沈亞菊，馮高樂(lè)，邵 高，朱 贊，張志方，夏天中，林瑞平*

(1.平湖市畜牧獸醫(yī)站，浙江 平湖 314200；2.平湖市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所)

高致病性禽流感在世界范圍內(nèi)的家禽和野鳥(niǎo)中廣泛流行[1]，給我國(guó)的養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的損失。當(dāng)前我國(guó)家禽H5亞型禽流感主要流行H5N6亞型，少量H5N1亞型，偶爾分離到H5N3、H5N8和H5N2等，在野鳥(niǎo)和鴨上H5N8的發(fā)生呈增多趨勢(shì)，病毒HA基因進(jìn)化分支有3個(gè)，主要流行的是呈全國(guó)性分布的2.3.4.4d分支，其次為在不同區(qū)域的省份出現(xiàn)的2.3.2.1d分支，個(gè)別病毒屬于野鳥(niǎo)分支。H7亞型禽流感流行主要以H7N9為主，偶爾分離出H7N8、H7N7、H7N3和H7N2等亞型，病毒HA基因分為以雞為主的H7N9分支和鴨源H7病毒，H7N9病毒隨時(shí)間出現(xiàn)了不同的小分支[1-3]。為有效防控高致病性禽流感，我國(guó)采取了強(qiáng)制免疫政策。2020年，農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)了針對(duì)高致病性禽流感病毒的最新疫苗“重組禽流感(H5+H7)三價(jià)滅活苗(H5N1 Re-11株+Re-12株，H7N9 H7-Re3株)”和“重組禽流感(H5+H7)三價(jià)滅活苗(H5N2 rSD57株+rFJ56株，H7N9 rLN79株)”。為了解浙江平湖市規(guī)模雞場(chǎng)禽流感防控現(xiàn)狀及免疫情況，本課題組對(duì)部分養(yǎng)雞場(chǎng)做了問(wèn)卷調(diào)查，并對(duì)其中部分雞場(chǎng)進(jìn)行了高致病性禽流感免疫抗體水平和病原學(xué)檢測(cè)，另選擇某雞場(chǎng)開(kāi)展政府采購(gòu)重組禽流感病毒(H5+H7)三價(jià)滅活苗(H5N1 Re-11株、Re-12株和H7N9 H7-Re3株)免疫試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1問(wèn)卷調(diào)查 通過(guò)問(wèn)卷調(diào)查的形式，對(duì)8戶規(guī)模雞場(chǎng)進(jìn)行了問(wèn)卷調(diào)查，分別編號(hào)肉雞1、肉雞2至肉雞8。

1.2血清學(xué)和病原學(xué)檢測(cè) 全血樣品來(lái)自8個(gè)使用重組禽流感病毒(H5+H7)三價(jià)滅活苗(H5N1 Re-11株Re-12株 H7N9 H7-Re3株)免疫的養(yǎng)禽場(chǎng)，在免疫后30 d以上采集，每場(chǎng)采集30份，共分離血清239份，同時(shí)采集210份咽喉和泄殖腔拭子。

1.3免疫試驗(yàn)

1.3.1試驗(yàn)疫苗 政府采購(gòu)重組禽流感病毒(H5+H7)三價(jià)滅活苗(H5N1 Re-11株、Re-12株和H7N9 H7-Re3株)，哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司生產(chǎn)，批號(hào)202041，生產(chǎn)日期20200906。

1.3.2試驗(yàn)方法 試驗(yàn)用雞來(lái)自浙江省平湖市新埭鎮(zhèn)某養(yǎng)雞場(chǎng)，27日齡快速型黃羽肉雞120羽。免疫前先測(cè)定雞群高致病性禽流感母源抗體水平。隨機(jī)選擇60羽進(jìn)行重組禽流感病毒(H5+H7)三價(jià)滅活苗一次免疫試驗(yàn)，雞右側(cè)胸部肌肉注射疫苗0.5 mL/羽，于免疫后14 d、28 d、42 d采血進(jìn)行抗體監(jiān)測(cè)。另?yè)?0羽進(jìn)行重組禽流感病毒(H5+H7)三價(jià)滅活苗二次免疫試驗(yàn)， 首免27日齡，間隔30 d加強(qiáng)免疫一次，雞右側(cè)胸部肌肉注射疫苗0.5 mL/羽，首免后14 d、28 d和二免后14 d、28 d、42 d采血進(jìn)行抗體監(jiān)測(cè)。

1.4檢測(cè)方法 依據(jù)《高致病性禽流感診斷技術(shù)》(GB/T 18936-2020)，采用HA和HI試驗(yàn)，對(duì)H5和H7亞型免疫抗體進(jìn)行檢測(cè)和結(jié)果判定。HI抗體滴度≥42為免疫抗體合格，群體陽(yáng)性率≥70%為合格。病原學(xué)檢測(cè)采用禽流感病毒通用熒光RT-PCR檢測(cè)。

1.5診斷試劑 禽流感病毒H7亞型血凝抑制試驗(yàn)抗原(H7-Re3株)、禽流感病毒H5亞型血凝抑制試驗(yàn)抗原(H5N1 Re-11株和Re-12株)和陽(yáng)性血清均由哈爾濱維科生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)分別為：2021001、2019009、2019007。禽流感病毒通用型熒光 RT-PCR檢測(cè)試劑盒(B盒)，哈爾濱國(guó)生生物科技股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：20200820。

2 結(jié)果

2.1問(wèn)卷調(diào)查

2.1.1養(yǎng)殖戶基本情況 本次調(diào)查的8個(gè)雞場(chǎng)均是家庭飼養(yǎng)場(chǎng)，雞場(chǎng)場(chǎng)主全部是男性，年齡45-59歲4人占50%，18-44歲3人占37.5%，60-69歲1人占12.5%。文化程度小學(xué)或初中學(xué)歷4人占50%，高中或中專(zhuān)學(xué)歷2人占25%，沒(méi)上過(guò)學(xué)和大專(zhuān)及以上各為1人，分別占12.5%。從事養(yǎng)雞5-15年5人占62.5%，5年以下2人占25%，15年以上1人占12.5%。

2.1.2養(yǎng)殖規(guī)模 8個(gè)雞場(chǎng)均是飼養(yǎng)肉雞，年出欄肉雞1萬(wàn)-5萬(wàn)羽占37.5%，10萬(wàn)羽以上和1萬(wàn)羽以下各占25%，5-10萬(wàn)羽的12.5%。雞場(chǎng)死淘率2%-5%為5個(gè)占62.5%，5%-8%為2個(gè)占25%，15%以上為1個(gè)占12.5%。

2.1.3雞場(chǎng)防疫條件 本次調(diào)查的8個(gè)雞場(chǎng)周邊500 m內(nèi)有村民住房集聚區(qū)，3個(gè)雞場(chǎng)周邊500 m內(nèi)有養(yǎng)禽場(chǎng)。除了1個(gè)雞場(chǎng)門(mén)口有消毒池，8個(gè)雞場(chǎng)幾乎沒(méi)有生物安全防護(hù)措施，場(chǎng)內(nèi)無(wú)門(mén)禁、圍欄圍墻等物理隔離設(shè)施，門(mén)口缺乏消毒池或消毒墊，進(jìn)場(chǎng)無(wú)洗澡更衣、更換膠鞋等專(zhuān)門(mén)區(qū)域。4個(gè)雞場(chǎng)的生產(chǎn)區(qū)和生活辦公區(qū)隔開(kāi)，1個(gè)雞場(chǎng)的供料道與出糞道分開(kāi)，各養(yǎng)殖棟舍出入口均未設(shè)有消毒墊。4個(gè)雞場(chǎng)的進(jìn)場(chǎng)車(chē)輛、外來(lái)人員需要消毒，5個(gè)雞場(chǎng)采取定期全場(chǎng)噴霧消毒或石灰撒播。8個(gè)雞場(chǎng)均未設(shè)專(zhuān)門(mén)的獸醫(yī)診斷室和配備體溫計(jì)、常規(guī)解剖器械等診療工具，6個(gè)雞場(chǎng)配有疫苗存儲(chǔ)專(zhuān)用冰箱。

2.1.4禽流感臨床知識(shí) 本次調(diào)查8個(gè)雞場(chǎng)場(chǎng)主對(duì)高致病性禽流感臨床癥狀知曉率，知曉腳鱗出血、雞冠出血或發(fā)紺、頭部和面部水腫發(fā)紫的5個(gè)占62.5%，知曉急性發(fā)病死亡、神經(jīng)癥狀的4個(gè)占50%，知曉肌肉和其他組織器官?gòu)V泛性嚴(yán)重出血的2個(gè)占25%，知曉綠色稀便2個(gè)占25%。

2.1.5禽流感免疫 8個(gè)雞場(chǎng)均進(jìn)行了重組禽流感病毒(H5+H7)三價(jià)滅活疫苗(H5N1 Re-11株、Re-12株和H7N9 H7-Re3株)免疫，4個(gè)雞場(chǎng)進(jìn)行雞新城疫、禽流感(H9亞型)二聯(lián)滅活疫苗免疫，另1個(gè)雞場(chǎng)進(jìn)行雞新城疫、傳染性支氣管炎、禽流感(H9亞型)三聯(lián)滅活疫苗免疫。使用的禽流感疫苗來(lái)自哈藥集團(tuán)、青島易邦的5個(gè)，來(lái)自肇慶華農(nóng)、湖南中岸的各1個(gè)。8個(gè)雞場(chǎng)均開(kāi)展禽流感免疫抗體檢測(cè)，且對(duì)免疫效果滿意。免疫程序多樣化：10日齡首免+20日齡二免，7日齡首免+30日齡二免，9日齡首免+30日齡二免，10日齡首免+30日齡二免，15日齡首免+30日齡二免。免疫劑量或按說(shuō)明書(shū)推薦或比推薦劑量增加0.5倍。8個(gè)雞場(chǎng)對(duì)家禽疫苗免疫注意事項(xiàng)及具體操作熟練掌握且認(rèn)真執(zhí)行，對(duì)本市的高致病性禽流感防控政策表示滿意。

2.1.6雞場(chǎng)盈利 各雞場(chǎng)盈利水平不一，肉雞平均盈利高的5-6元/羽，低的2-3元/羽，甚至虧損5元/羽。

2.2血清學(xué)和病原學(xué)檢測(cè)

由表1可以看出8個(gè)肉雞場(chǎng)的禽流感H5 亞型(Re-11株、Re-12株)及 H7 亞型(Re-3株)免疫抗體合格率均大于70%，達(dá)到國(guó)家規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)，免疫效果較好。210份咽喉和泄殖腔拭子使用禽流感通用熒光 RT-PCR 試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均未檢測(cè)到禽流感病原學(xué)陽(yáng)性樣品。

表1 雞場(chǎng)的禽流感免疫抗體檢測(cè)結(jié)果

2.3免疫試驗(yàn)結(jié)果 27日齡時(shí)試驗(yàn)雞群H5亞型Re-12株和H7-Re3株母源抗體完全消失，H5亞型Re-11株母源抗體的平均滴度為0.682，基本消失。首免14 d后3個(gè)疫苗株的免疫抗體平均滴度達(dá)62以上，到28 d時(shí)3個(gè)疫苗株的免疫抗體平均滴度達(dá)到高峰，均在92以上。二免14 d后3個(gè)疫苗株的免疫抗體平均滴度經(jīng)過(guò)短暫小幅下降后上升至高峰水平。

表2 禽流感免疫后抗體消長(zhǎng)規(guī)律

3 分析

問(wèn)卷調(diào)查結(jié)果顯示，半數(shù)以上養(yǎng)殖戶年齡偏大、文化程度偏低，數(shù)字畜牧應(yīng)用系統(tǒng)養(yǎng)殖管理使用、智能手機(jī)養(yǎng)殖APP操作困難，嚴(yán)重影響數(shù)字化畜牧業(yè)養(yǎng)殖檔案電子臺(tái)帳推行。有的肉雞場(chǎng)生物安全防控體系薄弱，沒(méi)有設(shè)立門(mén)崗、管理制度嚴(yán)格控制雞場(chǎng)與外界人流、物流，盡管有一套自己的免疫程序和消毒方法，基本做到單一品種飼養(yǎng)、全進(jìn)全出、不同批次間清欄消毒空置凈化雞舍，但考慮經(jīng)濟(jì)因素較多，會(huì)根據(jù)周邊疫病流行情況、市場(chǎng)行情來(lái)調(diào)整，執(zhí)行時(shí)可能存在不徹底、不規(guī)范。本調(diào)查發(fā)現(xiàn)各規(guī)模雞場(chǎng)禽流感病毒(H5+H7)三價(jià)滅活疫苗首免日齡7-10日齡、15日齡、30日齡均有，所用免疫程序比較混亂。臨床上血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果8個(gè)肉雞場(chǎng)的禽流感H5 亞型(Re-11株、Re-12株)及 H7 亞型(Re-3株)免疫抗體合格率均大于70%，達(dá)到國(guó)家規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)，可能與采樣時(shí)間距離末次免疫時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān)。8個(gè)肉雞場(chǎng)的禽流感病原學(xué)陰性說(shuō)明雞群未受野毒感染。

免疫試驗(yàn)結(jié)果表明27日齡肉雞H5N1Re-11、H5N1Re-12、H7N9 H7-Re3三種母源抗體基本消失，這與劉婷婷[4]等研究結(jié)果相似。說(shuō)明禽流感病毒(H5+H7)三價(jià)滅活疫苗的首免日齡不要晚于27日齡，否則會(huì)增加野毒感染風(fēng)險(xiǎn)。重組禽流感病毒(H5+H7)三價(jià)滅活苗首免、二免后雞群H5N1 Re-11、H5N1 Re-12、H7N9 H7-Re3三種抗體的整體消長(zhǎng)趨勢(shì)基本同步。

本研究中8個(gè)規(guī)模雞場(chǎng)血清學(xué)結(jié)果和小群免疫試驗(yàn)結(jié)果顯示，重組禽流感病毒(H5+H7)三價(jià)滅活苗(H5N1 Re-11株Re-12株 H7N9 H7-Re3株)是有效的，60日齡出欄肉雞禽流感免疫一次，100日齡出欄肉雞需在首免30 d后加強(qiáng)免疫一次，這樣出欄檢測(cè)時(shí)肉雞具有較高的抗體效價(jià)，能有效的降低雞群感染H5和H7亞型禽流感病毒的風(fēng)險(xiǎn)。