禾 璐 賈蘇卿 趙芳玉 劉 晶 張 彬 侯思宇 韓淵懷,*

(1 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米研究所，山西 忻州 034000；2 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西 晉中 030801)

類胡蘿卜素是一種天然色素，常積累于高等植物花、果實(shí)的成色母細(xì)胞中，使其表現(xiàn)出黃色、紅色或橙色。此外，類胡蘿卜素也是某些植物根和種子中的重要色素[1]。類胡蘿卜素在植物光合作用及光保護(hù)作用中具有重要作用[2-3]，在增強(qiáng)人體免疫、延緩衰老、預(yù)防心血管慢性疾病以及防癌抗癌方面也具有重要功效[3-5]。類胡蘿卜素作為重要的功能性成分受到廣泛關(guān)注。

目前，類胡蘿卜素生物合成途徑已基本明確，是類異戊二烯代謝體系中的一個(gè)分支，過程包括縮合、脫氫、環(huán)化、羥基化以及環(huán)氧化反應(yīng)[6]。在類胡蘿卜素生物合成途徑中，多種酶發(fā)揮關(guān)鍵作用，其中，八氫番茄紅素合成酶(phytoene synthase, PSY)是第一個(gè)限速酶，可催化兩分子牻牛兒基牻牛兒基二磷酸(geranylgeranyl diphosphate, GGPP)產(chǎn)生第一個(gè)類胡蘿卜素分子——八氫番茄紅素[6-8]。研究者已利用cDNA 3′末端快速擴(kuò)增技術(shù)(rapid amplification of cDNA 3′ ends, 3′ RACE)、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)等技術(shù)在玉米[9]、擬南芥[10-11]、番茄[12]、油菜[13]、小麥[14]、枸杞[15]、甘薯[16]、雞爪槭[17]等植物中分離克隆了PSY基因，對(duì)基因的序列特征開展了一系列生物信息學(xué)分析[18-19]，并通過超表達(dá)載體的構(gòu)建對(duì)該基因在多種植物中的功能進(jìn)行了研究，獲得了一些具有特殊顏色的轉(zhuǎn)基因植物，如胚呈橙黃色的轉(zhuǎn)基因油菜[20]、胚乳呈金黃色的“金大米”[21]等。

谷子[Setariaitalica(L.)Beauv]是我國北方重要的雜糧作物，去殼后的小米具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，深受消費(fèi)者的青睞，而米色是評(píng)價(jià)小米品質(zhì)的重要指標(biāo)。小米中富含類胡蘿卜素，平均含量為1.2 mg·kg-1，是玉米的2倍[22]。從不同米色品種的小米中提取黃色素，并進(jìn)行成分分析，發(fā)現(xiàn)米色與類胡蘿卜素的成分及含量具有一定的相關(guān)性[23-24]，但目前關(guān)于米色形成的分子機(jī)制仍不明確，且對(duì)控制谷子類胡蘿卜素生物合成關(guān)鍵酶基因及其功能的研究較少。基于此，本研究以不同米色谷子為試驗(yàn)材料，分離克隆了SiPSY1的cDNA全長(zhǎng)，通過對(duì)基因結(jié)構(gòu)以及該基因在谷子米色形成過程中表達(dá)特性差異的分析，初探SiPSY1基因與谷子米色形成的相關(guān)性，以期為進(jìn)一步開展谷子類胡蘿卜素調(diào)控機(jī)制的研究以及明確谷子米色形成分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料種植及取材

選擇黃色(七月黃、三變黃)和白色(白谷白米谷、白米糙)2種不同米色品種的谷子為試驗(yàn)材料，材料均為山西農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米研究所谷子課題組收集的農(nóng)家種，種植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米研究所試驗(yàn)田，試驗(yàn)田肥力均勻，地勢(shì)平坦。采用隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)置3次重復(fù)。行長(zhǎng)3 m，行距40 cm, 三行區(qū)。取材時(shí)，各品種每個(gè)重復(fù)選擇中間行3株生長(zhǎng)一致健康植株的籽粒進(jìn)行混合，用鑷子快速準(zhǔn)確地剝下相同灌漿狀態(tài)下的籽粒，在液氮中速凍后于-80℃低溫保存。3個(gè)取樣時(shí)期分別為：S1(米色形成初期，胚乳呈粉狀)，S2(米色形成中期，胚乳質(zhì)地硬化)，S3(米色形成后期，籽粒成熟)。

1.2 總RNA提取和cDNA合成

將低溫保存的籽粒取出，去殼后置于液氮中研磨成粉末，參照EZ-10 Total RNA Mini-Preps Kit RNA提取試劑盒(上海生工生物)說明書提取籽?？俁NA，RNA濃度及質(zhì)量分別通過Nanodrop 2000c超微量核酸蛋白測(cè)定儀(美國賽默飛)和1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。cDNA合成按照M-MuLV 第一鏈cDNA合成試劑盒(上海生工生物)說明書的步驟進(jìn)行，獲得的cDNA利用內(nèi)參引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證。

1.3 引物設(shè)計(jì)

參考玉米ZmPSY1基因序列，在谷子基因組數(shù)據(jù)庫中查找同源性最高的基因序列，分別以cDNA和CDS序列為模板，利用Primer 5軟件設(shè)計(jì)克隆引物和定量引物，如表1所示，其中SiActin是內(nèi)參基因。引物合成由上海生工生物工程股份有限公司完成。

表1 本研究所用的引物Table 1 Primers used in this study

1.4 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

以上述獲得的谷子籽粒cDNA為模板，PCR擴(kuò)增SiPSY1基因cDNA全長(zhǎng)。采用50 μL反應(yīng)體系，PCR程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性2.5 min；95℃變性15 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min后4℃保存。利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并分離PCR產(chǎn)物，使用膠回收試劑盒對(duì)目標(biāo)片段進(jìn)行回收后送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.5 生物信息學(xué)分析

利用DNAMAN軟件進(jìn)行序列開放閱讀框的翻譯、同源性比對(duì)以及系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建，通過ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)網(wǎng)站進(jìn)行蛋白質(zhì)理化特性分析，分別采用SOPMA(http://www.compbio.dundee.ac.uk/www-jpred/index.html)和SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，應(yīng)用MultAlin網(wǎng)站(http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html)進(jìn)行多序列比對(duì)。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)

使用SGExcel FastSYBR qPCR預(yù)混液(含 ROX)試劑盒進(jìn)行qRT-PCR，采用50 μL反應(yīng)體系：25 μL 2×SGExcel FastSYBR Mixture(含ROX), 2 μL cDNA，上、下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，最后加入RNase-Free ddH2O至50 μL。使用CFX96 TouchTM熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)(美國伯樂)，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3 min；95℃變性5 s，60℃退火20 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)反應(yīng)設(shè)置3次技術(shù)重復(fù)。采用2-ΔΔCT法，通過Bio-Rad CFX Manager 3.1軟件計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。利用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SiPSY1基因的克隆與序列差異分析

以黃色和白色2種不同米色谷子為材料，提取籽?？俁NA，進(jìn)一步反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，通過PCR擴(kuò)增獲得了約1 500 bp的目標(biāo)片段(圖1)。將產(chǎn)物送至公司進(jìn)行測(cè)序，對(duì)不同品種SiPSY1基因的編碼序列(coding sequence, CDS)進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該基因序列在不同品種間無差異(圖2)，說明其在不同品種中編碼相同的氨基酸。利用DNAMAN軟件對(duì)基因序列進(jìn)行翻譯，結(jié)果表明SiPSY1基因CDS全長(zhǎng)為1 248 bp， 共編碼415個(gè)氨基酸(圖3)。

注：M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker S；1～4：不同品種中的PCR產(chǎn)物，其中1、2表示2個(gè)黃色米色品種(七月黃、三變黃)，3、4表示2個(gè)白色米色品種(白谷白米谷、白米糙)。Note: M: Marker S. 1-4: PCR products in different varieties, including 1 and 2 refer to two yellow millets, Qiyuehuang and Sanbianhuang. 3 and 4 refer to two white millets, Baigubaimigu and Baimicao.圖1 各品種中SiPSY1基因的克隆Fig.1 Cloning of SiPSY1 gene in different varieties

注：1、2表示2個(gè)黃色米色品種(七月黃、三變黃)；3、4表示2個(gè)白色米色品種(白谷白米谷、白米糙)。Note: 1 and 2 refer to two yellow millets, Qiyuehuang and Sanbianhuang. 3 and 4 refer to two white millets, Baigubaimigu and Baimicao.圖2 不同品種SiPSY1基因CDS序列比對(duì)Fig.2 Comparison of CDS of SiPSY1 gene among different millet varieties

圖3 SiPSY1基因CDS序列及編碼的氨基酸序列Fig.3 The CDS and amino acid sequence of SiPSY1 gene

2.2 SiPSY1基因生物信息學(xué)分析

2.2.1 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析 利用ProtParam在線分析SiPSY1的氨基酸序列，結(jié)果表明其理論分子量為46.866 kDa，等電點(diǎn)為8.97，分子式為C2072H3308N592O605S21，構(gòu)成該蛋白的氨基酸中，亮氨酸含量最高，占11.6%，其次為丙氨酸和精氨酸，均占9.9%，組氨酸含量最低，僅為0.5%。不穩(wěn)定系數(shù)為62.61，屬于不穩(wěn)定蛋白。其親水性平均系數(shù)(grand average of hydropathicity，GRAVY)為-0.284，屬于親水性蛋白。

2.2.2 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 利用SOPMA網(wǎng)站在線預(yù)測(cè)SiPSY1蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明(圖4)，該蛋白質(zhì)由α螺旋(238個(gè)氨基酸殘基，占57.35%)、不規(guī)則卷曲(123個(gè)氨基酸殘基，占29.64%)、延伸鏈結(jié)構(gòu)(41個(gè)氨基酸殘基，占9.88%)和β轉(zhuǎn)角(13個(gè)氨基酸殘基，占3.13%)構(gòu)成。通過SWISS-MODEL網(wǎng)站獲得了SiPSY1蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型，如圖5所示，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致。

注：h：α螺旋；e：延伸鏈；c：不規(guī)則卷曲；t：β轉(zhuǎn)角。Note: h: α helix. e: Extended strand. c: Random coil. t: β turn.圖4 SiPSY1蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.4 Predicted secondary structure of SiPSY1 protein

圖5 SiPSY1蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.5 Predicted tertiary structure of SiPSY1 protein

2.2.3 同源序列與系統(tǒng)進(jìn)化分析 利用DNAMAN軟件對(duì)克隆獲得的谷子SiPSY1氨基酸序列與NCBI GeneBank中其他植物的PSY1氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，分析了它們的同源性和進(jìn)化關(guān)系，如圖6所示。谷子SiPSY1編碼氨基酸與多種植物PSY1編碼氨基酸具有同源性，有多個(gè)保守區(qū)域，其中，與玉米ZmPSY1的同源性最高，達(dá)到84.77%，其次為水稻OsPSY1，同源性為77.5%，與小麥TaPSY1的同源性為73.86%，此外，與擬南芥AtPSY1、辣椒CaPSY1的同源性相同，均為62.95%，與番茄SlPSY1、木薯MePSY1和油菜BnPSY1的同源性相同，為62.73%。

基于以上多重序列比對(duì)結(jié)果，進(jìn)一步構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖7)，結(jié)果表明，谷子SiPSY1與玉米ZmPSY1的親緣關(guān)系最近，與另外2個(gè)禾本科作物水稻和小麥的PSY1親緣關(guān)系次之，而與其他植物的PSY1親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.3 SiPSY1基因在不同谷子品種米色形成過程中的表達(dá)特性分析

通過qRT-PCR的方法，測(cè)定分析了SiPSY1基因在不同米色谷子品種中的表達(dá)差異以及在谷子米色形成過程中表達(dá)水平的變化情況，如圖8所示。SiPSY1基因在谷子籽粒中的相對(duì)表達(dá)量存在品種差異，具體表現(xiàn)為，在米色形成初期(S1)和中期(S2)，SiPSY1基因在2個(gè)黃色米色品種中的表達(dá)水平均顯著高于在白色米色品種中的表達(dá)水平。在米色形成后期(S3)，SiPSY1基因在2個(gè)白色米色品種中的表達(dá)水平，高于在黃色米色品種中的表達(dá)水平。

注：不同小寫字母表示同一時(shí)期不同品種間SiPSY1基因的相對(duì)表達(dá)量在0.05水平上差異顯著。Note: Different lowercase letters indicate that the relative expression level of SiPSY1 are significantly different at 0.05 level among different varieties at the same stage. 圖8 SiPSY1在不同谷子品種中的表達(dá)差異Fig.8 Relative expression of SiPSY1 in different foxtail millet varieties

在谷子米色形成過程中，SiPSY1基因在黃色米色品種七月黃中的相對(duì)表達(dá)量表現(xiàn)為先上升后顯著下降的趨勢(shì)，在三變黃中呈下降趨勢(shì)，但3個(gè)時(shí)期的變化并不顯著。而在2個(gè)白色米色品種中，SiPSY1的相對(duì)表達(dá)量均表現(xiàn)為逐漸上升的趨勢(shì)，其中，在白谷白米谷米色形成后期(S3)，表達(dá)量顯著升高，在白米糙米色形成各時(shí)期的變化均達(dá)到顯著水平(圖9)。

注：不同小寫字母表示同一品種在不同時(shí)期間差異顯著(P<0.05)。Note: Different lowercase letters indicate significant difference among different stage of the same varieties at 0.05 level.圖9 SiPSY1在米色形成過程中的表達(dá)變化情況Fig.9 Relative expression of SiPSY1 during the formation of millet colors

3 討論

在植物類胡蘿卜素生物合成途徑中，兩分子GGPP在八氫番茄紅素合成酶(PSY)作用下生成第一個(gè)類胡蘿卜素分子——八氫番茄紅素。PSY作為第一個(gè)限速酶，其編碼基因成為研究類胡蘿卜素生物合成機(jī)制以及利用基因工程技術(shù)提高植物類胡蘿卜素含量的首選目的基因[25]。目前，在多種植物中已經(jīng)成功克隆分離出PSY基因，并鑒定出PSY基因家族中的3個(gè)成員，分別為PSY1、PSY2和PSY3，3個(gè)基因具有器官或質(zhì)體表達(dá)特異性。其中，PSY1主要在含有有色體的花、果實(shí)和種子中調(diào)控類胡蘿卜素的合成[25-28]。本研究以不同米色谷子品種籽粒為研究材料，利用同源克隆技術(shù)，獲得了谷子SiPSY1基因的cDNA全長(zhǎng)，其開放閱讀框(open reading frame, ORF)包含1 248個(gè)堿基，共編碼415個(gè)氨基酸。谷子SiPSY1蛋白與同屬于C4禾本科作物玉米的ZmPSY1同源性最高，為84.77%，二者親緣關(guān)系最近。

在其他植物中，研究者對(duì)類胡蘿卜素生物合成調(diào)控機(jī)制及PSY基因的功能開展了一系列研究。研究發(fā)現(xiàn)，PSY1基因突變影響玉米胚乳中類胡蘿卜素的合成，導(dǎo)致玉米種子出現(xiàn)淺黃色表型[6,26]，PSY基因的遺傳變異在辣椒成熟果色的形成中起著重要的調(diào)控作用[29]，此外，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得的胚呈橙黃色的油菜和胚乳呈金黃色的“金大米”均與PSY基因表達(dá)有關(guān)[20-21]。本試驗(yàn)分析了SiPSY1基因在不同米色谷子品種籽粒中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在谷子米色形成的初期和中期，黃色米色品種籽粒中SiPSY1基因的表達(dá)水平顯著高于白色米色品種，表明谷子黃色米色表型與SiPSY1基因表達(dá)有關(guān)，這與上述其他植物中的研究結(jié)果一致。Li等[26]分析了玉米授粉后10～28 d胚乳成熟過程中PSY1基因的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)該基因的表達(dá)量呈先上升后下降的趨勢(shì)，這與本試驗(yàn)中黃色米色品種七月黃米色形成過程中SiPSY1基因的表達(dá)變化趨勢(shì)一致。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，SiPSY1基因在白色米色品種米色形成過程中，其表達(dá)水平呈逐漸上升趨勢(shì)，且在米色形成后期，高于在黃色米色品種中的表達(dá)水平。以上結(jié)果可能與類胡蘿卜素產(chǎn)物反饋抑制有關(guān)，SiPSY1基因的表達(dá)量上升，類胡蘿卜素不斷合成，黃色米色品種中類胡蘿卜素終產(chǎn)物不斷積累，積累到一定程度開始抑制SiPSY1基因的表達(dá)；而在白色米色品種中，類胡蘿卜素的積累量并不足以產(chǎn)生反饋抑制作用，使SiPSY1基因表達(dá)量呈持續(xù)上升趨勢(shì)。

本研究從基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)特性兩個(gè)方面對(duì)SiPSY1基因與谷子米色形成相關(guān)性進(jìn)行了探討，但對(duì)SiPSY1基因的功能研究還不夠深入，需要進(jìn)一步通過基因編輯、基因沉默、轉(zhuǎn)基因技術(shù)等基因工程手段進(jìn)行更深入的基因功能分析及相關(guān)的應(yīng)用途徑研究，從而明確該基因在谷子米色形成分子機(jī)制中的作用。

4 結(jié)論

本研究從黃色和白色兩種不同米色谷子籽粒中克隆出SiPSY1基因的cDNA全長(zhǎng)序列，該基因的CDS全長(zhǎng)為1 248 bp，共編碼415個(gè)氨基酸。通過qRT-PCR分析表明，在谷子米色形成初期和中期，SiPSY1基因在黃色米色品種籽粒中的表達(dá)水平顯著高于白色米色品種，由此推測(cè)谷子SiPSY1基因的表達(dá)特性與谷子米色形成具有一定的相關(guān)性。