吳依松，李士偉，李昊舉，魏文龍，吳士飛，果德安*

基于UHPLC-MS/MS的鉤藤生物堿在大鼠體內(nèi)的組織分布研究

吳依松1, 2，李士偉1, 2，李昊舉2，魏文龍2，吳士飛2，果德安1, 2*

1. 長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長春 130117 2. 中國科學(xué)院上海藥物研究所 上海中藥現(xiàn)代化研究中心，中藥標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)國家工程研究中心，上海 201203

建立超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UHPLC-MS/MS）法測定大鼠不同組織中鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿、毛鉤藤堿、去氫毛鉤藤堿與縫籽嗪甲醚的含量，并用于鉤藤的組織分布研究。大鼠ig鉤藤水煎液后，分別于0.083、0.25、0.5、0.75、1、2、4、8、12 h取心、肝、脾、肺、腎、腦組織。以長春胺為內(nèi)標(biāo)，采用液液萃取法提取后進(jìn)行樣本檢測。建立的UHPLC-MS/MS方法中，7個(gè)生物堿在不同的組織中最低定量限范圍為0.05～1.00 ng，響應(yīng)與濃度的相關(guān)性2≥0.991。方法學(xué)考察中的專屬性、基質(zhì)效應(yīng)、回收率、精密度與準(zhǔn)確度以及穩(wěn)定性等方法學(xué)考察均滿足要求。各個(gè)組織中均為異鉤藤堿含量最高，其次為去氫鉤藤堿；異鉤藤堿與去氫鉤藤堿含量均遠(yuǎn)高于其對應(yīng)的異構(gòu)體鉤藤堿與異去氫鉤藤堿；而3個(gè)四環(huán)單萜吲哚生物堿（毛鉤藤堿、去氫毛鉤藤堿、縫籽嗪甲醚）在各組織中均含量最低。比較不同組織中生物堿成分含量可以發(fā)現(xiàn)，7個(gè)生物堿均在肝臟中含量最高，其次為腎臟與肺部，推測鉤藤生物堿在肝臟與腎臟的蓄積是因?yàn)閮烧叻謩e是生物堿成分的主要代謝部位與排泄部位。建立的方法靈敏度高、準(zhǔn)確性好、專屬性好，適用于大鼠不同組織中鉤藤生物堿的組織分布研究。

鉤藤；生物堿；鉤藤堿；異鉤藤堿；去氫鉤藤堿；異去氫鉤藤堿；毛鉤藤堿；去氫毛鉤藤堿；縫籽嗪甲醚；定量分析；組織分布

鉤藤為茜草科植物鉤藤(Miq.) Miq. ex Havil.、華鉤藤(Oliv.) Havil.、毛鉤藤Havil.、大葉鉤藤Wall.或無柄果鉤藤Roxb.的干燥帶鉤莖枝，其性味甘、涼，歸肝、心包經(jīng)，具有息風(fēng)定驚、清熱平肝的功效，臨床用于治療小兒驚啼、妊娠子癇、感冒夾驚、高熱驚厥、驚癇抽搐、肝風(fēng)內(nèi)動(dòng)、頭痛眩暈等癥狀[1]。鉤藤含有黃酮、生物堿、香豆素、三萜酸等多種成分，其中生物堿為主要活性成分[2-3]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，鉤藤具有降血壓[4-5]、鎮(zhèn)靜催眠和抗老年癡呆等作用[6-7]。

鉤藤的代謝研究主要集中于其中所含的生物堿成分，國內(nèi)王英峰等[8]最早開展了鉤藤藥動(dòng)學(xué)研究，結(jié)果顯示，小鼠ig鉤藤堿2 h后達(dá)到最高血藥濃度。目前鉤藤的組織分布研究，大多為生物堿單體的研究。例如以新西蘭大白兔為動(dòng)物模型，開展鉤藤堿在兔體內(nèi)的組織分布[9-10]，結(jié)果顯示鉤藤堿在家兔體內(nèi)吸收快、消除快、動(dòng)力學(xué)呈線性等特征；其他藥動(dòng)學(xué)與組織分布研究也表明，鉤藤堿的體內(nèi)過程具有吸收快、消除快的特點(diǎn)，且在肝臟、心臟、腦、肺組織、腎組織等器官中均有分布[11-12]。然而關(guān)于鉤藤的體內(nèi)組織分布研究較少，需要構(gòu)建高靈敏的多指標(biāo)含量測定方法用于體內(nèi)鉤藤生物堿的定量分析。

在中藥體內(nèi)的多成分定量研究中，常使用QqQ或Q-trap的多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式，待測物去溶劑化帶電后通過Q1對母離子進(jìn)行篩選，在碰撞池q2進(jìn)行二級碎裂，隨后在Q3中對子離子進(jìn)行篩選[13]，與其他方式比較，MRM模式對待測物具有較高的選擇性與靈敏度，已廣泛應(yīng)用于藥材中微量成分或體內(nèi)成分的定量研究。本研究構(gòu)建了超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UHPLC-MS/MS）方法用于定量分析不同組織中的7個(gè)生物堿，并應(yīng)用于鉤藤的體內(nèi)分布研究，明確鉤藤生物堿類的成分體內(nèi)分布規(guī)律，為鉤藤的藥物靶向治療提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材

鉤藤藥材為從市場購買，經(jīng)中國科學(xué)院上海藥物研究所中藥現(xiàn)代化中心姚帥高級實(shí)驗(yàn)師鑒定為茜草科植物鉤藤(Miq.) Miq. ex Havil.的干燥帶鉤莖枝，鉤藤樣本（樣本號20161202）儲存于中國科學(xué)院上海藥物研究所。

1.2 試藥與儀器

色譜級乙腈（批號UCNA1H）購自美國Honeywell公司；質(zhì)譜級氨水（批號H2119089）購自美國Sigma-Aldrich公司；醋酸乙酯（批號20200306）購自國藥試劑有限公司；去離子水由Millipore Alpha-Q純水制備系統(tǒng)制備獲得；對照品鉤藤堿、異鉤藤堿、異去氫鉤藤堿、去氫鉤藤堿、去氫毛鉤藤堿、毛鉤藤堿、縫籽嗪甲醚由本實(shí)驗(yàn)制備獲得，經(jīng)HPLC-UV檢測，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%；內(nèi)標(biāo)長春胺（批號8492）購自上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)有限公司。

Agilent 1290 infinityII串聯(lián)Agilent Triple Quad 6495（美國安捷倫科技公司），液相系統(tǒng)包括二元泵系統(tǒng)、樣品管理器與色譜柱管理器；IKA?VIBRAX VXR BS25型渦旋混勻儀（德國IKA公司）；2200型超聲波清洗儀（上海睿祺電子設(shè)備有限公司）；氮吹儀（美國Organomation Associates. Jnc公司）；BT25S型分析天平（德國Sartorius公司）。

1.3 動(dòng)物

SPF級Wistar雄性大鼠，7～8周齡，體質(zhì)量200～250 g，購自上海斯萊克動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，合格證號SYXK（滬）2020-0042。動(dòng)物于溫度20～24 ℃，相對濕度40%～70%，單向通風(fēng)環(huán)境，12 h光照循環(huán)環(huán)境中飼養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水。大鼠在實(shí)驗(yàn)前飼養(yǎng)1周適應(yīng)環(huán)境，正式實(shí)驗(yàn)前，禁食12 h不禁水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案通過中國科學(xué)院上海藥物所動(dòng)物管理委員會(huì)的許可（IACUC審批號2020-10-GDA-75）。

2 方法

2.1 對照品與鉤藤水提物的制備

精密稱定對照品鉤藤堿、異鉤藤堿、異去氫鉤藤堿、去氫鉤藤堿、去氫毛鉤藤堿、毛鉤藤堿、縫籽嗪甲醚和內(nèi)標(biāo)，用純乙腈溶解獲得1 mg/mL溶液備用。用純乙腈對對照品溶液進(jìn)行稀釋，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線不同質(zhì)量濃度點(diǎn)與質(zhì)控樣本的儲存液，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

稱取鉤藤藥材100 g，加入1 L去離子水，浸泡30 min后用武火煎煮至沸，轉(zhuǎn)文火煎煮30 min后濾過，獲得煎煮液，連續(xù)煎煮2次，合并煎煮液，減壓旋蒸濃縮后冷凍干燥，獲得鉤藤水煎液凍干粉。

2.2 給藥和樣品制備

鉤藤水煎液凍干粉用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液溶解。大鼠ig鉤藤水煎液（1 g/kg）后，分別于0.083、0.25、0.5、0.75、1、2、4 、8、12 h麻醉，腹主動(dòng)脈取血后，分別摘取心、肝、脾、肺、腎、腦組織，于液氮中淬滅后，于?80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

由于化合物在組織的整體空間分布情況不同，為盡可能降低取樣不均勻引起的誤差，故取樣為不同時(shí)間點(diǎn)下相同組織的同一部位，如心臟的心尖位置、腦的左側(cè)部分沿外側(cè)矢狀面切割、左腎的左下方位置、肝臟的三角葉部分等。精確稱定各組織100 mg，按照1∶5的比例加入生理鹽水勻漿6 min，每勻漿20 s間隔10 s，即得組織勻漿液。取組織勻漿液100 μL置于離心管中，加入5 μL內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋均勻后加入1 mL醋酸乙酯溶液，渦旋3 min后，14 000 r/min離心10 min，取900 μL上清液氮?dú)獯蹈?，隨后在離心管中加入100 μL乙腈復(fù)溶，超聲5 min，渦旋3 min，14 000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)樣。

精確稱定各空白組織，按照1∶5的比例加入生理鹽水進(jìn)行勻漿。取組織勻漿液95 μL加入5 μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液或質(zhì)控樣本溶液，然后加入5 μL內(nèi)標(biāo)溶液，其余操作同樣品制備方法，即得標(biāo)準(zhǔn)曲線與質(zhì)控樣本。

2.3 色譜與質(zhì)譜條件

2.3.1 色譜條件 Phenomenex Kinetex?EVO C18色譜柱為（100 mm×2.1 mm，2.6 μm），流動(dòng)相為0.1%氨水（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～0.1 min，10% B；0.1～5 min，10%～25% B；5～13 min，25%～40% B；13～15 min，40%～50% B；15～19 min，50%～95% B；19～22 min，95% B。柱溫35 ℃；體積流量0.4 mL/min。

2.3.2 質(zhì)譜條件 ESI源；正離子模式；數(shù)據(jù)采集模式為MRM模式。分別對待測物進(jìn)行離子對優(yōu)化，離子對參數(shù)見表1，其他參數(shù)為：干燥氣溫度200 ℃；霧化氣壓力35 psi（1 psi＝6.895 kPa）；干燥氣體積流量14 L/min；毛細(xì)管電壓4000 V；鞘氣溫度250 ℃；鞘氣體積流量11 L/min；噴嘴電壓500 V。儀器控制、質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化、數(shù)據(jù)采集與數(shù)據(jù)后處理使用Agilent Masshunter Workstation Software 9.0軟件。

表1 MRM定量用質(zhì)譜參數(shù)

Table 1 Parameters of mass spectrometer for MRM

對照品母離子(m/z)子離子(m/z)駐留時(shí)間/min碎裂電壓/V碰撞能/eV加速電壓/V 去氫鉤藤堿383.2160.1110380414 異去氫鉤藤堿383.2108.1110380374 鉤藤堿385.2353.2110380254 異鉤藤堿385.2160.1110380414 去氫毛鉤藤堿367.2144.0110380334 毛鉤藤堿369.2144.0110380374 縫籽嗪甲醚367.2144.0110380334 內(nèi)標(biāo)355.2337.1110380174

2.4 方法學(xué)考察

根據(jù)FDA生物分析方法驗(yàn)證指南的指導(dǎo)意見進(jìn)行LC-MS/MS定量的方法學(xué)考察[18]。通過各組織間基質(zhì)效應(yīng)比較，發(fā)現(xiàn)質(zhì)控樣本在不同基質(zhì)中無明顯的基質(zhì)效應(yīng)影響，在保證準(zhǔn)確度的前提下，隨機(jī)選取肝、心、腦3個(gè)組織進(jìn)行方法學(xué)考察。

2.4.1 專屬性考察 專屬性是指在相同保留時(shí)間范圍內(nèi)，空白基質(zhì)中相應(yīng)位置的空白峰面積應(yīng)小于待測物最低定量限（lower limit of quantification，LLOQ）的20%，內(nèi)標(biāo)小于5.0%。

2.4.2 基質(zhì)效應(yīng)與提取回收率 基質(zhì)效應(yīng)是指在生物樣品評價(jià)過程中，生物基質(zhì)對不同濃度點(diǎn)樣品的測定值濃度影響是否一致，其考察方法是比較3個(gè)不同質(zhì)量濃度的質(zhì)控溶液在含有和不含有基質(zhì)的樣本中檢測結(jié)果之間的差異。

提取回收率是指在樣本處理過程中，在樣本提取前后加入質(zhì)控樣本，比較不同濃度點(diǎn)差異變化。

2.4.3 精密度與準(zhǔn)確度考察 精密度與準(zhǔn)確度包括日內(nèi)精密度、日內(nèi)準(zhǔn)確度、日間精密度與日間準(zhǔn)確度，用于考察儀器的穩(wěn)定性。日內(nèi)精密度與準(zhǔn)確度是比較在連續(xù)進(jìn)樣的情況下，不同濃度點(diǎn)的組內(nèi)值變化大小以及與理論值的差異大小，包括LLOQ、低濃度質(zhì)控（lower quantity control，LQC）、中間濃度質(zhì)控（middle quantify control，MQC）與高濃度質(zhì)控（high quantity control，HQC）4個(gè)部分，LQC、MQC、HQC組內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）應(yīng)小于15%，LLOQ組內(nèi)RSD應(yīng)小于20%，質(zhì)控樣本與理論值的相對偏差（relative error，RE）應(yīng)小于15%。

日間精密度與日間準(zhǔn)確度是考察連續(xù)3 d進(jìn)樣的測量值之間的變化以及與理論值的偏差，要求連續(xù)3 d 3個(gè)質(zhì)控樣本的RSD應(yīng)小于15%，LLOQ的RSD應(yīng)小于20%，不同質(zhì)控樣本的RE應(yīng)小于15%。

2.4.4 穩(wěn)定性考察 穩(wěn)定性考察包括室溫4 h穩(wěn)定性、自動(dòng)進(jìn)樣器24 h（4 ℃）穩(wěn)定性、凍融3個(gè)循環(huán)穩(wěn)定性（?20 ℃）和短期穩(wěn)定性（?20 ℃放置7 d）?？疾旆绞綖閷⒖瞻捉M織均漿液分別與不同濃度質(zhì)控樣本進(jìn)行混合，加入內(nèi)標(biāo)溶液后混勻分別于室溫放置4 h、?20 ℃放置1周以及凍融3個(gè)循環(huán)，凍融循環(huán)每次大于12 h，自動(dòng)進(jìn)樣器穩(wěn)定性為質(zhì)控樣本處理完成提取、吹干和復(fù)溶等過程后置于自動(dòng)進(jìn)樣器24 h進(jìn)樣。各濃度點(diǎn)的RE應(yīng)小于15%，組內(nèi)RSD應(yīng)小于15%。

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)考察

3.1.1 線性范圍 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與質(zhì)譜檢靈敏度確定定量線性范圍，線性結(jié)果見表2。在除肝臟組織以外，異去氫鉤藤堿與異鉤藤堿在不同組織中的線性范圍為1～2500 ng/mL，異去氫鉤藤堿與鉤藤堿的線性范圍為0.5～1250 ng/mL，去氫毛鉤藤堿、毛鉤藤堿和縫籽嗪甲醚的線性范圍為0.05～125 ng/mL。在肝組織中，去氫鉤藤堿與異鉤藤堿的線性范圍為1～5000 ng/mL，異去氫鉤藤堿與鉤藤堿的線性范圍為0.5～2500 ng/mL，去氫毛鉤藤堿、毛鉤藤堿和縫籽嗪甲醚的線性范圍為0.05～250 ng/mL。

表2 不同組織中7個(gè)成分的回歸方程與線性范圍

Table 2 Linear range and regression equation of seven alkaloids in different tissue

組織成分線性方程R2線性范圍/(ng·mL?1)LLOQ/(ng·mL?1) 心異去氫鉤藤堿y＝2.523 446 x＋0.006 2150.9920.5～1 250.00.50 去氫鉤藤堿y＝0.701 396 x＋0.000 56720.9931.0～2 500.01.00 鉤藤堿y＝3.018 928 x＋0.032 6720.9940.5～1 250.00.50 異鉤藤堿y＝1.503 035 x＋0.057 9480.9951.0～2 500.01.00 去氫毛鉤藤堿y＝2.712 177 x－0.010 6040.9910.05～125.000.05 縫籽嗪甲醚y＝2.504 551 x－0.012 4650.9930.05～125.000.05 毛鉤藤堿y＝1.761 823 x－0.007 270.9920.05～125.000.05 肝異去氫鉤藤堿y＝4.996 761 x－0.057 1760.9960.5～2 500.00.50 去氫鉤藤堿y＝0.721 232 x＋0.004 0830.9951.0～5 000.01.00 鉤藤堿y＝3.091 612 x＋0.007 5770.9960.5～2 500.00.50 異鉤藤堿y＝3.260 915 x?0.005 660.9961.0～5 000.01.00 去氫毛鉤藤堿y＝1.155 277 x?0.003 3090.9930.05～250.000.05 縫籽嗪甲醚y＝1.738 354 x＋0.001 9450.9920.05～250.000.05 毛鉤藤堿y＝1.288 939 x＋0.004 8030.9930.05～250.000.05 脾異去氫鉤藤堿y＝2.070 328 x－0.022 4420.9930.5～1 250.00.50 去氫鉤藤堿y＝0.570 833 x－0.012 7930.9911.0～2 500.01.00 鉤藤堿y＝2.720 595 x－0.037 110.9920.5～1 250.00.50 異鉤藤堿y＝1.283 3 x－0.024 9050.9921.0～2 500.01.00 去氫毛鉤藤堿y＝3.192 123 x－0.003 1790.9920.05～125.000.05 縫籽嗪甲醚y＝2.500 705 x－0.003 7880.9930.05～125.000.05 毛鉤藤堿y＝1.954 904 x＋0.002 2180.9960.05～125.000.05 肺異去氫鉤藤堿y＝2.608 458 x＋0.030 2740.9940.5～1 250.00.50 去氫鉤藤堿y＝0.726 214 x＋0.010 5010.9961.0～2 500.01.00 鉤藤堿y＝2.922 682 x＋0.047 6190.9940.5～1 250.00.50 異鉤藤堿y＝1.590 665 x＋0.059 3090.9931.0～2 500.01.00 去氫毛鉤藤堿y＝3.645 983 x－0.002 4640.9920.05～125.000.05 縫籽嗪甲醚y＝2.857 352 x－0.008 0490.9930.05～125.000.05 毛鉤藤堿y＝2.260 964 x＋0.003 0810.9940.05～125.000.05 腎異去氫鉤藤堿y＝3.102 039 x－0.053 7780.9950.5～1 250.00.50 去氫鉤藤堿y＝0.830 579 x－0.034 5250.9921.0～2 500.01.00 鉤藤堿y＝3.806 784 x－0.055 5670.9930.5～1 250.00.50 異鉤藤堿y＝0.922 039 x－0.067 7960.9921.0～2 500.01.00 去氫毛鉤藤堿y＝4.049 22 x－0.009 8230.9930.05～125.000.05 縫籽嗪甲醚y＝2.952 23 x－0.009 2610.9930.05～125.000.05 毛鉤藤堿y＝2.471 191 x－0.004 5970.9950.05～125.000.05 腦異去氫鉤藤堿y＝3.085 289 x－0.032 5770.9960.5～1 250.00.50 去氫鉤藤堿y＝0.662 539 x－0.019 2380.9971.0～2 500.01.00 鉤藤堿y＝3.439 665 x－0.041 070.9960.5～1 250.00.50 異鉤藤堿y＝1.289 731 x－0.017 1160.9961.0～2 500.01.00 去氫毛鉤藤堿y＝1.640 211 x－0.003 3390.9910.05～125.000.05 縫籽嗪甲醚y＝1.201 973 x－0.001 4940.9930.05～125.000.05 毛鉤藤堿y＝0.863 487 x＋0.002 8430.9920.05～125.000.05

3.1.2 專屬性考察 心、肝、脾、肺、腎與腦組織待測物保留時(shí)間位置均無明顯色譜峰，表明方法專屬性較好（圖1）。分別在不同組織的線性最高點(diǎn)后進(jìn)樣空白，空白中均未發(fā)現(xiàn)7個(gè)生物堿和內(nèi)標(biāo)，表明該方法無殘留效應(yīng)。

3.1.3 基質(zhì)效應(yīng)與回收率 選取心、腦、肝3個(gè)組織進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)與回收率考察，結(jié)果如表3、4所示，在3個(gè)組織中，7個(gè)生物堿的基質(zhì)效應(yīng)為86.43%～118.85%，均在可接受范圍內(nèi)；7個(gè)生物堿與內(nèi)標(biāo)的回收率為76.28%～99.37%，均在可接受范圍內(nèi)。

3.1.4 精密度與準(zhǔn)確度 選取心、腦、肝3個(gè)組織對鉤藤7個(gè)生物堿進(jìn)行精密度與準(zhǔn)確度進(jìn)行評價(jià)，結(jié)果如表5、6所示，7個(gè)生物堿的日內(nèi)精密度、日內(nèi)準(zhǔn)確度、日間精密度、日間準(zhǔn)確度均在接受范圍內(nèi)（±15%）。

RHY-鉤藤堿 IRHY-異鉤藤堿 ICOE-異去氫鉤藤堿 COE-去氫鉤藤堿 HTE-去氫毛鉤藤堿 HTI-毛鉤藤堿 GSM-縫籽嗪甲醚，下圖同

表3 生物堿在不同組織中基質(zhì)效應(yīng)

Table 3 Matrix effect of alkaloids in different tissues

成分心腦肝 LQC/%MQC/%HQC/%LQC/%MQC/%HQC/%LQC/%MQC/%HQC/% 異去氫鉤藤堿99.78101.04103.5087.0994.4895.7699.0286.4388.33 去氫鉤藤堿101.91110.6995.5395.43110.5999.29105.3797.3289.67 鉤藤堿104.52106.3993.1293.9799.1895.6998.6693.6189.80 異鉤藤堿103.29111.7999.1398.93110.14102.35105.6396.1992.05 去氫毛鉤藤堿107.02113.4896.43102.44105.68106.15106.88109.00106.45 縫籽嗪甲醚101.00112.0089.91109.23106.92113.76110.06106.83106.78 毛鉤藤堿105.22111.5897.83107.53118.85106.64104.67111.41104.30

表4 生物堿在不同組織中提取回收率

Table 4 Recovery of alkaloids in different tissues

成分心腦肝 LQC/%MQC/%HQC/%LQC/%MQC/%HQC/%LQC/%MQC/%HQC/% 異去氫鉤藤堿86.3683.1589.4783.3591.7399.3783.4384.7483.70 去氫鉤藤堿93.9383.3988.0580.8890.1087.0283.1282.9589.20 鉤藤堿88.5883.2786.4481.2490.3985.4083.1481.2488.29 異鉤藤堿92.2185.6484.7680.6791.4787.4782.5481.6579.42 去氫毛鉤藤堿97.7591.0090.0484.0596.9788.7692.3693.7284.16 縫籽嗪甲醚84.2397.5698.4086.3797.3088.7487.4792.8481.90 毛鉤藤堿94.1089.6993.9876.2895.8587.2691.3591.6985.22 內(nèi)標(biāo)89.3882.3782.9982.7892.1084.7980.9189.2886.32

表5 日內(nèi)精密度與準(zhǔn)確度

Table 5 Intra-day precision and accuracy

組織成分LLOQLQCMQCHQC 實(shí)測值/ (ng·mL?1)精密度/%準(zhǔn)確度/%實(shí)測值/ (ng·mL?1)精密度/%準(zhǔn)確度/%實(shí)測值/ (ng·mL?1)精密度/%準(zhǔn)確度/%實(shí)測值/ (ng·mL?1)精密度/%準(zhǔn)確度/% 心異去氫鉤藤堿0.50±0.023.410.921.49±0.031.74?0.6239.74±0.481.205.98980.69±46.414.73?1.93 去氫鉤藤堿1.09±0.032.928.832.82±0.196.77?7.9277.55±2.353.033.412 050.74±132.576.462.54 鉤藤堿0.52±0.012.043.581.41±0.064.03?7.7237.34±0.350.95?0.441 042.85±32.993.164.28 異鉤藤堿1.03±0.044.313.502.87±0.020.73?4.3373.71±1.291.75?1.722 056.86±57.312.792.84 去氫毛鉤藤堿0.05±0.002.481.830.14±0.019.09?7.673.58±0.123.27?4.65107.00±2.081.947.00 縫籽嗪甲醚0.05±0.004.31?0.930.13±0.014.70?12.073.58±0.154.15?4.60104.17±2.792.684.17 毛鉤藤堿0.05±0.005.230.530.14±0.0210.54?7.803.56±0.092.58?5.12107.74±2.252.097.74 腦異去氫鉤藤堿0.48±0.024.53?3.251.45±0.085.22?4.3940.36±2.987.397.621 064.49±41.883.936.45 去氫鉤藤堿1.00±0.022.31?0.492.96±0.248.14?0.1382.53±1.682.0310.032 170.42±33.111.538.52 鉤藤堿0.48±0.012.61?3.611.44±0.032.36?4.1939.50±2.075.245.341 057.85±41.323.915.79 異鉤藤堿1.01±0.033.191.402.93±0.186.32?1.0779.79±2.162.716.392 174.82±41.401.908.74 去氫毛鉤藤堿0.05±0.000.91?0.870.15±0.0211.32?1.153.99±0.4110.386.53108.14±1.901.768.14 縫籽嗪甲醚0.05±0.004.945.900.15±0.017.181.113.90±0.4210.913.88108.06±3.483.228.06 毛鉤藤堿0.04±0.003.88?10.730.13±0.014.15?10.403.83±0.4511.752.06107.18±2.622.457.18 肝異去氫鉤藤堿0.50±0.036.24?0.011.55±0.063.951.9453.56±2.875.35?2.621 869.11±89.34.78?6.54 去氫鉤藤堿1.08±0.043.318.042.96±0.092.99?1.93109.56±5.114.67?0.403 609.18±111.173.08?9.77 鉤藤堿0.55±0.023.1810.351.52±0.021.161.7453.22±2.815.28?3.231 806.96±61.753.42?9.65 異鉤藤堿0.87±0.022.55?13.372.83±0.103.42?5.56104.86±4.754.53?4.674 059.01±121.853.001.48 去氫毛鉤藤堿0.05±0.004.670.570.15±0.015.04?2.615.31±0.244.50?3.51205.84±6.713.262.92 縫籽嗪甲醚0.06±0.005.2611.030.15±0.002.191.395.19±0.234.38?5.55195.28±7.363.77?2.36 毛鉤藤堿0.06±0.002.5910.670.15±0.014.160.635.13±0.203.95?6.70198.26±8.084.08?0.87

3.1.5 穩(wěn)定性 選取心、腦、肝3個(gè)組織對鉤藤7個(gè)生物堿的穩(wěn)定性進(jìn)行考察，結(jié)果如表7～10所示，表明生物堿在不同儲存條件下[室溫4 h穩(wěn)定性、自動(dòng)進(jìn)樣器24 h（4 ℃）穩(wěn)定性、凍融3個(gè)循環(huán)穩(wěn)定性（?20 ℃）和短期穩(wěn)定性（?20 ℃放置7 d）]較為穩(wěn)定，均在±15%以內(nèi)。

3.2 檢測結(jié)果

基于構(gòu)建的定量方法對鉤藤給藥后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠心、肝、脾、肺、腎、腦組織中7個(gè)生物堿進(jìn)行了定量分析，結(jié)果如圖2所示。

文獻(xiàn)報(bào)道鉤藤中的主要成分為鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿和去氫鉤藤堿。藥動(dòng)學(xué)報(bào)道表明，大鼠ig鉤藤后血漿中異鉤藤堿含量最高，異鉤藤堿與鉤藤堿之間存在顯著差異[14-15]。組織分布結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)相對應(yīng)，可以觀察到在各個(gè)組織中均為異鉤藤堿含量最高，其次為去氫鉤藤堿；異鉤藤堿與去氫鉤藤堿均遠(yuǎn)高于其對應(yīng)的異構(gòu)體鉤藤堿與異去氫鉤藤堿；3個(gè)四環(huán)單萜吲哚生物堿（去氫毛鉤藤堿、毛鉤藤堿、縫籽嗪甲醚）在各組織中均含量最低。比較不同組織中生物堿成分含量可以發(fā)現(xiàn)，7個(gè)生物堿均在肝臟中含量最高，其次為腎臟與肺部，而相比較，腦中各生物堿的含量均比較低，推測是血腦屏障限制了生物堿進(jìn)入腦部，但是縫籽嗪甲醚在腦部的含量比其他成分高，可能是其發(fā)揮神經(jīng)系統(tǒng)作用的基礎(chǔ)。

表6 日間精密度與準(zhǔn)確度

Table 6 Inter-day precision and accuracy

組織成分LLOQLQCMQCHQC 實(shí)測值/ (ng·mL?1)精密度/%準(zhǔn)確度/%實(shí)測值/ (ng·mL?1)精密度/%準(zhǔn)確度/%實(shí)測值/ (ng·mL?1)精密度/%準(zhǔn)確度/%實(shí)測值/(ng·mL?1)精密度/%準(zhǔn)確度/% 心異去氫鉤藤堿0.52±0.035.573.681.50±0.031.780.1839.28±1.193.044.751 008.07±41.624.130.81 去氫鉤藤堿1.04±0.054.454.232.78±0.124.14?7.2077.55±1.842.373.412 104.02±90.94.325.20 鉤藤堿0.51±0.023.202.081.41±0.043.05?6.0937.86±0.832.200.951 037.75±23.112.233.78 異鉤藤堿1.00±0.044.01?0.022.83±0.082.71?5.5574.74±2.052.74?0.352 074.07±56.82.743.70 去氫毛鉤藤堿0.05±0.006.29?1.690.14±0.016.51-4.943.66±0.143.91?2.40107.75±3.022.807.75 縫籽嗪甲醚0.05±0.005.22?1.360.14±0.016.27?6.333.52±0.113.13?6.07106.03±2.732.576.03 毛鉤藤堿0.05±0.004.580.130.14±0.016.34?4.013.65±0.154.13?2.57108.35±2.402.218.35 腦異去氫鉤藤堿0.51±0.035.711.641.54±0.106.453.0039.93±2.065.176.481 080.18±28.692.668.02 去氫鉤藤堿1.01±0.032.700.722.99±0.165.27?0.2782.71±1.672.0210.282 152.59±84.273.917.63 鉤藤堿0.50±0.023.21?0.671.50±0.053.390.1839.68±2.025.095.811 059.46±48.644.595.95 異鉤藤堿1.01±0.022.451.493.00±0.144.55?0.0880.38±2.993.727.172 112.42±71.473.385.62 去氫毛鉤藤堿0.05±0.006.31?1.440.15±0.017.69?0.963.93±0.287.194.92107.94±3.603.337.94 縫籽嗪甲醚0.05±0.007.211.420.14±0.017.84?5.133.78±0.287.500.77107.21±3.393.177.21 毛鉤藤堿0.05±0.006.82?5.480.14±0.017.57?5.113.84±0.318.172.27107.12±4.103.827.12 肝異去氫鉤藤堿0.52±0.047.634.551.53±0.053.051.9755.86±3.355.991.561 836.61±117.056.37?8.17 去氫鉤藤堿1.05±0.087.625.243.00±0.103.47?0.03110.84±4.133.730.773 783.60±404.0610.68?5.41 鉤藤堿0.53±0.036.265.201.42±0.085.30?5.1254.25±2.204.05?1.361 809.92±68.083.76?9.50 異鉤藤堿0.98±0.099.11?2.062.95±0.134.57?1.56106.08±3.963.74?3.563 963.55±213.645.39?0.91 去氫毛鉤藤堿0.05±0.009.061.410.15±0.016.200.705.72±0.396.833.97209.41±14.586.964.71 縫籽嗪甲醚0.05±0.006.135.370.16±0.015.374.565.50±0.356.430.03201.12±17.078.490.56 毛鉤藤堿0.05±0.008.682.040.15±0.029.861.535.57±0.458.091.34205.65±19.319.392.83

表7 短期穩(wěn)定性 (室溫放置4 h)

Table 7 Stability within 4 h in room temperature

組織成分LQCMQCHQC 精密度/%準(zhǔn)確度/%精密度/%準(zhǔn)確度/%精密度/%準(zhǔn)確度/% 心異去氫鉤藤堿5.26?0.201.710.740.98?10.40 去氫鉤藤堿3.760.260.406.031.244.51 鉤藤堿2.111.671.597.361.334.72 異鉤藤堿2.165.063.697.552.315.49 去氫毛鉤藤堿4.562.172.556.000.378.17 縫籽嗪甲醚5.00?7.332.290.661.388.32 毛鉤藤堿7.692.393.1311.372.048.15 腦異去氫鉤藤堿2.157.562.597.441.359.83 去氫鉤藤堿1.91?1.081.628.062.156.65 鉤藤堿4.490.631.6511.251.0611.05 異鉤藤堿2.173.752.9111.352.649.25 去氫毛鉤藤堿6.61?6.289.10?2.695.287.95 縫籽嗪甲醚3.34?11.569.93?5.043.416.23 毛鉤藤堿4.19?12.805.37?9.144.866.25 肝異去氫鉤藤堿5.60?5.925.07?6.435.38?9.20 去氫鉤藤堿4.22?3.513.390.176.38?10.63 鉤藤堿2.46?7.652.98?3.027.46?10.15 異鉤藤堿5.00?6.233.12?2.968.83?1.61 去氫毛鉤藤堿2.28?12.694.83?9.578.48?6.86 縫籽嗪甲醚3.01?8.793.22?10.573.17?12.37 毛鉤藤堿6.235.523.63?9.795.29?9.64

表8 進(jìn)樣器穩(wěn)定性 (4 ℃放置24 h)

Table 8 Stability within 24 h in autosampler at 4 ℃

組織成分LQCMQCHQC 精密度/%準(zhǔn)確度/%精密度/%準(zhǔn)確度/%精密度/%準(zhǔn)確度/% 心異去氫鉤藤堿7.70?5.390.792.206.53?7.37 去氫鉤藤堿2.32?5.321.723.802.444.29 鉤藤堿0.99?3.351.704.382.827.04 異鉤藤堿0.74?1.921.58?0.313.345.69 去氫毛鉤藤堿2.455.796.437.881.556.24 縫籽嗪甲醚4.92?4.491.942.612.334.86 毛鉤藤堿3.335.802.896.140.978.10 腦異去氫鉤藤堿2.17?0.903.062.611.8511.16 去氫鉤藤堿2.130.022.598.632.1410.90 鉤藤堿1.145.682.5711.261.219.96 異鉤藤堿2.18?0.842.654.232.588.57 去氫毛鉤藤堿9.71?3.525.62?0.441.759.05 縫籽嗪甲醚3.28?6.524.76?0.582.506.74 毛鉤藤堿6.34 ?2.365.640.222.9910.65 肝異去氫鉤藤堿2.70?1.483.48?2.593.11?3.59 去氫鉤藤堿1.68?1.582.991.664.42?9.20 鉤藤堿3.63?3.583.440.164.78?6.82 異鉤藤堿2.33?7.683.19?4.915.94?3.01 去氫毛鉤藤堿5.302.495.31?4.7210.08?0.55 縫籽嗪甲醚3.566.055.04?0.4811.51?5.61 毛鉤藤堿3.935.553.00?3.779.83?3.43

表9 凍融3個(gè)循環(huán)穩(wěn)定性

Table 9 Stability in frozen-thawed cycle for three times

組織成分LQCMQCHQC 精密度/%準(zhǔn)確度/%精密度/%準(zhǔn)確度/%精密度/%準(zhǔn)確度/% 心異去氫鉤藤堿2.345.091.1510.990.789.79 去氫鉤藤堿3.891.771.567.451.0810.24 鉤藤堿1.770.731.116.890.443.22 異鉤藤堿1.59?2.772.537.781.106.92 去氫毛鉤藤堿4.16?9.290.63?8.120.988.90 縫籽嗪甲醚3.89?5.331.33?10.262.609.52 毛鉤藤堿5.21?4.210.87?9.731.258.87 腦異去氫鉤藤堿4.198.392.399.343.597.06 去氫鉤藤堿3.891.933.096.914.603.35 鉤藤堿2.730.642.450.792.69?2.17 異鉤藤堿3.058.834.049.693.544.78 去氫毛鉤藤堿3.5910.252.289.442.658.28 縫籽嗪甲醚3.257.733.826.181.788.18 毛鉤藤堿3.358.312.576.061.0410.17 肝異去氫鉤藤堿3.824.544.741.377.87?8.51 去氫鉤藤堿2.523.090.528.737.63?1.09 鉤藤堿2.040.822.134.457.85?4.11 異鉤藤堿3.369.351.103.3111.304.54 去氫毛鉤藤堿2.766.472.347.3711.121.54 縫籽嗪甲醚5.157.353.015.455.84?9.28 毛鉤藤堿2.987.591.629.1510.92?2.35

表10 長期穩(wěn)定性(?20℃放置7 d)

Table 10 Short-term stability at ?20 ℃ for 7 d

組織成分LQCMQCHQC 精密度/%準(zhǔn)確度/%精密度/%準(zhǔn)確度/%精密度/%準(zhǔn)確度/% 心異去氫鉤藤堿2.345.091.1510.990.789.79 去氫鉤藤堿3.891.771.567.451.0810.24 鉤藤堿1.630.661.587.230.443.22 異鉤藤堿2.58?1.082.537.781.106.92 去氫毛鉤藤堿4.16?9.290.95?8.281.038.94 縫籽嗪甲醚3.89?5.331.33?10.262.609.52 毛鉤藤堿5.21?4.210.98?9.781.258.87 腦異去氫鉤藤堿1.505.062.724.661.368.12 去氫鉤藤堿3.036.071.864.891.325.51 鉤藤堿0.29?1.522.30?2.941.31?2.75 異鉤藤堿2.189.081.687.362.275.46 去氫毛鉤藤堿1.719.631.598.081.728.90 縫籽嗪甲醚3.147.795.498.933.187.38 毛鉤藤堿2.3010.682.146.261.8812.47 肝異去氫鉤藤堿9.5712.492.832.842.961.48 去氫鉤藤堿4.134.387.88?5.477.26?5.27 鉤藤堿3.343.282.373.464.83?4.13 異鉤藤堿2.1110.870.902.475.411.91 去氫毛鉤藤堿5.573.951.308.834.318.62 縫籽嗪甲醚3.728.315.623.156.130.59 毛鉤藤堿2.863.481.0012.144.469.46

圖2 6個(gè)組織中不同生物堿含量(, n = 3)

各組織中生物堿濃度隨時(shí)間變化輪廓（圖3）與藥動(dòng)學(xué)相關(guān)研究的結(jié)果相似，ig鉤藤水煎液凍干粉15 min左右各組織即達(dá)到最高濃度（max），說明生物堿的吸收速率快，并能夠迅速達(dá)到各個(gè)組織。肝臟中部分生物堿在給藥1 h時(shí)含量出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，與肝臟比較，在心、脾、肺、腎中，部分生物堿成分（異鉤藤堿）濃度降低的速度較慢，兩者可能存在潛在的因果關(guān)系。在給藥12 h大多組織中的生物堿含量低于LLOQ，說明鉤藤生物堿在體內(nèi)能夠被迅速代謝。

4 討論

本研究建立了同時(shí)對鉤藤中7個(gè)主要吲哚生物堿的LC-MS/MS定量方法，采用具有較高的選擇性與靈敏度的MRM模式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，并應(yīng)用于大鼠體內(nèi)組織分布研究。本研究中使用的生物堿對照品溶解在乙腈溶劑中穩(wěn)定性良好，且長春胺作為常用內(nèi)標(biāo)同樣具有較好的穩(wěn)定性[19-20]。通過對多個(gè)組織進(jìn)行方法學(xué)考察更具可靠性，且結(jié)果顯示該方法下生物堿在各組織中的專屬性、基質(zhì)效應(yīng)、回收率、精密度與準(zhǔn)確度以及穩(wěn)定性均在可接受范圍內(nèi)，各成分在各組織中線性關(guān)系良好，說明該方法準(zhǔn)確可靠。大鼠ig鉤藤提取物后，分析不同時(shí)間下的心、肝、脾、肺、腎、腦組織中7個(gè)生物堿含量變化。從不同時(shí)間各組織生物堿含量變化方面分析，發(fā)現(xiàn)分布在6個(gè)組織中的多數(shù)生物堿能夠在1 h內(nèi)均快速達(dá)到最高濃度，表明生物堿能夠通過腸道-血液-組織的路徑快速轉(zhuǎn)移至各組織內(nèi)。隨后在給藥12 h后大多數(shù)組織中生物堿幾乎代謝完全（含量低于LLOQ），說明鉤藤生物堿具有吸收快、代謝快的特點(diǎn)。

圖3 6個(gè)組織中生物堿濃度隨時(shí)間變化輪廓(, n = 3)

從不同組織含量方面分析，生物堿主要在肝臟蓄積，尤其異鉤藤堿和去氫鉤藤堿含量最高，并在1 h內(nèi)含量持續(xù)分布較高，其次分布依次為肺＞腎＞脾＞心＞腦。比較不同組織中鉤藤生物堿的含量發(fā)現(xiàn)，7個(gè)生物堿均在肝臟中表達(dá)出最高的濃度含量，其次為腎，此結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果基本一致[10]，推測是因?yàn)楦闻K為生物堿的主要代謝部位，腎為排泄部位，在單體注射給藥的相關(guān)實(shí)驗(yàn)中也觀察到肺部的蓄積效應(yīng)，生物堿肺部的蓄積可能會(huì)引起不良反應(yīng)，臨床用藥時(shí)需要重點(diǎn)關(guān)注。而在腦中生物堿的含量基本低于LLOQ，雖然縫籽嗪甲醚在鉤藤藥材中含量較少，但是組織分布中仍能看到在腦中的分布，與文獻(xiàn)報(bào)道縫籽嗪甲醚更容易入腦結(jié)果一致[16]，并且Yang等[17]發(fā)現(xiàn)縫籽嗪甲醚有較強(qiáng)的乙酰膽堿酯酶抑制活性，說明縫籽嗪甲醚能透過血腦屏障，可能是鉤藤發(fā)揮神經(jīng)系統(tǒng)作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，這為鉤藤生物堿可以對中樞神經(jīng)、腦缺血保護(hù)作用的藥理活性提供了一定的體內(nèi)數(shù)據(jù)支持，值得進(jìn)一步研究。鉤藤中7個(gè)主要生物堿的定量方法開發(fā)和組織分布研究，對鉤藤生物堿靶向給藥和體內(nèi)代謝研究具有一定的參考價(jià)值。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Tissues distribution of alkaloids fromin rats by UHPLC-MS/MS

WU Yi-song1, 2, LI Shi-wei1, 2, LI Hao-ju2, WEI Wen-long2, WU Shi-fei2, GUO De-an1, 2

1. College of Pharmacy, Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130117, China 2. Shanghai Research Center for Modernization of Traditional Chinese Medicine, National Engineering Research Center for TCM Standardization Technology, Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 201203, China

To establish an ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UHPLC-MS/MS) method for determination of contents of rhynchophylline (RHY), isorhynchophylline (IRHY), corynoxeine (COE), isocorynoxeine (ICOE), hirsutine (HTI), hirsuteine (HTE) and geissoschizine methyl ether (GSM) and applied for tissue distribution of.Rats were igdecoction, then heart, liver, spleen, lung, kidney and brain tissue were acquired at 0.083, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 2, 4, 8, 12 h. Vincamine was used as internal standard, samples were extracted by liquid-liquid extraction.For the established UHPLC-MS/MS method, minimum quantitative limits of seven alkaloids in different tissues ranged from 0.05 to 1.00 ng, and correlation between response and concentration was2≥ 0.991. The specificity, matrix effect, recovery rate, precision and accuracy and stability met the requirements. IRHY content was the highest in each tissue, followed by COE; Both IRHY and COE were much higher than their corresponding isomers (RHY and ICOE), while three tetracyclic monoterpene indole alkaloids (HTE, HTI and GSM) were the lowest in all tissues. Comparing the contents of alkaloids in different tissues, it was found that content of seven alkaloids was the highest in liver, followed by kidney and lung. The cause of accumulation was probably due to kidney and liver to be the main sites of metabolism and excretion.The established method has high sensitivity, good accuracy and specificity, which was suitable for tissue distribution study of alkaloids fromin different tissues of rats.

(Miq.) Miq. ex Havil.; alkaloids; rhynchophylline; isorhynchophylline; corynoxeine; isocorynoxeine; hirsutine; hirsuteine; geissoschizine methyl ether; quantitative analysis; tissue distribution

R285.5

A

0253 - 2670(2022)13 - 4035 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.13.017

2022-04-02

上海市青年科技英才揚(yáng)帆計(jì)劃資助項(xiàng)目（21YF1455800）

吳依松，碩士研究生，中藥化學(xué)研究方向。E-mail: wuys0828@163.com

果德安，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥化學(xué)與現(xiàn)代質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。Tel: (021)50271516 E-mail: daguo@simm.ac.cn

[責(zé)任編輯 李亞楠]