王 宇, 周杜娟, 黃 艷, 徐 雁, 夏宏林

(安徽醫(yī)科大學附屬宿州醫(yī)院， 安徽 宿州 234000)

子癇前期是指孕婦在妊娠20周后發(fā)生的血清蛋白、血壓以及血脂的異常情況，其發(fā)病率高達6%～8%，隨著病情進展會累及到腦、心、肝和腎等多個重要臟器官，形成重度子癇前期[1]，不僅會使得母嬰面臨嚴峻的挑戰(zhàn)與威脅，而且影響妊娠結局。既往研究發(fā)現(xiàn)，重度子癇前期是炎癥免疫過度激活、氧化應激以及遺傳等多種因素共同作用的結果[2]，早發(fā)型重度子癇前期發(fā)病早、病情危重，直接威脅母嬰健康，其會通過重塑胎盤血管誘發(fā)胎源性疾病，表現(xiàn)為一氧化氮(nitric oxide，NO)表達異常及活性降低，從而引起母胎血管內皮受損[3]；晚發(fā)型則程度輕，多由機體與疾病耐受失衡有關。近年來，研究發(fā)現(xiàn)非對稱性二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine，ADMA)以及甲基精氨酸二甲胺水解酶(dimethylarginie dimethylaminohydrolase，DDAH)能夠調節(jié)機體NO，該機制主要是通過影響酶活性實現(xiàn)的，進而導致血管內皮激活，在損傷形成中有一定的參與作用[4]。本研究以2017年1月至2020年10月62例重度子癇前期患者作為研究對象，分析血清和胎盤組織ADMA與DDAH2在重度子癇前期中的表達及其相關性，現(xiàn)將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料:前瞻性收集安徽醫(yī)科大學附屬宿州醫(yī)院收治的重度子癇前期患者病例，來源時間范圍為2017年1月至2020年10月，病例總數(shù)為62例，其中早發(fā)型重度子癇前期患者(早發(fā)型重度子癇前期組)32例，晚發(fā)型重度子癇前期患者(晚發(fā)型重度子癇前期組)30例。早發(fā)型重度子癇前期患者年齡(22～37)歲，平均年齡(29.63±4.02)歲；孕周(25～35)周，平均孕(32.39±1.14)周。晚發(fā)型重度子癇前期患者年齡21～38歲，平均年齡(29.53±4.09)歲；孕(26～36)周，平均孕(34.95±1.21)周。選擇同期健康孕婦(n=30)作為對照組，年齡36～23歲，平均年齡(29.18±4.21)歲，孕(25～36)周，平均孕(33.84±1.64)周。三組孕婦年齡及孕周對比，無顯著差異(P>0.05)，具有可比性。

1.2納入與排除標準:入組標準：①收集對象均為初產(chǎn)婦，且B超顯示為單胎;②重度子癇前期診斷標準參照《妊娠期高血壓和子癇前期指南2019版》[5]；③患者及家屬已明確研究目標及流程，自愿參與研究并在知情同意書簽字，醫(yī)學倫理委員會掌握研究相關事項，并批準;④產(chǎn)婦年齡≥18歲，可正常交流。排除標準：①合并精神異常、心理障礙或意識喪失患者；②合并原發(fā)性高血壓、糖尿病及心腦血管疾病患者；③聽力喪失、語言溝通不順暢，對研究無法做到順利配合患者。

1.3方 法

1.3.1血清胎盤樣本采集:血液樣本采集均應在清晨空腹狀態(tài)下進行，抽血部位為肘部，抽血量以6mL為宜，放置于室溫環(huán)境下靜置30min，然后置于4℃環(huán)境下，按照2500r/min的離心速率實施離心處理，離心半徑設置為22.5cm，離心處理時間為15min，將血清分離，保存于-70℃冰箱中。產(chǎn)婦娩出胎盤后立即將臍帶位置血管密集部位胎盤組織，以1.5cm×1.0cm×0.5cm為宜，需要注意避開鈣化點位置。采用生理鹽水進行反復沖洗，并采用濾紙做吸干處理，在液氮下進行短暫冷凍，然后保存于-70℃冰箱環(huán)境中待測。

1.3.2血清ADMA與DDAH2檢測:嚴格按照ELISA試劑盒說明檢測ADMA及DDAH2指標，試劑盒由泉州市睿信生物科技有限公司提供。完成標準品稀釋、加樣以及溫育等操作，并進行洗滌、加酶以及顯色處理，然后完成測定。

1.3.3胎盤組織ADMA及DDAH2表達檢測:分別提取三組研究對象胎盤標本，處理步驟包埋-切片-脫蠟，然后實施抗原修復，將山羊血清封閉液及第一抗體適量加入，漂洗后將生物素化二抗及鏈霉親和素-生物素復合物(strept avidin-biotin complex,SABC)試劑依次加入其中。實施DAB顯色及蘇木精復染處理。陽性：染色后細胞核呈現(xiàn)顏色為棕黃色。陰性：未著色或僅呈現(xiàn)背景顏色。Fromowitz綜合計分法：0分：陽性細胞數(shù)量低于1%；1分：陽性細胞數(shù)量在1%～25%之間；2分：陽性細胞數(shù)量介于25%～50%；3分：陽性細胞數(shù)超過50%；染色強弱評分依據(jù)：0分表示未染色；1分為淡黃色；2分為黃色；3分棕黃色；兩項評分進行綜合處理相乘，共分為陰性(-)、弱陽(+)、陽性(++)以及強陽(+++)4個級別，對應分值分別為0分、1～3分、4～6分、9分。

1.4觀察內容:①比較三組研究對象的外周血清ADMA及DDAH2水平；②比較三組研究對象的外周血清ADMA及DDAH2的陽性表達率；③分析血清中ADMA與DDAH2表達的相關性。

2 結 果

2.1三組研究對象外周血清ADMA及DDAH2水平比較:與對照組相比，晚發(fā)型及早發(fā)型重度子癇前期組ADMA均較高，DDAH2均較低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，晚發(fā)型與早發(fā)型重度子癇前期組患者相比，后者ADMA較前者高，DDAH2水平后者較前者低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2三組研究對象胎盤組織ADMA和DDAH2表達率比較:三組ADMA陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=16.389，P=0.000)；三組DDAH2陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=12.370，P=0.000)；早發(fā)型重度子癇前期組胎盤組織ADMA陽性表達率(93.75%)高于晚發(fā)型重度子癇前期組(66.67%)及對照組(46.67%)，其陽性表達率經(jīng)Fisher的精確檢驗后，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.010，0.000)。早發(fā)型重度子癇前期胎盤組織DDAH2陽性表達率(37.50%)低于晚發(fā)型重度子癇前期(66.67%)及對照組(80.00%)，其陽性表達率經(jīng)Fisher的精確檢驗后，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.025，0.001)。見表2。

表1 三組研究對象外周血清ADMA及DDAH2水平比較

表2 三組研究對象胎盤組織ADMA和DDAH2表達率比較

2.3血清中ADMA及DDAH2表達相關性分析:血清ADMA水平與DDAH2在早發(fā)型及晚發(fā)型重度子癇前期均呈現(xiàn)為負相關(r=-0.71，-0.77，P<0.05)。

3 討 論

作為產(chǎn)科常見并發(fā)癥，子癇主要指的是不明病因的抽搐，表現(xiàn)為全身小動脈痙攣以及全身器官及臟器血液灌流的減少[6]。既往研究發(fā)現(xiàn)，子癇前期與多基因有著密不可分的聯(lián)系，多基因遺傳會加重對子癇前期的易感性，引起胎母免疫平衡及耐受失調，降低免疫抑制反應，引起胎盤缺氧、缺血，損傷血管內皮，進而形成子癇前期[7]。早發(fā)型重度子癇前期伴隨明顯胎盤組織凋亡，阻斷滋養(yǎng)細胞進入，各類因子進入母體循環(huán)系統(tǒng)后會使得NO減少，難以發(fā)揮對血壓的調節(jié)作用，考慮有明顯內皮損傷。

作為一種天然氨基酸，ADMA主要來源于人體組織、體液及細胞，能夠對一氧化氮合酶活性產(chǎn)生競爭性抑制，使得NO合成受到一定的抑制，這也是血管內皮損傷的主要因素，進而影響到血流動力學,以往有學者在研究中發(fā)現(xiàn)少部分ADMA會經(jīng)過腎臟被排出，90%會受到DDAH的水解作用以瓜氨酸及二甲胺形式被排出[8]。DDAH1主要來源于胰腺、主動脈及中性粒細胞，其中肝、腎部位置表達最高。處于妊娠期女性DDAH2主要存在心臟及胎盤組織中。當孕婦處于病理狀態(tài)，DDAH會減少，導致ADMA在機體大量聚集，降低eNOS活性[9]。以往有學者在動物試驗中發(fā)現(xiàn)ADMA處于異常狀態(tài)下，會影響到子癇前期患者胎盤功能，主要表現(xiàn)為血管異常收縮[10];ADMA持續(xù)升高，長此以往會使得血管內皮功能受到不同程度損傷，增加高血壓發(fā)生風險。本研究就不同組別孕婦進行了血清ADMA水平檢測，從研究得出的數(shù)據(jù)可以看出早發(fā)型重度子癇有著更高的水平，且陽性表達率在三組中居于首位，三組差異顯著，考慮與以下幾個因素有關：①過度ADMA表達減少內源性NO的生成，降低了eNOS對血管內皮及血管舒張功能的保護作用;②ADMA能夠對SOD、CAT等抗氧化物質分泌產(chǎn)生抑制作用，使得胎盤組織中滋養(yǎng)細胞被炎癥介質破壞，對凋亡程度產(chǎn)生激活作用，滋養(yǎng)細胞凋亡速度明顯增加，這也是子癇前期形成的重要機制；可以將該指標作為評估胎盤功能的可靠指標。作為一種胞質蛋白酶，DDAH2能夠將90%以上ADMA降解，妊娠期孕婦心血管及胎盤組織是DDAH2的主要分布部位，既往有學者在研究中發(fā)現(xiàn)DDAH2在高血壓及高血脂中呈現(xiàn)出低轉錄及低表達[11]。本研究早發(fā)型重度子癇前期組血清DDAH2水平及胎盤組織DDAH2陽性表達率均較晚發(fā)型及對照組低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明DDAH2在早發(fā)型重度子癇前期呈現(xiàn)出明顯下調。早發(fā)型重度子癇前期DDAH2與ADMA能夠對ERKl/2-CREB信號通路產(chǎn)生影響，競爭內皮細胞氧化氮合酶，使其表達下調及降低一氧化氮生成，加重胎盤血管內皮細胞損傷及提高全身微小血管的緊張性，可見胎盤組織中DDAH2與ADMA相關性與血清中兩者表達是相通的，因此僅對血清中DDAH2與ADMA表達相關性進行分析，Pearson相關系數(shù)分析顯示，血清ADMA水平與DDAH2在早發(fā)型及晚發(fā)型重度子癇前期均呈現(xiàn)為負相關(r=-0.71，-0.77，P<0.05)；提示早發(fā)型重度子癇前期的形成與上述兩項指標有著一定的關聯(lián)性，但由于樣本少、精力有限，結果可能存在一定的偏倚，有待進一步大樣本、大規(guī)模研究，為臨床提供更多可靠的依據(jù)。

綜上所述，與正常孕婦及晚發(fā)型子癇前期孕婦相比，早發(fā)型重度子癇前期患者ADMA有明顯升高趨勢，DDAH2表現(xiàn)為明顯降低，血清ADMA和DDAH2表達水平可作為診斷、評估早發(fā)型重度子癇前期的可靠指標，為治療方案提供可靠的依據(jù)。