王鈺靜，王惠寧，2

1.溫州醫(yī)科大學(xué) 口腔醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院 牙周科，浙江 溫州325027

牙周炎是口腔常見病之一，發(fā)病率高達(dá)80%以上，可導(dǎo)致牙周附著喪失、牙槽骨吸收、牙齒松動(dòng)等，已成為成人牙齒脫落的主要原因，同時(shí)，其作為心腦血管疾病、糖尿病等全身性疾病的影響因素，危害全身健康[1-2]。此外，修復(fù)治療和正畸矯治過程中的不良因素亦可導(dǎo)致牙槽骨吸收、牙齦退縮等牙周組織完整性破壞現(xiàn)象[3-4]。目前臨床上以去除病因、牙周潔治術(shù)、刮治術(shù)及口腔衛(wèi)生指導(dǎo)等基礎(chǔ)治療作為牙周疾病的主要治療方法，但對(duì)于重度牙周炎患者牙周支持組織的過度喪失尚缺乏有效的治療手段。

牙周膜干細(xì)胞（periodontal ligament stem cells, PDLSCs）是存在于牙周組織中一種具有間充質(zhì)干細(xì)胞特性的多能性干細(xì)胞，具有成骨、成脂、成纖維、成牙骨質(zhì)等多向分化的潛能[5-6]。此外，其具有增殖與分化能力，近年來已成為牙周組織重建、再生和骨組織工程的潛在種子細(xì)胞[6]。因此，探討PDLSCs增殖、凋亡、衰老、分化等生物學(xué)功能及其影響因素和具體機(jī)制可豐富牙周再生臨床應(yīng)用的理論基礎(chǔ)，為牙周疾病所致牙周支持組織破壞的治療提供新思路。

1 Hippo信號(hào)通路

Hippo信號(hào)通路最初是在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一條對(duì)組織器官生長(zhǎng)有重要調(diào)控作用的激酶鏈，因其關(guān)鍵基因hpo突變所致的河馬樣器官增大的表型而得名[7]?？茖W(xué)研究陸續(xù)證實(shí)，果蠅中該通路的核心分子具有進(jìn)化保守的調(diào)控功能，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)表現(xiàn)為功能相似的同源物[8-10]。Hippo信號(hào)通路由一系列蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子組成，其中哺乳動(dòng)物體內(nèi)該通路的核心蛋白激酶包括：①M(fèi)ST1/2（mammalian sterile 20-like 1/2 kinases）或STK4/3（serine/threonine kinase 4），通過磷酸化其下游的蛋白激酶發(fā)揮作用；②SAV1（Salvador 1），通過與MST1/2形成復(fù)合物促進(jìn)其下游蛋白磷酸化；③LATS1/2（large tumor suppressor homolog 1/2），通過磷酸化和抑制下游效應(yīng)因子發(fā)揮作用；④MOB1A/B（MOB kinase activator 1A/B），與LATS1/2形成復(fù)合物促進(jìn)下游效應(yīng)因子磷酸化。轉(zhuǎn)錄因子則主要包括：①YAP/TAZ，為果蠅中Yki的同源基因，是Hippo通路下游關(guān)鍵效應(yīng)因子。YAP在哺乳動(dòng)物中表現(xiàn)為YAP1和YAP2兩種亞型，其中YAP1為細(xì)胞內(nèi)連接蛋白和轉(zhuǎn)錄輔助激活因子，通過基因的轉(zhuǎn)錄激活和表達(dá)在促進(jìn)組織再生、維持干細(xì)胞更新等各種生物效能中發(fā)揮作用[11-13]。TAZ則為具有PDZ基序的轉(zhuǎn)錄共激活因子；②TEAD1-4（TEA domain family transcription factors 1-4），其中TEAD-2位于細(xì)胞核內(nèi)，可通過與YAP形成復(fù)合物，共同激活參與促進(jìn)增殖及抑制凋亡的基因表達(dá)。

Hippo信號(hào)通路以其調(diào)節(jié)器官大小的功能而聞名，研究證實(shí)Hippo激酶級(jí)聯(lián)或上游調(diào)節(jié)因子的失活導(dǎo)致各種器官的過度生長(zhǎng)[14]。隨著研究逐步深入，不少關(guān)于Hippo信號(hào)通路在組織再生、干細(xì)胞功能等方面發(fā)揮重要調(diào)控作用的報(bào)道引起了廣泛關(guān)注[15]。越來越多的證據(jù)表明，Hippo信號(hào)通路廣泛表達(dá)于各類干細(xì)胞譜系中，且在牙周膜細(xì)胞中也存在特異性表達(dá)。PDLSCs作為上述兩類細(xì)胞的“交集”，在其增殖、凋亡、分化等生物學(xué)過程中Hippo也扮演了重要角色（見表1）。生理狀態(tài)下，Hippo信號(hào)沉默時(shí)，細(xì)胞內(nèi)YAP處于激活狀態(tài)，可進(jìn)入細(xì)胞核與核因子TEAD結(jié)合共同激活細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)。而來自細(xì)胞微環(huán)境中的機(jī)械信號(hào)、氧化應(yīng)激、其他調(diào)節(jié)因子等各類應(yīng)激狀態(tài)可條件性激活MST1/2，進(jìn)而募集SAV1逐級(jí)磷酸化LATS1/2及MOB1A/B，形成復(fù)合體最終在轉(zhuǎn)錄水平上多位點(diǎn)磷酸化下游效應(yīng)因子YAP/TAZ，進(jìn)而使其局限在細(xì)胞質(zhì)中泛素化降解（見圖1），從而在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控細(xì)胞增殖及成骨相關(guān)基因表達(dá)、抑制成脂基因表達(dá)[16-18]。

表1 Hippo信號(hào)通路相關(guān)組分參與牙周膜干細(xì)胞生物學(xué)功能調(diào)控

圖1 經(jīng)典Hippo信號(hào)通路作用機(jī)制簡(jiǎn)圖

2 Hippo信號(hào)通路與PDLSCs增殖-凋亡平衡

研究證實(shí)，PDLSCs在體內(nèi)外均有一定的增殖能力，且其體外克隆增殖能力較牙髓干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞更強(qiáng)[19]。已有證據(jù)表明其增殖能力與多種因素相關(guān)，主要包括機(jī)械負(fù)荷、白細(xì)胞介素10（interleukin-10, IL-10）及白細(xì)胞介素11（interleukin-11, IL-11）、缺氧、生長(zhǎng)因子的參與等[20-23]。近年研究顯示Hippo信號(hào)通路中多種組分的沉默和激活在其中參與了各類干細(xì)胞增殖活性的調(diào)節(jié)[24]，包括MST1/2、LATS1/2、MOB1等。然而，目前對(duì)于PDLSCs的研究則集中于轉(zhuǎn)錄因子YAP/TAZ。

WEN等[25]通過構(gòu)建增強(qiáng)綠色熒光蛋白慢病毒載體下調(diào)人PDLSCs中YAP的表達(dá)水平，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明YAP的下調(diào)可使細(xì)胞滯留于G1期從而抑制人PDLSCs的增殖活性。同時(shí)，JIA等[26]通過激活人PDLSCs中YAP過表達(dá)，證實(shí)過表達(dá)YAP可使細(xì)胞增殖活力提高，細(xì)胞凋亡率顯著降低，提示YAP在人PDLSCs的增殖-凋亡平衡中具有調(diào)控作用。此外，YAP的下調(diào)抑制Erk、Bcl-2信號(hào)通路相關(guān)因子表達(dá)，而其上調(diào)則對(duì)上述通路有促進(jìn)作用。已有研究證實(shí)Erk及Bcl-2信號(hào)通路參與細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)[27]，提示二者可與Hippo信號(hào)通路互相作用共同調(diào)節(jié)人PDLSCs的增殖，但具體機(jī)制尚未見相關(guān)研究闡述。此前，HüLTER-HASSLER等[28]對(duì)生物力學(xué)應(yīng)變下的人牙周膜成纖維細(xì)胞增殖進(jìn)行了研究，證實(shí)該進(jìn)程中YAP核向轉(zhuǎn)移，且抑制Erk1/2所致YAP活性下調(diào)的現(xiàn)象亦揭示了YAP是一種通過MAPK非依賴性途徑調(diào)節(jié)增殖的因子。以上研究提示YAP的表達(dá)可能受到包括Hippo信號(hào)通路在內(nèi)的多種信號(hào)通路的共同調(diào)節(jié)。

此外，MST1/2已被證明是促凋亡激酶，可在凋亡信號(hào)下活化，通過參與細(xì)胞氧化應(yīng)激途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[29]，但目前尚未見相關(guān)研究報(bào)道其在PDLSCs中的調(diào)節(jié)作用。

3 Hippo信號(hào)通路與PDLSCs衰老

目前Hippo在PDLSCs衰老方面的研究多為表型研究，WEN等[25]下調(diào)人PDLSCs中YAP表達(dá)水平后，衰老特異性染色實(shí)驗(yàn)證實(shí)其衰老程度加重。為增加人PDLSCs的利用來源，已有研究就其永生化細(xì)胞系的建立和機(jī)制進(jìn)行了探索。CHEN等[30]通過轉(zhuǎn)染含有端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶基因（telomerase reverse transcriptase, TERT）的慢病毒建立了可多次傳代的人牙周膜永生化干細(xì)胞系（TERT-hPDLSCs），同時(shí)對(duì)YAP在其中的作用進(jìn)行了探討，發(fā)現(xiàn)加入抑制YAP與TEAD結(jié)合的抑制劑Verteporfin時(shí)，TERThPDLSCs的增殖率減少，凋亡率和衰老率明顯增加，提示YAP在介導(dǎo)永生化PDLSCs中可能發(fā)揮作用，但其具體機(jī)制尚缺乏進(jìn)一步探究。

4 Hippo信號(hào)通路與PDLSCs多向分化

在生理?xiàng)l件下，PDLSCs處于靜息狀態(tài)，以維持牙周膜細(xì)胞的更替和穩(wěn)定的功能，當(dāng)牙周膜、牙槽骨、牙骨質(zhì)等牙周支持組織發(fā)生破壞和喪失時(shí)，PDLSCs可分化為成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞等參與缺損修復(fù)，其分化方向受到多種轉(zhuǎn)錄因子、信號(hào)通路及干細(xì)胞巢微環(huán)境的調(diào)控。目前研究顯示，Hippo信號(hào)通路主要通過調(diào)節(jié)成骨分化和成脂分化參與PDLSCs的分化過程，在成纖維及成牙骨質(zhì)方向尚未見相關(guān)研究。

LIN等[31]通過構(gòu)建慢病毒載體轉(zhuǎn)染α-降鈣素基因相關(guān)肽（α-calcitonin gene related peptide,α-CGRP）在人PDLSCs中過表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其成骨表型ALP、Col-1及RUNX2的上調(diào)趨勢(shì)與YAP相一致，促進(jìn)牙周膜細(xì)胞成骨。此前已有研究[32-34]證實(shí)α-CGRP可刺激成骨細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞的增殖、分化和成熟，且Hippo信號(hào)通路在CGRP過表達(dá)的小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中起作用，提示CGRP可能通過Hippo-YAP信號(hào)介導(dǎo)人PDLSCs的成骨分化，但具體調(diào)控水平和機(jī)制尚待研究。TAO等[35]通過建立TNF-α誘導(dǎo)的牙周炎模型并進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)YAP1的過表達(dá)可改善TNF-α誘導(dǎo)的人PDLSCs凋亡，并促進(jìn)PDLSCs的分化，尤其是成骨分化，提示YAP可能是牙周炎治療的潛在靶點(diǎn)。JIA等[36]對(duì)YAP調(diào)節(jié)人PDLSCs的多向分化能力機(jī)制進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)YAP可能通過調(diào)節(jié)LRP6和DVL3等Wnt信號(hào)通路上游蛋白促進(jìn)細(xì)胞成骨分化，同時(shí)抑制成脂分化。此前，Wnt/β-catenin信號(hào)通路已被證實(shí)可增強(qiáng)干細(xì)胞的成骨分化，抑制干細(xì)胞的成脂分化，其潛在蛋白結(jié)合位點(diǎn)為MOB1[37-38]，提示YAP在調(diào)控PDLSCs的分化方向過程中受多種機(jī)制的調(diào)節(jié)作用。

此外，目前也有部分研究證實(shí)Hippo信號(hào)通路在機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)的PDLSCs成骨分化中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，為正畸矯治過程中的生物學(xué)基礎(chǔ)及導(dǎo)致的牙周損傷提供了新的見解。近期，WU等[39]通過高通量測(cè)序檢測(cè)PDLSCs受拉伸應(yīng)力組和非拉伸應(yīng)力組牙周膜細(xì)胞中miRNA的表達(dá)譜，預(yù)測(cè)Hippo信號(hào)通路中YAP1、TEAD2、LATS1、TEAD1等為差異表達(dá)的miRNAs的靶基因。SUN等[40]在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)正畸移動(dòng)牙齒14 d后，大鼠骨細(xì)胞、骨基質(zhì)及PDLSCs中可見YAP和TAZ，其表達(dá)量與正畸力呈正比，且通過雙標(biāo)記熒光染色發(fā)現(xiàn)TAZ可通過RUNX2調(diào)節(jié)骨組織重塑，提示Hippo-TAZ-RUNX2在牙槽骨改建中可能發(fā)揮重要作用[41-42]。YANG等[43]通過施加循環(huán)拉伸應(yīng)力模仿正畸力處理牙周膜細(xì)胞，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)YAP核易位明顯增加，且敲除YAP基因及加入YAP抑制劑均可抑制成骨作用，提示YAP在拉伸應(yīng)力過程中被激活且調(diào)控PDLSCs的成骨分化。同時(shí)，研究通過體外建立小鼠正畸牙齒移動(dòng)模型證明YAP在張力側(cè)牙周膜細(xì)胞中上調(diào)，表明Hippo-YAP信號(hào)通路可能在牙周膜重建中發(fā)揮重要作用。此外，有研究表明，miR-135b-5p可通過控制Hippo信號(hào)通路的關(guān)鍵負(fù)調(diào)節(jié)因子LATS1和MOB1B的表達(dá)水平，調(diào)節(jié)人間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，從而導(dǎo)致Hippo信號(hào)通路的激活[44]，但在PDLSCs中的作用尚待進(jìn)一步研究。

4 總結(jié)與展望

目前臨床上在牙周疾病的治療過程中，對(duì)于嚴(yán)重的上皮附著喪失、牙槽骨吸收的病例尚缺乏有效的治療手段，被逐步破壞的牙周組織將對(duì)患者生活質(zhì)量、全身健康造成影響。因此，探索一種能夠修復(fù)和重建損失的牙周組織的治療手段應(yīng)為目前值得關(guān)注的研究方向。PDLSCs作為牙周膜細(xì)胞中少量能夠分化為成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞的成體干細(xì)胞，對(duì)于牙周組織的再生具有重要意義，但調(diào)控其增殖、凋亡及多向分化的機(jī)制較為復(fù)雜，目前尚未被完全闡明，且體外傳代培養(yǎng)的細(xì)胞質(zhì)量受到衰老的限制，目前在臨床應(yīng)用方面具有一定限制。

雖然存在挑戰(zhàn)，但Hippo信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子在其中的應(yīng)用和研究具有廣闊的發(fā)展前景，已有研究表明Hippo信號(hào)通路在促進(jìn)PDLSCs的成骨分化及增殖中發(fā)揮重要調(diào)控作用，且體外研究證實(shí)Hippo-YAP的表達(dá)可改善牙周炎誘導(dǎo)的大量細(xì)胞凋亡。因此，進(jìn)一步加強(qiáng)Hippo信號(hào)通路對(duì)PDLSCs生物學(xué)功能的研究可在細(xì)胞和組織層面為修復(fù)缺損牙周結(jié)締組織和骨組織的治療提供新的思路和理論依據(jù)。