時(shí)機(jī)，因此HCC的早期診斷對(duì)患者的治療和預(yù)后意義重大。甲胎蛋白(AFP)是常用的HCC診斷標(biāo)志物之一，研究顯示約50%的HCC患者血清中可檢測(cè)到AFP，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)AFP在部分患者中并不升高[2]。因此，AFP對(duì)于HCC的診斷有一定的漏診，尋找HCC的新型標(biāo)志物對(duì)提高HCC診斷的靈敏度和特異性意義重大。近年來(lái)長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)受到越來(lái)越多的關(guān)注，本文就lncRNA的功能以及在HCC診斷中的作用做一綜述。

1 lncRNA簡(jiǎn)介

1.1 lncRNA的來(lái)源與分類 lncRNA是一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度為200 nt～100 kb的無(wú)編碼功能的RNA分子。lncRNA起初被認(rèn)為是一種幾乎沒(méi)有功能的轉(zhuǎn)錄序列[3]，然而隨后的研究揭示了lncRNA在各種細(xì)胞過(guò)程中的重要作用，包括參與基因的轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染和染色體重塑等功能[4,5]。目前根據(jù)lncRNA與mRNA的相似性，推測(cè)lncRNA的可能來(lái)源如下。①編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因由于開(kāi)放讀碼框架(ORF)突變導(dǎo)致核苷酸序列斷裂；②染色質(zhì)重排；③非編碼基因轉(zhuǎn)錄；④基因中插入一個(gè)轉(zhuǎn)座成分而產(chǎn)生；⑤lncRNA部分序列重復(fù)形成[6,7]。根據(jù)編碼基因在基因組中的位置，lncRNA可分為正義、反義、雙向、基因間及基因內(nèi)5大類型。

1.2 lncRNA的功能 lncRNA的調(diào)控功能主要通過(guò)與DNA、RNA或蛋白質(zhì)分子相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)。在細(xì)胞內(nèi)，lncRNA通過(guò)廣泛調(diào)節(jié)DNA甲基化、組蛋白修飾和染色體重構(gòu)從而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。DNA甲基化被證明與許多腫瘤的發(fā)生相關(guān)，許多抑癌基因的啟動(dòng)子CPG島發(fā)生甲基化后，使得抑癌基因無(wú)法轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[8]。真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄過(guò)程需要多種蛋白因子的輔助，轉(zhuǎn)錄因子與RNA聚合酶Ⅱ形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，共同參與轉(zhuǎn)錄起始的過(guò)程。lncRNA通過(guò)一系列的順式調(diào)節(jié)和反式作用來(lái)影響DNA信息的轉(zhuǎn)錄和翻譯。Yang等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA PRNCR 1和PCGEM 1與前列腺癌細(xì)胞表面雄激素受體結(jié)合增強(qiáng)配體依賴和非配體依賴的雄激素受體激活通路從而導(dǎo)致前列腺癌細(xì)胞增殖。lncRNA還可與靶mRNA序列互補(bǔ)配對(duì)，從而影響mRNA的拼接、編輯、運(yùn)輸、翻譯和降解過(guò)程[10]。

在腫瘤細(xì)胞中，lncRNA可維持細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖，促進(jìn)轉(zhuǎn)移和腫瘤的侵襲，誘導(dǎo)血管的形成，抑制細(xì)胞的凋亡，還可影響腫瘤的代謝。研究顯示，腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移以及血管形成的過(guò)程通常伴隨著lncRNA表達(dá)的改變，這說(shuō)明lncRNA可以通過(guò)調(diào)控這些過(guò)程進(jìn)而影響腫瘤的代謝變化[11]。

2 lncRNA與肝癌

2.1 與肝癌細(xì)胞增殖相關(guān)的lncRNA 肝癌高表達(dá)轉(zhuǎn)錄本(HULC)位于染色體6p24.3， HULC的表達(dá)可以影響腫瘤抑制基因p18啟動(dòng)子的活性，并影響p18蛋白的表達(dá)，從而影響p18抑制細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖[12]。URHC通過(guò)調(diào)控ZAK蛋白的表達(dá)從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖，研究發(fā)現(xiàn)URHC與預(yù)后不良相關(guān)[13]。有研究發(fā)現(xiàn)有56種超保守RNA(ucRNA)在肝癌細(xì)胞系中表達(dá)異常，其中uc.338在肝癌組織中表達(dá)升高[14]。

2.2 與肝癌細(xì)胞凋亡相關(guān)的lncRNA 母本印跡表達(dá)基因3(MEG3)在4種肝癌細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，RNA原位雜交顯示在肝癌組織中MEG3雜交信號(hào)弱或缺失，而在正常肝組織中信號(hào)強(qiáng)烈，MEG3抑制細(xì)胞增殖、與肝癌細(xì)胞的凋亡有相關(guān)性[15]。uc002mbe.2對(duì)組蛋白去乙酰酶抑制劑曲古抑菌素A(TSA)介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡中發(fā)揮作用，研究發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞系中uc002mbe.2的表達(dá)低于正常肝臟細(xì)胞系[16]。

2.3 與肝癌預(yù)后和轉(zhuǎn)移相關(guān)的lncRNA lncRNA MVIH與血管形成有關(guān)，新生血管形成利于癌細(xì)胞生存，且方便癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，lncRNA MVIH在肝癌中高表達(dá)，與患者的生存率低密切相關(guān)[16]。lncRNA ATB在肝癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，lncRNA ATB與微血管和大血管的轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，lncRNA ATB與miR-200家族結(jié)合使miR-200家族對(duì)基因ZEB1、ZEB2的抑制作用變?nèi)?，?dǎo)致ZEB1蛋白和ZEB2蛋白的表達(dá)上調(diào)，誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而使腫瘤細(xì)胞的侵襲能力增強(qiáng)[17]。lncRNA LET在肝癌患者肝組織中表達(dá)下調(diào)與腫瘤的微轉(zhuǎn)移有顯著相關(guān)性[18]。lncRNA HOTAIR 高表達(dá)的患者易淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)增高、影響生存率[19]。

2.4 與HBV感染相關(guān)的lnc RNA lncRNA HEIH(lncRNA high expression in HCC)對(duì)HBV相關(guān)的肝癌進(jìn)展有作用，在肝癌組織中表達(dá)高于非癌肝組織，表達(dá)HEIH高的患者預(yù)后比表達(dá)HEIH低的患者差，HEIH高表達(dá)與肝癌復(fù)發(fā)的相關(guān)性高，HEIH可作為評(píng)判肝癌患者生存率的預(yù)后指標(biāo)[20]。lncRNA Dreh高表達(dá)組的復(fù)發(fā)率比低表達(dá)組的復(fù)發(fā)率低，生存期延長(zhǎng)明顯，Dreh與肝癌患者預(yù)后有相關(guān)性[21]。

2.5 與肝癌耐藥相關(guān)的lncRNA lncRNA H19可以誘導(dǎo)P-糖蛋白的表達(dá)引起MDRI相關(guān)的耐藥[22]。lncRNA CUDR在肝癌細(xì)胞系HepG2中高表達(dá)，由CUDR基因編碼且與化療藥物的耐藥有相關(guān)性，研究發(fā)現(xiàn)CUDR表達(dá)的下調(diào)使得腫瘤細(xì)胞易對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥[23]。

3 lncRNA在肝癌診斷與預(yù)后中的應(yīng)用

肝癌的預(yù)后與癌癥的臨床分期息息相關(guān)，提高肝癌的早期診斷率可以降低肝癌的死亡率，改善患者的預(yù)后。大多數(shù)早期肝癌沒(méi)有明顯的臨床癥狀，當(dāng)發(fā)現(xiàn)臨床癥狀時(shí)，腫瘤細(xì)胞往往已經(jīng)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移或侵犯周?chē)M織，臨床預(yù)后往往很差，患者生存率較低。基于目前的診斷手段，早期肝癌的診斷率并不高。早期較小的腫瘤病灶一般的影像學(xué)手段往往無(wú)法發(fā)現(xiàn)。研究表明，在早期肝癌患者中，只有10%～20%的患者出現(xiàn)AFP異常[24,25]。在2011年歐洲肝病協(xié)會(huì)發(fā)布的臨床指南中不再使用AFP作為診斷指標(biāo)[26]。近年來(lái)雖然有一些新的肝癌診斷指標(biāo)應(yīng)用于臨床，如異常凝血酶原(DCP)，提高了肝癌的診斷效果，但是這些標(biāo)志物也存著一定的局限性。隨著lncRNA研究特別是lncRNA與肝癌關(guān)系的研究的進(jìn)展，越來(lái)越多的lncRNA被發(fā)現(xiàn)可用于肝癌的診斷。

3.1 單一lncRNA應(yīng)用于肝癌的診斷 單一的lncRNA應(yīng)用于肝癌的診斷表現(xiàn)出較高的診斷效能。多位研究者發(fā)現(xiàn)UCA1在診斷肝癌中有較高的診斷效能。Zheng等[27]的一項(xiàng)包含105例HCC患者、105名健康志愿者以及105例良性肝病患者的研究中發(fā)現(xiàn)，但選擇UCA1截?cái)嘀禐?.85時(shí)在健康人群和HCC患者中鑒別出HCC患者的靈敏度為73.3%，特異性為99.0%，ROC曲線下面積為0.902，這說(shuō)明UCA1在肝癌的篩查中具有較高的特異性。研究還發(fā)現(xiàn)在區(qū)分良性肝病和HCC患者時(shí)，UCA1同樣也表現(xiàn)出較好的診斷效能。EL-Tawdi等[28]的研究也得出了類似的結(jié)論，值得注意的是EL-Tawdi還研究了UCA1應(yīng)用于區(qū)分慢性丙型肝炎患者和HCC患者時(shí)的診斷價(jià)值，發(fā)現(xiàn)UCA1也具有較高的診斷效能(AUC=0.838)。Wang等[29]對(duì)lncRNA GAS5-AS1的研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)的GAS5-AS1與肝癌的發(fā)生相關(guān)，并表現(xiàn)出作為肝癌診斷標(biāo)志物的潛力，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)GAS5-AS1在區(qū)分HCC與肝硬化方面具有較高的準(zhǔn)確度(AUC=0.824)，當(dāng)區(qū)分AFP<200 ng/ml 的HCC病例與AFP<200 ng/ml的肝硬化病例以及區(qū)分AFP<200 ng/ml 的HCC病例和乙型肝炎病例時(shí)，GAS5-AS1具有較高的靈敏度(分別為89.5%和89.5%)，表明GAS5-AS1可能是HCC的潛在診斷標(biāo)志物。此外，還有許多學(xué)者研究了其他lncRNA作為肝癌診斷標(biāo)志物的可能，例如MALAT1、SHNG1、Lnc-PCDH9-13∶1，這些lncRNA都表現(xiàn)出較好的診斷價(jià)值[30-32]。值得一提的是，Xie等[31]的研究樣本為唾液，發(fā)現(xiàn)唾液中的Lnc-PCDH9-13:1在區(qū)分HCC患者和健康人群具有較高的特異性和AUC面積(特異性為98%，AUC=0.898)。唾液標(biāo)本留取簡(jiǎn)單，值得進(jìn)一步研究。

3.2 多種lncRNA聯(lián)合檢測(cè)應(yīng)用于肝癌的診斷 有些lncRNA單獨(dú)應(yīng)用于肝癌的診斷時(shí)，其診斷效能表現(xiàn)不夠出色，但多種lncRNA聯(lián)合檢測(cè)往往可以提高診斷效能。包含3種血漿lncRNA的組合(LINC00152、RP11-160H22.5和XLOC014172)可能是區(qū)分HCC患者和健康人群以及慢性肝炎患者的指標(biāo)[33]。另一項(xiàng)研究使用了血漿RP11-160H22.5、XLOC_014172、LOC149086作為lncRNA組合，這項(xiàng)研究包含147例HCC患者和180例健康人員，但選擇7.449為截?cái)嘀禃r(shí)ROC曲線下面積最大(AUC=0.896)，診斷特異性為82%，靈敏度為73%，具有較好的診斷效能[34]。Wang等[35]選擇測(cè)定血清uc001ncr和AX800134作為lncRNA組合，在區(qū)分早期乙型肝炎病毒相關(guān)性肝癌(BCLC分級(jí)別為0+A)和乙型肝炎患者以及健康人群表現(xiàn)出極高的診斷價(jià)值，靈敏度為81.08%，特異性為90.91%，ROC曲線下面積為0.9564，但其研究的早期肝癌患者數(shù)量較少，結(jié)果的準(zhǔn)確性有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。

3.3 lncRNA聯(lián)合AFP或者其他指標(biāo)檢測(cè)應(yīng)用于肝癌的診斷Konishi等[30]在同一病例組和對(duì)照組中分別評(píng)估了血漿lncRNA MALAT1、AFP、維生素K缺乏誘導(dǎo)蛋白Ⅱ(PIVKAⅡ)以及三者聯(lián)合使用時(shí)區(qū)分HCC患者和肝病患者的診斷效能發(fā)現(xiàn)，當(dāng)三者聯(lián)合使用時(shí)靈敏度特異性明顯提高。同樣的研究結(jié)論也出現(xiàn)在Xu等[36]的研究中，當(dāng)ENSG00000258332.1、LINC00635、AFP聯(lián)合使用時(shí)達(dá)到最大的靈敏度特異性。Wang等[29]發(fā)現(xiàn)血清lncRNA LRB1聯(lián)合異常凝血酶原(DCP)與LRB1聯(lián)合AFP相比在區(qū)分HCC患者和健康人群是具有更高的靈敏度特異性和ROC曲線下面積，但三者聯(lián)用的診斷效能更高；三者同時(shí)聯(lián)用時(shí)，區(qū)分早期HCC患者(TNM分級(jí)為Ⅰ～Ⅱ級(jí))和健康人群相較于區(qū)分HCC和健康人群具有更高的診斷效能，這表明聯(lián)合檢測(cè)LRB1、AFP和DCP更加有助于早期肝癌的發(fā)現(xiàn)。

3.4 lncRNA與肝癌的預(yù)后 雖然lncRNA被人們熟知并進(jìn)行深入研究的時(shí)間不長(zhǎng)，但已有很多研究發(fā)現(xiàn)lncRNA與肝癌患者的預(yù)后相關(guān)。Wang等[37]的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，采用lncRNA表達(dá)芯片和逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)分析檢測(cè)326例HCC患者和73例健康志愿者LRB1的表達(dá)水平，分析LRB1表達(dá)與臨床參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果表明，與健康志愿者相比，HCC患者血清LRB1水平顯著升高。血清LRB1水平與甲胎蛋白表達(dá)、腫瘤大小、腫瘤分期和靜脈侵襲呈正相關(guān)，與總生存呈負(fù)相關(guān)。Zeng等[38]的研究發(fā)現(xiàn)，lncDQ在HCC組織樣本和血清中均上調(diào)，并且與低存活率和不利的臨床病理特征相關(guān)。多變量分析表明lncDQ表達(dá)是HCC的獨(dú)立預(yù)后因素。Ma等[39]的一項(xiàng)研究通過(guò)定量逆轉(zhuǎn)錄-PCR(qRT-PCR)評(píng)估68個(gè)HCC組織和鄰近正常組織中的JPX和XIST表達(dá)，分析了它們與病理特征和總體存活率的關(guān)系。結(jié)果表明，JPX和XIST水平在HCC中顯著降低，并且與組織學(xué)分級(jí)和腫瘤TNM分期相關(guān)。低JPX和XIST表達(dá)導(dǎo)致HCC的總體存活率顯著降低。多變量回歸分析表明，JPX / XIST表達(dá)水平是HCC總體存活率的獨(dú)立預(yù)后因素。

4 小結(jié)與展望

盡管lncRNA在肝癌診斷中表現(xiàn)出令人振奮的結(jié)果，但是也存在著許多問(wèn)題。lncRNA的研究正處于起步階段，其作用機(jī)制尚不清楚。另外，lncRNA的作用靶點(diǎn)眾多，完整闡明某個(gè)lncRNA的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)較為困難。lncRNA的研究目前較為分散，尚未有特定的lncRNA與肝癌相關(guān)性的系統(tǒng)研究。雖然，有研究報(bào)道了lncRNA在肝癌診斷中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，但是這些lncRNA應(yīng)用于臨床還需要更多的研究。在lncRNA對(duì)肝癌患者的預(yù)后方面，盡管多數(shù)研究都發(fā)現(xiàn)lncRNA的表達(dá)上調(diào)或下調(diào)與肝癌的預(yù)后相關(guān)，但這些lncRNA是如何影響肝癌的預(yù)后并不十分清楚。隨著基因技術(shù)的發(fā)展，lncRNA作為疾病的診斷預(yù)后標(biāo)志物是大勢(shì)所趨，高通量的測(cè)序方法以及非侵入性的檢測(cè)手段也需要在今后的研究中發(fā)現(xiàn)。