李心海，高 峰*，王 巖

（1.徐州生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 徐州 221000；2.江蘇漢羊牧業(yè)生態(tài)科技有限公司，江蘇 徐州 221000）

近年來(lái)，羊胚胎移植已在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用，尤其在引種和擴(kuò)繁等方面發(fā)揮著重要作用。在對(duì)供體羊進(jìn)行人工授精時(shí)，應(yīng)因地制宜，結(jié)合當(dāng)?shù)厣a(chǎn)條件。一般常用凍精和鮮精進(jìn)行人工授精，陰道授精、子宮頸口授精較為常見(jiàn)，利用腹腔鏡進(jìn)行子宮角、輸卵管授精很少見(jiàn)。因?yàn)殛幍朗诰⒆訉m頸口授精操作簡(jiǎn)便，不需要特殊器材設(shè)備，常規(guī)操作即可完成，而子宮角、輸卵管授精所需設(shè)備較多，價(jià)格不菲。此外，陰道授精、子宮頸口授精不需要對(duì)動(dòng)物做手術(shù)，而子宮角、輸卵管授精需要做手術(shù)，操作要求高，非專(zhuān)業(yè)人員無(wú)法完成。用凍精和鮮精對(duì)綿羊胚胎移植中供體進(jìn)行授精，會(huì)對(duì)供體所沖出的胚胎產(chǎn)生影響；采取不同部位輸精對(duì)綿羊胚胎移植中供體進(jìn)行授精，也會(huì)對(duì)供體所沖出的胚胎產(chǎn)生影響。為了選出最佳方案，使綿羊胚胎移植技術(shù)更加成熟，進(jìn)行本次試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 2020年4月在江蘇漢羊牧業(yè)生態(tài)科技有限公司養(yǎng)羊場(chǎng)選取160只約2歲齡、身體健康的母湖羊。試驗(yàn)前，B超檢查母羊是否懷孕，15 d后再檢查1次。母羊按組飼養(yǎng)，嚴(yán)格與公羊隔離。選取身體健康、體格健壯的種公羊采集鮮精。

1.1.2 試驗(yàn)藥品與儀器 試驗(yàn)藥品包括羊用陰道栓（CIDR，南非ZOETIS公司，每包20支，每支含0.3 g孕酮）、獸用孕馬血清（PMSG，寧波三生生物科技有限公司，1 000 IU/瓶）、促卵泡素（FSH，寧波三生生物科技有限公司，100 IU/瓶，4℃條件下保存）等，綿羊凍精購(gòu)自徐州市家畜良種站。

試驗(yàn)儀器包括沖胚管、母羊保定臺(tái)、恒溫水浴鍋、腹腔內(nèi)窺鏡，體視顯微鏡、開(kāi)膣器、子宮鉗、集精杯、手術(shù)剪、醫(yī)用噴壺、止血鉗、注射器、液氮罐、培養(yǎng)皿、手術(shù)刀片、手術(shù)架、醫(yī)用縫合線、留置針、鑷子、記號(hào)筆等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 飼養(yǎng)管理 試驗(yàn)綿羊以組為單位分欄舍飼。供體羊日糧配方為青貯玉米2.3 kg、干草1.0 kg、玉米0.23 kg、麩皮0.21 kg、豆粕0.16 kg、胡蘿卜0.6 kg。每天上午8點(diǎn)、下午5點(diǎn)各飼喂1次，置自動(dòng)飲水器飲水，羊自由舔食。種公羊加飼胡蘿卜和雞蛋，正常采精鮮精，并檢查精液品質(zhì)。

1.2.2 供體羊的處理 采用FSH+PMSG+PG法。在湖羊陰道內(nèi)埋植陰道栓，并記為第1天，在第11天下午肌注FSH，每隔12小時(shí)注射1次，連續(xù)注射7次。在第5次注射時(shí)，肌肉注射PMSG 200 IU/只。第14天取出陰道栓。

將母羊隨機(jī)分為8組，每組10只，凍精組分為Ⅰ組（陰道授精）、Ⅱ組（子宮頸口授精）、Ⅲ組（子宮角授精）、IV組（輸卵管授精）；鮮精組分為Ⅰ組（陰道授精）、Ⅱ組（子宮頸口授精）、Ⅲ組（子宮角授精）、IV組（輸卵管授精）。

1.2.3 人工授精

1.2.3.1 陰道授精。取栓后第2天對(duì)綿羊試情，對(duì)發(fā)情綿羊陰道輸精，每隔12小時(shí)進(jìn)行1次輸精，一直到發(fā)情結(jié)束，輸精次數(shù)不少于3次。輸精時(shí)，將母湖羊倒立保定，清洗陰門(mén)周?chē)⑾?，用開(kāi)膣器打開(kāi)陰道，將輸精槍插到陰道底部輸入精液。

1.2.3.2 子宮頸口。取栓后第2天對(duì)綿羊試情，對(duì)發(fā)情綿羊于子宮頸口輸精，每隔12小時(shí)進(jìn)行1次輸精，一直到發(fā)情結(jié)束，輸精次數(shù)不少于3次。輸精時(shí)，將母湖羊倒立保定，清洗陰門(mén)周?chē)⑾?，用開(kāi)膣器將陰道打開(kāi)，將輸精槍深入子宮頸口1.0～2.0 cm將精液輸入，授精完成后，在母羊股部拍擊一下，促進(jìn)子宮頸收縮，避免精液流出影響授精效果。

1.2.3.3 子宮角授精。撤栓后48 h進(jìn)行授精。授精前母湖羊禁食24 h，清理術(shù)部，將乳頭附近被毛剃除，碘酊、酒精先后消毒，在乳房附近一側(cè)用手術(shù)刀作1.0～2.0 cm縱行切口，將內(nèi)窺鏡伸入腹腔內(nèi)，尋找子宮角及卵巢，察看卵巢上紅體狀況；在另一側(cè)乳房對(duì)稱(chēng)部位再用手術(shù)刀切一縱行切口，使用子宮鉗固定子宮角，用自制輸精槍刺破靠近輸卵管的子宮角壁輸精。將手術(shù)器械一一取出，縫合腹壁，肌肉注射青鏈霉素，授精完成。

1.2.3.4 輸卵管授精。操作同子宮角授精，將子宮角用子宮鉗拉出腹腔，找到輸卵管，用回形針刺破輸卵管壁，用輸精槍注入精液。再用同樣的方法向另一側(cè)輸卵管內(nèi)注入精液，后將子宮角、輸卵管放入腹腔，縫合腹壁，肌肉注射青鏈霉素，授精完成。

1.2.4 授精后的管理 對(duì)母羊飼喂?fàn)I養(yǎng)豐富的日糧，密切注意母羊狀態(tài)，避免外來(lái)刺激。

1.3 胚胎的采集

授精后第6天對(duì)供體湖羊采卵。手術(shù)前對(duì)供體湖羊肌肉注射陸眠寧1 ml/只。在靠近乳房的腹部作一縱行切口，用食指和中指夾住子宮角并拉出腹腔外，用生理鹽水沖洗一下，用滅菌的回形針刺破子宮角壁，并從此處插入套管針，將針芯抽出，再用回形針刺破子宮角另一端，并在此處插入沖胚管。用注射器向沖胚管內(nèi)注入適量水，能夠?qū)⒆訉m角撐開(kāi)，但不能將子宮角壁撐破，在沖胚管的另一端用集卵皿收集胚胎。用注射器吸取生理鹽水從套管處注入進(jìn)行沖胚，并在沖胚管的末端收集沖胚液，然后用注射器將水囊的水抽完，從子宮角抽出沖胚管，沖洗子宮并放回腹腔，縫合腹壁，手術(shù)完成后肌肉注射陸醒寧1 ml，并肌肉注射青鏈霉素以防發(fā)生感染。

1.4 檢胚

將沖胚液靜置10 min，在室溫下用實(shí)體顯微鏡放大20倍檢胚。先用吸管吸取上清液并棄掉，再用吸管將胚胎轉(zhuǎn)移至另一培養(yǎng)皿中，反復(fù)尋找胚胎，將所有胚胎檢出。

1.5 胚胎檢查

體視顯微鏡放大20～30倍檢查胚胎的大小、色調(diào)、形態(tài)、均勻度、分裂程度、透明帶等，并對(duì)胚胎進(jìn)行質(zhì)量分級(jí)。A級(jí)：形態(tài)完整，卵裂球均勻?qū)ΨQ(chēng)，無(wú)碎片，細(xì)胞緊湊、光滑，透明帶正常；B級(jí)：形態(tài)完整，卵裂球輕微不對(duì)稱(chēng)，15%碎片，透明帶正常；C級(jí)：卵裂球不對(duì)稱(chēng)，30%碎片，胚胎輪廓粗糙、結(jié)構(gòu)松散，卵裂球間有大液泡，色調(diào)暗淡，游離細(xì)胞多；D級(jí)：胚胎未受精，細(xì)胞變性，出現(xiàn)較多碎片，胚胎發(fā)生退化。

1.6 計(jì)算胚胎受精率與胚胎正常發(fā)育率

胚胎受精率=受精胚胎數(shù)/沖出胚胎數(shù)×100%（1）可用胚胎率=可用胚胎/受精胚胎數(shù)×100%（2）

1.7 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2003軟件記錄試驗(yàn)數(shù)據(jù)并進(jìn)行整理，用SAS軟件中的PROC FREQ程序進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 凍精液對(duì)供體母羊沖胚的影響

由表1可知，用凍精液對(duì)供體母羊不同部位授精，對(duì)供體母羊沖胚有明顯影響。母羊陰道授精、子宮頸口授精、子宮角授精、輸卵管授精沖出胚胎數(shù)分別為131枚、128枚、133枚、126枚；受精胚胎數(shù)分別為31枚、37枚、82枚、74枚，受精率分別為23.67%、28.90%、61.65%、58.73%。凍精I(xiàn)組、II組與凍精Ⅲ組、IV組之間具有顯著性差異（P＜0.05）。受精胚胎中能正常使用的A、B級(jí)胚胎分別為18枚、22枚、58枚、53枚；凍精Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、IV組的胚胎可用率分別為58.06%、59.46%、70.73%、71.62%，凍精I(xiàn)組、II組與凍精Ⅲ組、IV組之間具有顯著性差異（P＜0.05）。

表1 凍精液對(duì)供體母羊沖胚的影響

2.2 鮮精液對(duì)供體母羊沖胚的影響

由表2可知，用鮮精對(duì)供體母羊不同部位輸精，對(duì)供體母羊沖胚有明顯影響。母羊陰道授精、子宮頸口授精、子宮角授精、輸卵管授精沖出胚胎數(shù)分別為127枚、131枚、129枚、133枚；受精胚胎數(shù)分別為92枚、111枚、121枚、124枚，受精率分別為72.44%、84.73%、93.80%、93.23%。鮮精I(xiàn)組、II組與鮮精Ⅲ組、IV組之間具有顯著性差異（P＜0.05）。受精胚胎中能正常使用的A、B級(jí)胚胎分別為71枚、86枚、105枚、100枚。正常發(fā)育胚胎見(jiàn)圖1。鮮精Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、IV組的正常發(fā)育胚胎率分別為77.17%、77.48%、86.78%、80.65%，組間顯著性差異不明顯（P＞0.05）。

表2 鮮精液對(duì)供體母羊沖胚的影響

圖1 正常發(fā)育胚胎

3 討論

3.1 凍精進(jìn)行不同部位輸精對(duì)綿羊胚胎移植中供體沖胚會(huì)產(chǎn)生影響

使用凍精進(jìn)行不同部位輸精會(huì)對(duì)綿羊胚胎移植中供體沖胚產(chǎn)生影響。陰道、子宮頸口、子宮角、輸卵管授精沖出胚胎受精率分別為23.67%、28.90%、61.65%、58.73%，說(shuō)明凍精通過(guò)陰道、子宮頸口、子宮角到達(dá)輸卵管的過(guò)程中，有很多凍精沒(méi)有到達(dá)輸卵管，或到達(dá)輸卵管也沒(méi)有受精能力，無(wú)法與卵子相結(jié)合。從子宮角、輸卵管輸入的精子沒(méi)有經(jīng)過(guò)陰道、子宮頸口這樣漫長(zhǎng)的過(guò)程，到達(dá)輸卵管所用時(shí)間相對(duì)較短，死亡的精子相對(duì)較少，具有受精能力的精子數(shù)量比凍精Ⅰ組、Ⅱ組多，所以胚胎受精率高，且兩者受精率不存在顯著性差異，說(shuō)明使用凍精在子宮角、輸卵管處授精均可。在凍精生產(chǎn)過(guò)程中，因加入了很多化學(xué)藥劑，且其在液氮中保存時(shí)間較長(zhǎng)，在使用時(shí)進(jìn)行解凍，這些精子會(huì)受到各種因素的影響。使用前精子的活力保持0.3即為合格，能夠進(jìn)行授精，解凍后應(yīng)立即輸精。

凍精Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、IV組的胚胎可用率分別為58.06%、59.46%、70.73%、71.62%。說(shuō)明凍精通過(guò)陰道、子宮頸口、子宮角到達(dá)輸卵管后，部分精子的受精能力降低，即使與卵子結(jié)合成功，受精卵的分裂可能會(huì)不正常。

3.2 鮮精進(jìn)行不同部位輸精對(duì)綿羊胚胎移植中供體沖胚產(chǎn)生的影響

用鮮精從陰道、子宮頸口、子宮角、輸卵管授精，供體沖出胚胎的受精率分別為72.44%、84.73%、93.80%、93.23%，鮮精I(xiàn)組、II組與鮮精Ⅲ組、IV組之間具有顯著性差異（P＜0.05）。說(shuō)明用鮮精從不同部位輸精受精率都不低，這是因?yàn)轷r精活力高，即使在陰道、子宮頸口處授精，大多數(shù)精子依然可以通過(guò)漫長(zhǎng)的過(guò)程成功到達(dá)輸卵管與卵子相結(jié)合。在子宮角、輸卵管處授精，胚胎受精率較高，因?yàn)榇颂幨诰木記](méi)有經(jīng)過(guò)漫長(zhǎng)的過(guò)程，受精能力強(qiáng)。鮮精Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、IV組的可用胚胎率分別為77.17%、77.48%、86.78%、80.65%，組間顯著性差異不明顯（P＞0.05）。說(shuō)明經(jīng)過(guò)各種途徑授精的鮮精與卵子結(jié)合后，對(duì)胚胎的分裂產(chǎn)生的影響不明顯。

將鮮精Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、IV組分別與凍精Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、IV組對(duì)比發(fā)現(xiàn)，使用鮮精在任何部位的輸精效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于凍精的輸精效果。說(shuō)明鮮精的受精能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于凍精。因此在胚胎移植過(guò)程中，不易使用凍精；為了保證授精效果、胚胎的質(zhì)量，在胚胎移植實(shí)踐中應(yīng)使用鮮精。

3.3 子宮角、輸卵管授精效果的比較

試驗(yàn)結(jié)果表明：子宮角、輸卵管授精，胚胎受精率、可用胚胎率均高，但二者在實(shí)踐中存在三方面差別。一是輸卵管不如子宮角容易找到，輸卵管太細(xì)小，不易發(fā)現(xiàn)，操作中往往要花費(fèi)較多時(shí)間才能找到；子宮角粗大，找到子宮即找到子宮角。二是輸精操作的難易程度不同，輸精前要刺透輸卵管壁或子宮角壁，輸卵管壁不易刺透，有可能會(huì)將整個(gè)輸卵管刺穿，而子宮角壁很容易被刺透。三是對(duì)供體羊機(jī)體的健康影響不同，刺透輸卵管壁容易發(fā)生粘連；刺透子宮角壁不容易發(fā)生粘連，不影響下次使用。此外，輸卵管處授精比子宮角處授精的受精率還要低一點(diǎn)。因此，推薦在子宮角處進(jìn)行人工授精。

盧小芳等[1]在做超數(shù)排卵試驗(yàn)時(shí)，將精液注入供體羊子宮內(nèi)，結(jié)果所沖出的胚胎受精率超89%。蘇和等[2]將精液分別輸?shù)焦w母羊子宮頸和子宮內(nèi)，結(jié)果可見(jiàn)，采用子宮頸授精，所獲胚胎受精率為79.33%，采用子宮角授精，所獲胚胎受精率為92.71%。柴孟龍等[3]在超排試驗(yàn)中對(duì)供體羊進(jìn)行子宮內(nèi)以及子宮頸人工授精，結(jié)果發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)輸精沖出的胚胎受精率為94.62%，子宮頸授精沖出的胚胎受精率為85.48%。董志岷等[4]在超排試驗(yàn)時(shí)對(duì)供體羊進(jìn)行子宮內(nèi)人工授精，所采胚胎受精率超96%。王玉琴[5]等用腹腔鏡技術(shù)對(duì)綿羊子宮角進(jìn)行輸精，發(fā)現(xiàn)胚胎受精率為100%；采取子宮頸授精的綿羊所沖胚胎受精率為77.38%。以上研究說(shuō)明子宮內(nèi)授精效果顯著高于子宮頸授精，這與本次試驗(yàn)研究結(jié)果具有一致性。

4 小結(jié)

用鮮精從陰道、子宮頸口、子宮角、輸卵管授精，供體沖出胚胎的受精率分別為72.44%、84.73%、93.80%、93.23%，鮮精I(xiàn)組、II組與鮮精Ⅲ組、IV組之間具有顯著性差異（P＜0.05），且各鮮精組明顯高于相應(yīng)的凍精組。鮮精Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、IV組的可用胚胎率分別為77.17%、77.48%、86.78%、80.65%，組間顯著性差異不明顯（P＞0.05），且各鮮精組明顯高于相應(yīng)的凍精組。因此，在綿羊胚胎移植中對(duì)供體應(yīng)使用鮮精進(jìn)行輸精，應(yīng)采用子宮角授精，沖胚效果最好。