舒 然，龍海江，龍友華，顧桂飛,3，楊敬之，尹顯慧*

（1.貴州大學獼猴桃工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽50025；2.貴州大學作物保護研究所，貴州 貴陽550025；3.畢節(jié)市周驛茶場，貴州 畢節(jié)551700）

0 引言

【研究意義】李（Prunus salicinaLindl.）是薔薇科（Roaceae）李屬（Prunus）植物，原產(chǎn)于我國，經(jīng)濟價值高[1]。李是我國分布最廣的果樹之一，幾乎各省區(qū)均有野生種或栽培種[2]。在我國保存、栽培的品種主要有中國李（P. salicina）、杏李（P. simonii）、櫻桃李（P.cerasifera）和歐洲李（P.domestica）等[3]，在貴州省栽培的主要地方品種為蜂糖李、脆紅李和酥李等。李子具有豐富的營養(yǎng)，富含多種氨基酸和維生素[4]，廣受人們喜愛。近年來，貴州省李種植面積的不斷擴大，各種病蟲害發(fā)生日益嚴重，嚴重影響李產(chǎn)業(yè)發(fā)展[5]?！厩叭搜芯窟M展】李樹主要病害有李紅點病[6]、細菌性穿孔病[7]和褐腐病[8]等。筆者團隊于2020年調(diào)查發(fā)現(xiàn)貴州安順市李種植基地受果斑病危害嚴重，果實發(fā)病后向內(nèi)凹陷，呈不規(guī)則的灰白色病斑，通過形態(tài)觀察結(jié)合ITS、EF-1α和RPB2序列分析明確其致病菌為藤倉鐮刀菌（Fusarium fujikuroi）。研究表明，藤倉鐮刀菌可引起水稻惡苗病[9]、玉米莖腐病[10]、小麥赤霉病[11]等多種病害，對我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴重經(jīng)濟損失。此外，鐮刀菌屬真菌還會產(chǎn)生多種高毒性、低分子量的代謝產(chǎn)物，如玉米赤霉烯酮[12]、嘔吐毒素[13]、T-2毒素等多種次級代謝物，食用被其污染的食品會引發(fā)嚴重的食品安全問題[14]?！颈狙芯壳腥朦c】李果斑病為李樹上新報道的病害，主要危害果實，其病原菌生物學特性及室內(nèi)毒力研究尚待深入探討?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究旨在明確李果斑病病原菌生物學特性，篩選有效控制該病害的殺菌劑，為探明該病害的發(fā)生發(fā)展規(guī)律及防控該病害奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株及培養(yǎng)基：李果斑病病原菌藤倉鐮刀菌（F. fujikuroi，菌株編號HJGF1），由貴州大學作物保護研究所提供。馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨（Beef extract peptone，BEP）培養(yǎng)基、馬鈴薯蔗糖瓊脂（Potato sucrose agar，PSA）培養(yǎng)基、察氏（Czapek）培養(yǎng)基、胡蘿卜（Carrot agar，CA）培養(yǎng)基和燕麥瓊脂（Oatmeal agar，OA）培養(yǎng)基，各培養(yǎng)基參考宋莉莎等[15]的配方進行配制。

供試藥劑：0.3%丁子香酚SL，南通神雨綠色藥業(yè)有限公司；20%吡噻菌胺SC，日本三井化學AGRO株式會社；30%丙硫菌唑OD，安徽久易農(nóng)業(yè)股份有限公司；45%苯菌酮SC，巴斯夫（中國）有限公司；25%嘧菌酯SC，先正達南通作物保護有限公司；50%嘧菌環(huán)胺WDG，江西正邦作物保護有限公司。

1.2 李果斑病病原菌生物學特性測定

1.2.1 培養(yǎng)基對病原菌菌絲生長的影響 將直徑5.0 mm

菌餅接于上述6種培養(yǎng)基（PDA、BEP、PSA、Czapek、CA和OA）平板中央，28℃恒溫培養(yǎng)，每個處理3次重復。7 d后采用十字交叉法測量菌落直徑，下同。

1.2.2 李果斑病病原菌對碳、氮源的利用參照高晉等[16]的方法測定病原菌對不同碳、氮源的利用特性，以Czapek為基礎培養(yǎng)基，分別用含有等量的不同碳源、氮源置換Czapek培養(yǎng)基中的蔗糖、硝酸鈉，隨后采用5.0 mm無菌打孔器打取HJGF1病原菌邊緣菌餅，接種至含有不同碳氮源的培養(yǎng)基正中央，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)7 d后，觀察病原菌生長狀況，測量菌落直徑，每個處理3次重復。

1.2.3 不同溫度對李果斑病病原菌菌絲生長的影響

將培養(yǎng)5 d的HJGF1菌餅接種至PDA培養(yǎng)基平板中央，分別置于5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、28℃、30℃、35℃和40℃恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)7 d后，觀察病原菌生長狀況并測量菌落直徑，每個處理3次重復。

1.2.4 不同pH值對李果斑病病原菌菌絲生長的影響采用1 mol·L?1HCl和1mol·L?1NaOH分別將PDA

培養(yǎng)基pH調(diào)至4、5、6、7、8、9、10共7個處理，將培養(yǎng)5 d的HJGF1菌餅接種至PDA培養(yǎng)基平板中央，于28℃下恒溫培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)7 d后，觀察病原菌生長狀況并測量菌落直徑，每個處理3次重復。

1.2.5 光照對李果斑病病原菌菌絲生長的影響取菌餅移至滅菌處理后的PDA培養(yǎng)基平板上，分別于24 h黑暗、12 h明暗交替和24 h光照下28℃恒溫培養(yǎng)，每個處理3次重復。

1.3 李果斑病病原菌室內(nèi)藥劑篩選

藥劑篩選采用生長速率法[17]。依據(jù)初篩試驗結(jié)果，各藥劑分別設置5個質(zhì)量濃度梯度（表1），PDA培養(yǎng)基中加入一定劑量的供試藥劑，制成不同質(zhì)量濃度梯度的含藥平板，以加入等量無菌水的PDA平板為對照。將菌餅接種至不同質(zhì)量濃度梯度含藥PDA平板中央，置于28℃培養(yǎng)7 d，每個處理3次重復。測定方法同1.2.1，計算抑制率。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010軟件統(tǒng)計數(shù)據(jù)并繪制圖表，運用DPS7.05軟件并采用Duncan’s新復極差法進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基對李果斑病病原菌菌絲生長的影響

如圖1所示，不同培養(yǎng)基對李果斑病病原菌生長速度的影響存在顯著差異。其中，病原菌在Czapek培養(yǎng)基上菌絲生長最快，培養(yǎng)7 d時，菌落直徑 為54.17 mm，生 長 速 率達7.74 mm·d?1；在PDA培養(yǎng)基上次之，生長速率為7.45mm·d?1，與Czapek培養(yǎng)基處理無顯著差異。致病菌在BEP、PSA、CA和OA培養(yǎng)基上也能生長，但速率較慢且菌絲較稀疏，在CA培養(yǎng)基上最慢，生長速率僅為5.40mm·d?1。

圖1 不同培養(yǎng)基對李果斑病菌菌絲生長的影響Fig.1 Effect of culture m edia onm ycelial grow th of F. fujikuroi

表1供試藥劑Table1 Fungicides evaluated

2.2 碳源對李果斑病病原菌菌絲生長的影響

如圖2所示，李果斑病病原菌在不同碳源培養(yǎng)基上生長速率存在顯著差異，在以可溶性淀粉為碳源時最快，培養(yǎng)7 d菌落直徑為68.67mm，生長速率達9.81 mm·d?1；在以麥芽糖和葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基上次之，生長速率分別為8.76 mm·d?1、8.26 mm·d?1，在以蔗糖為碳源時，其菌絲生長量相對較少；以乳糖為碳源時菌絲生長緩慢，生長速率僅為6.14mm·d?1。

圖2 不同碳源對李果斑病病原菌菌絲生長的影響Fig.2 Effect of nitrogen sources on m ycelial grow th of F.fujikuroi

2.3 氮源對李果斑病病原菌菌絲生長的影響

如圖3所示，李果斑病病原菌在不同氮源培養(yǎng)基上均能生長。其中在以硝酸鈉為氮源時，其菌絲生長最快，菌落直徑為50.83 mm，生長速率為7.26 mm·d?1；以蛋白胨為氮源時次之，生長速率為7.14 mm·d?1；在尿素培養(yǎng)基上最慢，生長速率僅為6.10 mm·d?1，致病菌在不同氮源培養(yǎng)基上菌絲豐度差異不大，而在不含氮源培養(yǎng)基（CK）上菌絲稀疏，生長緩慢。

圖3 不同氮源對李果斑病菌病原菌絲生長的影響Fig.3 Effect of carbon sources on mycelial grow th of F.fujikuroi

2.4 不同溫度對李果斑病病原菌菌絲生長的影響

如圖4所示，不同溫度對李果斑病病原菌菌絲生長具有顯著影響，該病菌在15～35℃內(nèi)均可生長，培養(yǎng)7 d時菌落直徑為15.33～53.67mm，其中最適生長溫度為25℃，菌落直徑為53.67mm，生長速率為7.67mm·d?1；培養(yǎng)溫度在15℃以下或35℃以上時菌絲生長受到明顯抑制。

圖4 不同溫度對李果斑病菌菌絲生長的影響Fig.4 Effect of culture tem perature on m ycelial grow th of F.fujikuroi

2.5 不同pH對李果斑病病原菌菌絲生長的影響

如圖5所示，李果斑病病原菌在pH 4～10范圍內(nèi)均可生長，且病原菌菌絲生長速度隨pH值升高呈先增加后降低趨勢。適宜病原菌生長的pH為7～8，菌絲生長速率為5.83～6.33mm·d?1，說明該致病菌對堿性環(huán)境具有一定耐受力，在酸性環(huán)境中生長速度相對較慢。

圖5 不同pH對李果斑病病原菌菌絲生長的影響Fig.5 Effect of pH on mycelial grow th of F. fujikuroi

2.6 不同光照對李果斑病病原菌菌絲生長的影響

由圖6可知，病原菌在24 h持續(xù)黑暗、24 h持續(xù)光照和12 h光暗交替條件下均能生長。培養(yǎng)7 d時，菌落生長速率分別為7.55mm·d?1、7.45 mm·d?1、7.40mm·d?1，處理間差異不顯著（P＞0.05）。

圖6 不同光照條件對李果斑病病原菌菌絲生長的影響Fig.6 Effect of light exposure on m ycelial grow th of F. fujikuroi

2.7 不同殺菌劑對李果斑病病原菌室內(nèi)毒力

如表2所示，不同殺菌劑對李果斑病病原菌的室內(nèi)毒力存在顯著差異。其中，45%咪鮮胺EW對李果斑病病原菌抑制效果最佳，EC50為0.891 4μg·m L?1；其次分別為20%吡噻菌胺SC和30%丙硫菌唑OD，EC50分別為0.943 6μg·m L?1和1.022 0μg·m L?1；45%苯菌酮SC對該病菌的抑制效果最差，其EC50值為19.640 3μg·m L?1。

表2 7種殺菌劑對李果斑病病原菌的室內(nèi)毒力測定Table 2 Indoor toxicity test results of 7 fungicides on F.fujikuroi

3 討論

鐮刀菌屬（Fusariumspp.）分布廣泛，種類繁多，可致多種植物病害從而造成作物大量減產(chǎn)，已有研究發(fā)現(xiàn)，鐮刀菌屬能引起蔬菜[18,19]、中藥材[20]、果樹[21]和綠肥[22]等作物根腐病及薯類[23]和油料作物干腐病等[24]，給我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來巨大經(jīng)濟損失。藤倉鐮刀菌（Fusarium fujikuroi）是引起水稻惡苗病的重要致病菌[25]，該致病菌還可引起百香果葉部病害[26]、大豆種腐病[27]、玉米莖腐病[28]等多種病害。目前，關(guān)于李果實致病菌藤倉鐮刀菌生物學特性及其防治藥劑的篩選鮮有報道，本研究初步明確李果斑病致病菌生物學特性，并篩選有效防治該病害的藥劑，可為生產(chǎn)上防控李果實病害奠定基礎。試驗結(jié)果表明，藤倉鐮刀菌在Czapek和PDA培養(yǎng)基上生長狀況最好，菌絲量大，這與前人[27]研究結(jié)果不同，可能與種間差異及寄主不同有關(guān)；藤倉鐮刀菌適宜生長溫度范圍為20～35℃，最適生長溫度為25℃，這與王燕等[29]報道的鐮刀菌屬的甜瓜果腐病菌最適生長溫度相符；病原菌能有效利用供試6種碳源及5種碳源，其中最佳氮源為硝酸鈉和蛋白胨，最佳碳源為可溶性淀粉，與侯恩慶[30]結(jié)果基本一致。不同光照條件對該病原菌菌絲生長速度無顯著影響，與姜蘇月等[31]研究結(jié)果一致。李果斑病病原菌在pH為4～10均可生長，最適生長pH為8，在弱堿性或中性條件下生長力較強，與侯恩慶[30]報道的相一致。

化學藥劑是防治植物病害最主要的手段，李果斑病為在李樹上新報道的病害，其防治藥劑有待深入研究。陳宏州等[25]研究表明，95.2%咪鮮胺原藥能有效抑制藤倉鐮刀菌的生長，EC50為0.01μg·m L?1；朱廣啟等[32]試驗表明，5%嘧菌酯SC能抑制引起黃芩根腐病的茄病鐮刀菌生長；周鑫鈺[33]研究發(fā)現(xiàn)，40%咪鮮胺EW和50%多菌靈WP對藍莓根腐病菌毒力 較 強，其EC50分 別 為0.071 59 mg·L?1和2.832 9 mg·L?1。彭昀等[34]研究幾種殺菌劑對橡膠樹枯萎病菌尖孢鐮刀菌的室內(nèi)毒力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，97.3%咪鮮胺、96%吡唑醚菌酯和97.2%多菌靈原藥對尖孢鐮刀菌的毒力較好，EC50值分別為0.73、1.71、1.01 mg·L?1。本試驗測定7種殺菌劑對藤倉鐮刀菌的室內(nèi)毒力，結(jié)果表明，45%咪鮮胺EW、20%吡噻菌胺SC和30%丙硫菌唑OD對該致病菌室內(nèi)毒力較強，其EC50值 分 別 為0.8914、0.9436、1.0220μg·m L?1。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中，化學藥劑對病害的實際防治效果易受多種因素影響，因此還需進一步開展田間試驗以明確本試驗中化學藥劑的實際防效。

4 結(jié)論

李果斑病病原菌適宜在Czapek和PDA培養(yǎng)基上生長，最適pH值為7～8，最適生長溫度為25℃，以淀粉和葡糖糖為碳源、蛋白胨和硝酸鈉為氮源時生長較好；室內(nèi)毒力測定結(jié)果顯示，45%咪鮮胺WDG和20%吡噻菌胺SC對李果斑病病原菌抑制作用最強。