唐蘭如，王俏，劉文錦，劉紅，陳勇

(中藥生物技術(shù)湖北省重點實驗室，藥物高通量篩選技術(shù)國家與地方聯(lián)合工程研究中心，湖北 武漢 430062)

0 引言

脈君安片是由武漢中聯(lián)藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)的中藥成方制劑，處方含有鉤藤、氫氯噻嗪和葛根，具有平肝熄風(fēng)、解肌止痛的功效，臨床用于治療高血壓癥、頭痛眩暈、頸項強(qiáng)痛、失眠心悸、冠心病[1-2].因處方工藝設(shè)計方面的缺陷，脈君安片需要頻繁服用且劑量大，患者依從性差，由此我們開發(fā)了服用劑量小、療效顯著、毒副作用小的濃縮型脈君安片，并獲得國家發(fā)明專利授權(quán)[3]. 此外，長期使用脈君安片會激活腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)和花生四烯酸細(xì)胞色素P450羥化代謝途徑，導(dǎo)致降壓抵抗作用[4]. 中醫(yī)認(rèn)為肝腎心三臟陰陽虛實的消長失衡均可引發(fā)高血壓病，且主要與肝臟有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)和厚樸酚能顯著抑制大鼠肝臟CYP2E1及CYP4A活性，進(jìn)而拮抗糖脂代謝紊亂狀態(tài)下肝臟的氧化應(yīng)激損傷[5]，厚樸總酚聯(lián)合脈君安片可以調(diào)節(jié)RAAS，改善血管內(nèi)皮功能，減輕內(nèi)臟器官的氧化應(yīng)激障礙，抑制CYP4A活性，從而抑制強(qiáng)縮血管物質(zhì)羥基二十碳四烯酸的體內(nèi)生成，改善降壓抵抗現(xiàn)象[6].因此我們以濃縮型脈君安片為基礎(chǔ)，增加了和厚樸酚，以期改善原方劑長期使用產(chǎn)生的降壓抵抗，增強(qiáng)體內(nèi)抗氧化應(yīng)激及抗炎能力.

大豆苷元是葛根的主要活性成分，可以治療冠心病和高血壓等疾病，對心腦血管疾病具有防治作用[7-8]；鉤藤堿是鉤藤的主要有效成分，具有降血壓、擴(kuò)張血管、抗心律失常、抗動脈粥樣硬化的藥理作用[9].因此我們以大豆苷元和鉤藤堿替代了濃縮型脈君安片中的葛根總黃酮和鉤藤總堿.大豆苷元、和厚樸酚的口服生物利用度低，臨床療效不理想[10-14]. 研究表明大豆苷元、和厚樸酚分別制備成長循環(huán)脂質(zhì)體可以促進(jìn)藥物的口服吸收，同時使其平緩釋放，延長藥物在體內(nèi)的駐留時間，減少服藥次數(shù)[15-17]. 因此我們設(shè)計并研制了大豆苷元與和厚樸酚復(fù)方長循環(huán)脂質(zhì)體，再按處方劑量與氫氯噻嗪、鉤藤堿及相應(yīng)輔料壓制成片劑，制備加味脈君安脂質(zhì)體片劑，以期提高各成分的生物利用度，增強(qiáng)體內(nèi)抗氧化應(yīng)激及抗炎能力，改善原方劑長期使用產(chǎn)生的降壓抵抗.研究表明，脈君安片主要降壓活性成分的釋放與吸收同步性較差，導(dǎo)致無法實現(xiàn)整體協(xié)同作用[18-20].因此，本研究以體外釋放相似因子(f2)為指標(biāo)，考察了新方劑主要指標(biāo)成分和厚樸酚、大豆苷元、氫氯噻嗪與鉤藤堿的體外同步均勻釋放情況.

1 材料

1.1 主要試劑和厚樸酚(批號20131118，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，武漢泰凱塞科技有限公司)；大豆苷元(批號C06N6Y5504，質(zhì)量分?jǐn)?shù) ≥98%，上海源葉生物有限公司)；鉤藤堿(批號20170910，質(zhì)量分?jǐn)?shù) ≥ 98%，上海鼎瑞化工有限公司)；氫氯噻嗪(批號20160913，質(zhì)量分?jǐn)?shù) ≥ 98%，武漢泰凱瑟科技有限公司)；大豆磷脂酰膽堿(上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司)；脈君安片(批號170171，國藥集團(tuán)中聯(lián)藥業(yè)有限公司)；預(yù)膠化淀粉PC-10(批號7094，日本旭化成)；交聯(lián)聚維酮(批號03100269039，美國亞什蘭)；微晶纖維素(批號20141211，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；分析純氯仿(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(mPEG2000-DSPE)(批號B50845，上海東尚醫(yī)藥科技有限公司)；膽固醇(批號B41239，上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司)；色譜純甲醇(美國Tedia公司)；色譜純乙腈(美國Tedia公司)；屈臣氏蒸餾水；透析袋8000-14000(BioSharp公司).

1.2 主要儀器日本島津高效液相色譜儀(包括LC-20AD二元泵、SPD-20A紫外檢測器、CTO-20AC柱溫箱、SIL-20ACHT 自動進(jìn)樣器、LC-Solution 工作站)；美國Gilson P型移液器；Mettler Toledo公司MS105DU型半微量分析天平；Sigma公司2K15C型高速離心機(jī)；上海亞榮生化儀器RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；寧波新芝JY92-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)；北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司FD-1 A-50型冷凍干燥機(jī)；英國MALVEN 公司ZS90激光粒度分析儀；日本電子公司JEM-2100 (HR) 透射電子顯微鏡；北京國藥龍立科技有限公司DP30 A單沖式壓片機(jī)；天津天大天發(fā)ZRS-6G智能溶出試驗儀.

2 方法與結(jié)果

2.1 大豆苷元與和厚樸酚復(fù)方長循環(huán)脂質(zhì)體的制備采用薄膜-超聲分散法制備大豆苷元與和厚樸酚復(fù)方長循環(huán)納米脂質(zhì)體.按表1所示比列稱取成膜材料(大豆磷脂酰膽堿、膽固醇、mPEG2000-DSPE)，以及大豆苷元與和厚樸酚各6.23 mg(藥脂比為1∶10)，渦旋震蕩溶于50 mL氯仿-甲醇混合液(1∶4，V/V)中，在40 ℃及減壓條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)60 min(轉(zhuǎn)速為100 r/min)，使有機(jī)溶劑蒸發(fā)，直至茄形瓶內(nèi)壁形成一層薄膜.加入100 mL超純水(使磷脂濃度為0.1%)，于60 ℃下磁力攪拌，水化60 min.水化后的脂質(zhì)體于冰浴下超聲處理(80 W、180次)，均化后脂質(zhì)體混合液通過0.22 μm濾膜進(jìn)行整粒3次，制得大豆苷元與和厚樸酚復(fù)方長循環(huán)脂質(zhì)體混懸液.

表1 復(fù)方脂質(zhì)體的物質(zhì)組成與質(zhì)量比

2.2 加味脈君安脂質(zhì)體片劑的制備按大豆苷元∶和厚樸酚∶氫氯噻嗪∶鉤藤堿=40∶40∶11∶75比例(w/w)，量取大豆苷元與和厚樸酚復(fù)方長循環(huán)脂質(zhì)體混懸液，按表2所示處方比例加入氫氯噻嗪、鉤藤堿、處方量半量的稀釋劑預(yù)膠化淀粉和崩解劑交聯(lián)聚維酮，于-80 ℃下預(yù)凍3 h后冷凍干燥.凍干后的粉末再與剩余的稀釋劑、崩解劑和潤滑劑硬脂酸鎂充分混合，過16目篩后用10 mm沖模直接壓片，制得加味脈君安長循環(huán)脂質(zhì)體片劑(片重0.5 g).

表2 加味脈君安長循環(huán)脂質(zhì)體片劑的物質(zhì)組成與比例

按“2.3”節(jié)方法檢測片劑中大豆苷元、和厚樸酚、氫氯噻嗪和鉤藤堿含量.

2.3 含量測定方法的建立

2.3.1 色譜檢測條件 色譜柱為Phenomenex ODS C18分析柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)接保護(hù)柱(30 mm×10 mm，3 μm)，柱溫40 ℃；流動相為10 mmol/L乙酸銨水溶液(A)和甲醇(B)，梯度洗脫(0～4 min，20%～45%B；4～9 min，45%～85%B；9～11 min，85%～77%B；11～12 min，77%～20%B；12～14 min，20%B；檢測波長0～4 min為270 nm，4～9 min為235 nm，9～11 min為245 nm，11～14 min為294 nm)，流速為1 mL·min-1；進(jìn)樣量10 μL.

現(xiàn)如今，在環(huán)境工程建設(shè)發(fā)展過程當(dāng)中仍然存在著諸多的問題，是與整個城市規(guī)劃有著巨大的差距的，有一部分城市環(huán)境保護(hù)工程建設(shè)還是和國家所提出的要求有著一定的差距的，在污水處理和垃圾清理、城市綠化上還是有一定的發(fā)展空間的。在城市環(huán)境工程建設(shè)過程中，城市污水處理的問題較為嚴(yán)重，運(yùn)用的技術(shù)手段比較落后，設(shè)施建設(shè)比較落后，直接將工業(yè)污水和生活污水排放到河流當(dāng)中，不經(jīng)過科學(xué)的處理技術(shù)。

2.3.2 對照品和供試品溶液的制備 分別精密稱取氫氯噻嗪、大豆苷元、鉤藤堿、和厚樸酚標(biāo)準(zhǔn)品10.00 mg，甲醇溶解并定容至10 mL，作為對照品儲備液(1 mg/mL).取各物質(zhì)的對照品儲備液用甲醇稀釋，得到濃度為51.2、25.6、12.8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05 μg/mL的對照品溶液.

取制備好的加味脈君安長循環(huán)脂質(zhì)體片劑l片，置于50 mL燒杯中，加入適量蒸餾水，超聲處理30 min，使其完全崩解，且溶液不產(chǎn)生氣泡，移至50 mL容量瓶，定容，得供試品溶液.

2.3.3 線性關(guān)系考察 精密吸取氫氯噻嗪、大豆苷元、鉤藤堿、和厚樸酚1 mg/mL的對照品儲備液適量，用甲醇逐步稀釋成51.2、12.8、3.2、0.8、0.2、0.05 μg/mL系列溶液，按“2.3.1”項下色譜條件進(jìn)樣檢測，以各物質(zhì)的峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，以目標(biāo)藥物濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行線性回歸，各目標(biāo)藥物的線性回歸方程見表3，線性范圍為0.05～51.2 μg/mL.

表3 氫氯噻嗪、大豆苷元、鉤藤堿、和厚樸酚的線性回歸方程

2.3.4 方法專屬性 分別以空白脂質(zhì)體加壓片輔料混懸離心上清液，待測物對照品溶液離心上清液(10.24 μg/mL)和供試品混懸液離心上清液(10.24 μg/mL)按“2.3.1”項下色譜條件進(jìn)樣檢測，結(jié)果見圖1A、1B和1C. 結(jié)果表明處方中的輔料不干擾4種目標(biāo)藥物的測定，該方法專屬性良好.

1：氫氯噻嗪；2：大豆苷元；3：鉤藤堿；4：和厚樸酚A: 空白脂質(zhì)體加壓片輔料；B: 對照品溶液；C: 供試品溶液圖1 專屬性色譜圖

2.3.5 精密度與重復(fù)性試驗 用甲醇配制低、中、高(0.2、6.4、51.2 μg/mL)3個濃度的質(zhì)控工作液，每份平行測定6次.氫氯噻嗪、大豆苷元、鉤藤堿、和厚樸酚的RSD分別為0.99%、1.17%、1.22%、1.56%，表明該方法的精密度良好.

取供試品儲備液，用甲醇稀釋成低中高(0.2、6.4、51.2 μg/mL)3個濃度的供試品溶液，每份平行測定6次，氫氯噻嗪、大豆苷元、鉤藤堿、和厚樸酚的RSD分別為0.71%、0.96%、0.74%、0.72%，表明該方法重復(fù)性良好.

2.3.6 加樣回收率試驗 精密量取對照品供試液，加入空白脂質(zhì)體(含壓片輔料)，甲醇稀釋成濃度為低中高(0.2、6.4、51.2 μg/mL)3個濃度的供試品溶液各6份，離心取上清液測定. 氫氯噻嗪、大豆苷元、鉤藤堿、和厚樸酚的平均回收率分別為95.1%(RSD=2.2%)、98.4%(RSD=1.5%)、102.2%(RSD=1.7%)、95.3%(RSD=1.78%)，表明該方法滿足分析需求.

2.3.7 穩(wěn)定性試驗 精密量取供試品儲備液，用甲醇稀釋成低中高(0.2、6.4、51.2 μg/mL)3個濃度，離心取上清液作為供試品工作液(n=6)，分別在0、2、4、6、12和24 h進(jìn)樣分析，氫氯噻嗪、大豆苷元、鉤藤堿、和厚樸酚的平均RSD分別為1.32%、2.01%、1.71%、2.21%，表明供試品溶液穩(wěn)定.

脂質(zhì)體混懸液經(jīng)ZS90激光粒度分析儀測定，大豆苷元與和厚樸酚復(fù)方長循環(huán)脂質(zhì)體的平均粒徑為(172.433±1.401) nm，PDI為0.235±0.004，zeta電位為(-44.3±1.25) mV.脂質(zhì)體粒度分布見圖2，表明在該制備工藝條件下，所制備的復(fù)方脂質(zhì)體粒度分布窄，大小分布均勻.

圖2 大豆苷元與和厚樸酚復(fù)方長循環(huán)脂質(zhì)體的粒徑分布圖

將大豆苷元與和厚樸酚復(fù)方長循環(huán)脂質(zhì)體混懸液用純水稀釋10倍，用鑷子夾住銅網(wǎng)邊緣撈取脂質(zhì)體，室溫自然干燥后用磷鎢酸復(fù)染，待完全干燥后采用TEM(加速電壓200 kV；電子槍為 LaB6；分辨率為0.14 nm)，觀察微粒的形狀和結(jié)構(gòu)，見圖3.由圖所示，制備的大豆苷元與和厚樸酚復(fù)方長循環(huán)脂質(zhì)體為圓形或橢圓形，脂質(zhì)體大小基本均勻一致.

圖3 大豆苷元與和厚樸酚復(fù)方長循環(huán)脂質(zhì)體的TEM圖

2.5 片劑的體外累積釋放率與同步釋放相似性分析按照《中華人民共和國藥典》(2020版)四部“0931溶出度與釋放度測定法”規(guī)定[21]，采用漿法測定加味脈君安脂質(zhì)體片劑和市售脈君安片的體外釋放度.取上述片劑置于500 mL水中，槳轉(zhuǎn)速為100 r/min，水浴溫度為(37±0.5) ℃，分別于5、15、30、45、60、90、120、240、360、480、600、720、1 440 min取樣6 mL，并及時補(bǔ)充等溫度等體積的空白溶出介質(zhì).每個時間點的樣品經(jīng)12 000 r/min離心10 min后取上清液，按“2.3”項下方法檢測目標(biāo)物含量.

100%溶出量測定：取加味脈君安脂質(zhì)體片劑、市售脈君安片分別置于容量瓶中，加溶出介質(zhì)適量，超聲使完全崩解，加溶出介質(zhì)定容至500 mL，搖勻后取1 mL混懸液1 200 r/min離心10 min，取上清液測定目標(biāo)物含量，作為目標(biāo)物100%溶出量.

累積釋放率計算公式：

累計釋放率Q(%)=[V1×(C1+C2+…+Ci-1)+V2×Ci]/(V0×C0)×100%，

其中V1為每個時間點的取樣量，V2為溶出介質(zhì)體積，C1～Ci為每個時間點測得的物質(zhì)的濃度，V0為100%溶出時介質(zhì)的體積，C0為100%溶出時物質(zhì)的濃度.

采用相似因子法評價加味脈君安脂質(zhì)體片劑主要成分體外釋放的同步性.相似因子(f2)用如下公式計算：

f2=50×lg {[1+1/n∑(Rt-Tt)2]-1/2× 100}，

其中，Rt為參比樣品t時的釋放度，Tt為試驗樣品t時的釋放度，n為試驗取樣點.如果50≤f2≤100，表明兩制劑的釋放曲線在各個觀測點的平均差值不超過10%，釋放度曲線相似.f2值越接近100，兩條釋放曲線的相似度越高[22].

加味脈君安脂質(zhì)體片劑和市售脈君安片的體外累積釋放曲線見圖4所示.由圖可知，加味脈君安長循環(huán)脂質(zhì)體片劑在8 h大豆苷元、和厚樸酚、氫氯噻嗪和鉤藤堿的累積釋放率分別為90.3%，93.4%，100%和84.9%，24 h各組分的累積釋放率均為100%.市售脈君安片在1 h氫氯噻嗪、大豆苷元和鉤藤堿的累積釋放率分別為97.7%，87.2 %和99.7%，2 h各組分的累積釋放率均為100%.上述結(jié)果表明，與市售脈君安片相比，新制劑主要降壓活性成分的體外釋放緩慢，預(yù)期體內(nèi)具有一定的緩釋效果，更符合高血壓的用藥特征.

圖4 加味脈君安脂質(zhì)體片劑(A)及市售脈君安片(B)各組分累積釋放率曲線

加味脈君安脂質(zhì)體片劑各組分間的同步釋放相似因子見表4.表中結(jié)果顯示各組分之間同步釋放因子f2均大于50，表明該制劑中各組分在釋放介質(zhì)中的體外同步釋放情況較好，預(yù)期體內(nèi)將具有較好的協(xié)同降壓作用.

表4 加味脈君安脂質(zhì)體片劑各組分的同步釋放相似性

3 討論

大豆苷元屬于異黃酮化合物[23]，是脈君安片組方中葛根的主要效應(yīng)成分，因其較差的溶解特性和較低的滲透性[24]，口服吸收少，生物利用度低[11]，而和厚樸酚也存在體內(nèi)半衰期較短的缺點[25]，因此本研究先采用薄膜-超聲分散法將大豆苷元與和厚樸酚制備成復(fù)方長循環(huán)納米脂質(zhì)體，再與脈君安組方中的氫氯噻嗪和鉤藤堿混合后加入相應(yīng)的輔料制備成加味脈君安脂質(zhì)體片劑，預(yù)期可以改善效應(yīng)成分的胃腸道吸收、提高體內(nèi)生物利用度、減少服藥頻次，且由于和厚樸酚的加入，克服了市售脈君安長期使用易產(chǎn)生降壓抵抗的缺點，后續(xù)將設(shè)計一系列的體內(nèi)外試驗進(jìn)行驗證.

中藥制劑多組分的同步釋放與吸收是獲得系統(tǒng)整體協(xié)調(diào)作用、提高臨床療效的必要條件.加味脈君安脂質(zhì)體片劑中包括大豆苷元、鉤藤堿、和厚樸酚和氫氯噻嗪等多個組成，釋放的非同步勢必造成相互間的轉(zhuǎn)運(yùn)時差和起效時差，致使組分間的協(xié)調(diào)作用無法發(fā)揮. 因此，在進(jìn)行多個組分的長循環(huán)脂質(zhì)體制劑研究中，除了考察粒徑、包封率等重要理化指標(biāo)，還建立了相似因子法考察多組分的釋放，力求通過多組分同步釋放而平穩(wěn)地發(fā)揮原方的真實療效，以期達(dá)到中藥的整體、同步、綜合作用. 體外釋放度考察表明，加味脈君安脂質(zhì)體片劑各組分之間同步釋放因子f2均大于50，在釋放介質(zhì)中的體外同步釋放情況較好，且具有一定的緩釋效果，為今后的動物體內(nèi)藥代動力學(xué)實驗提供一定的數(shù)據(jù)和理論支持.