蔡甜甜, 吳蕾, 陳瑞鳳, 杜秋伶, 范龍, 王奇, 林琳, 于旭華△

1廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院呼吸科(廣東廣州 510030); 2廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院廣州呼吸健康研究院呼吸疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家呼吸系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心(廣東廣州 510180); 3廣州中醫(yī)藥大學(xué) (廣東廣州 510006)

吸煙是導(dǎo)致慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)發(fā)生的重要原因，而呼吸道病毒感染是誘發(fā)COPD急性加重的重要因素[1]。病毒感染的免疫應(yīng)答是宿主自我保護(hù)的基本防線。目前國(guó)內(nèi)對(duì)香煙暴露聯(lián)合流感病毒感染的研究報(bào)道較少。因此，2018年8月至2020年5月，本研究通過(guò)通過(guò)短期香煙煙霧暴露及氣道流感病毒滴注的方法，觀察攻毒后7 d內(nèi)小鼠氣道灌洗液免疫細(xì)胞分類計(jì)數(shù)、免疫細(xì)胞氧化應(yīng)激能力以及灌洗液蛋白濃度的變化，為后續(xù)研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。由于呼吸道病毒感染是導(dǎo)致COPD由穩(wěn)定期向急性期過(guò)度的特殊病理階段，因此本研究一方面旨在明確吸煙對(duì)呼吸道病毒感染后宿主免疫應(yīng)答的影響，另一方面也探討呼吸道病毒感染在誘發(fā)COPD急性加重過(guò)程中的免疫病理改變，為研發(fā)針對(duì)本階段預(yù)防COPD急性加重的藥物提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥物及試劑 大前門過(guò)濾嘴香煙(煙堿含量 0.8 mg，焦油量11 mg /支，上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司出品)。毒株為H1N1(A/PR/8/34)流感病毒鼠肺適應(yīng)株(MEM溶媒)，由廣州市呼吸健康研究院提供，于-80℃低溫保存。Kwik-Diff(Thermo Fisher Scientific，No.9990700)，Acridine Orange hydrochloride Solution(Sigma, No.8097-10ML)，Ethidium bromide(Sigma, No.E1510-10ML)，TRIzol? Reagent(life technologies， No.15596026)。PDB(2-丁酸佛波醇酯；Sigma aldrich，No.P1269)和L-012(8-氨基-5-氯-7-苯基-2，3-二氫吡啶并[3，4-d]噠嗪-1，4-二酮；Wako Pure ChemicalIndustries，No.120-04891)，BCA蛋白測(cè)定試劑盒(Thermo Fisher Scientific，No.UH289368)。

1.2 儀器 多功能臺(tái)式冷凍離心肌(Allegra X-22R)，顯微鏡(BX61+DP720,Olympus)，酶標(biāo)儀(Tacan)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 由斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司購(gòu)置6～8 周齡雌性SPF級(jí)Balb/c小鼠，動(dòng)物許可證號(hào)：NoSCXK(京)2016-0002，所有操作和實(shí)驗(yàn)流程均遵守《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。自由飲水和攝食，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后開(kāi)始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4 動(dòng)物的分組及造模

1.4.1 動(dòng)物分組 選取SPF級(jí)雌性Balb/c小鼠，隨機(jī)分成7組：分別為假熏煙假攻毒組，假熏煙攻毒組(6PFU)，假熏煙攻毒組(12PFU)，假熏煙攻毒組(24PFU)，熏煙聯(lián)合攻毒組(6PFU)，熏煙聯(lián)合攻毒組(12PFU)，以及熏煙聯(lián)合攻毒組(24PFU)。

1.4.2 熏煙方法 熏煙方法參考本課題組前期熏煙方法[2-3]，小鼠置于18 L熏煙箱中進(jìn)行熏煙，以6 mL/s的速度抽取香煙煙霧至60 mL注射器，隨即將煙霧注入熏煙箱中。每天3次予以被動(dòng)吸煙，于9am、12am、3pm進(jìn)行，每次3支大前門香煙(20支/包，煙堿含量0.8 mg，焦油量11 mg/支，一氧化碳含量13 mg/支)，每次持續(xù)1 h，連續(xù)4 d后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。假熏煙小鼠放入另一干凈且相同大小的塑料箱內(nèi)，不做熏煙處理，其余操作同熏煙組小鼠。

1.4.3 攻毒方法 小鼠進(jìn)行常規(guī)喂養(yǎng)，于第5天進(jìn)行攻毒。用1 mL注射器共抽取2 mL異氟烷均勻?yàn)⒃诼樽砥恐校S后將小鼠置于麻醉瓶中旋緊瓶蓋，待小鼠出現(xiàn)深快呼吸后取出，迅速向小鼠鼻內(nèi)滴注PR8病毒30 μL/只。假攻毒組鼻內(nèi)滴注MEM培養(yǎng)基 30 μL/只，其余操作同攻毒組小鼠。分別觀察攻毒后3、5、7 d小鼠變化。

1.5 樣本制備 小鼠用4%戊巴比妥鈉腹腔注射安樂(lè)死，切開(kāi)氣管處皮毛，充分暴露氣管，插入氣管灌洗管(剪成楔形的24 G靜脈留置針)，分4次抽取0.4、0.3、0.3、0.3 mL的PBS并回抽(共約1 mL)，用于細(xì)胞計(jì)數(shù)，分類計(jì)數(shù)及蛋白含量檢測(cè)。

1.6 檢測(cè)內(nèi)容

1.6.1 小鼠支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞分類計(jì)數(shù)的測(cè)定 將氣道灌洗液混勻，加入20 μL AO/EB工作液混勻，將細(xì)胞計(jì)數(shù)板置于熒光顯微鏡下進(jìn)行有核細(xì)胞計(jì)數(shù)，剩余灌洗液進(jìn)行涂片離心，Kwik-Diff染色。通過(guò)形態(tài)區(qū)分進(jìn)行細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。

1.6.2 小鼠支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞ROS產(chǎn)生速率的檢測(cè) 選用不透光的黑色96孔板，每孔加入50 μL細(xì)胞混懸液、150 μL L-O12工作液和20 μL PDB工作液。檢測(cè)前加入20 μL PDB進(jìn)行刺激。之后立即選擇Luminescence功能進(jìn)行化學(xué)發(fā)光測(cè)定，激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)520 nm，每孔測(cè)定1 s，共30個(gè)循環(huán)，間隔45 s。通過(guò)50 μL細(xì)胞懸液的細(xì)胞總數(shù)和細(xì)胞密度計(jì)算ROS的產(chǎn)生速率，用相對(duì)光單位(RLU)表示。

1.6.3 小鼠支氣管灌洗液蛋白濃度測(cè)定 運(yùn)用BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)各灌洗液中的蛋白含量，用酶標(biāo)儀檢測(cè)562 nm波長(zhǎng)下的吸光度，最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各個(gè)樣品的蛋白濃度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用prism7.0統(tǒng)計(jì)軟件，多組比較采用one-way ANOVA方法進(jìn)行比較，進(jìn)一步兩兩比較，采用Tukey檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 熏煙聯(lián)合病毒感染對(duì)小鼠灌洗液中細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響 攻毒3 d后，與假熏煙假攻毒組相比，假熏煙攻毒組(24PFU)小鼠氣道灌洗液細(xì)胞總數(shù)(P<0.01)、巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)(P<0.01)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(P<0.05)和淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)(P<0.05)均明顯升高，熏煙聯(lián)合攻毒組(6PFU)和熏煙聯(lián)合攻毒組(12PFU)氣道灌洗液巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯增多(P<0.01)；熏煙聯(lián)合攻毒組(24PFU)氣道灌洗液巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)(P<0.01)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)(P<0.05)明顯增多。見(jiàn)表1。

表1 攻毒3d后氣道灌洗液細(xì)胞總數(shù)及細(xì)胞分類計(jì)數(shù)

攻毒5 d后，與假熏煙假攻毒組相比，假熏煙攻毒組(12PFU)小鼠氣道灌洗液巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯增多(P<0.05)，假熏煙攻毒組(24PFU)小鼠氣道灌洗液細(xì)胞總數(shù)(P<0.05)和巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)(P<0.05)明顯增多，熏煙聯(lián)合攻毒組(6PFU)小鼠氣道灌洗液巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯增多(P<0.05)，熏煙聯(lián)合攻毒組(12PFU)小鼠氣道灌洗液細(xì)胞總數(shù)(P<0.01)、巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)(P<0.01)明顯增多，熏煙聯(lián)合攻毒組(24PFU)小鼠氣道灌洗液細(xì)胞總數(shù)(P<0.01)、巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)(P<0.01)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(P<0.01)和淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)(P<0.01)明顯增多。并且與假熏煙攻毒組(24PFU)小鼠相比，熏煙聯(lián)合攻毒組(24PFU)小鼠氣道灌洗液細(xì)胞總數(shù)(P<0.01)和中性粒細(xì)胞總數(shù)明顯增多(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 攻毒5 d后氣道灌洗液細(xì)胞總數(shù)及細(xì)胞分類計(jì)數(shù)

攻毒7 d后，與假熏煙假攻毒組相比，假熏煙攻毒組(12PFU)小鼠氣道灌洗液細(xì)胞總數(shù)(P<0.01)、巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)(P<0.01)和中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(P<0.01)明顯增多，假熏煙攻毒組(24PFU)小鼠氣道灌洗液細(xì)胞總數(shù)(P<0.01)和巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)(P<0.01)明顯增多；熏煙聯(lián)合攻毒組(24PFU)小鼠氣道灌洗液細(xì)胞總數(shù)(P<0.01)、巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)(P<0.01)明顯增多。與熏煙聯(lián)合攻毒組(12PFU)相比，假熏煙聯(lián)合攻毒組(12PFU)小鼠氣道灌洗液細(xì)胞總數(shù)(P<0.05)、巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)(P<0.05)和中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(P<0.01)明顯增多。見(jiàn)表3。

表3 攻毒7 d后氣道灌洗液細(xì)胞總數(shù)及細(xì)胞分類計(jì)數(shù)

2.2 熏煙聯(lián)合病毒感染對(duì)小鼠氣道灌洗液細(xì)胞ROS產(chǎn)生的影響 與假熏煙假攻毒組相比，假熏煙攻毒組(24PFU)在病毒感染3 d后小鼠氣道灌洗液中ROS明顯升高(P<0.05)，假熏煙攻毒組(12PFU)在病毒感染7 d后小鼠氣道灌洗液中ROS明顯升高(P<0.01)；熏煙聯(lián)合攻毒組(24PFU)在病毒感染5 d后小鼠氣道灌洗液中ROS明顯升高(P<0.01)。與假熏煙攻毒組(24PFU)相比，熏煙聯(lián)合攻毒組(24PFU)在病毒感染5 d后小鼠氣道灌洗液中ROS明顯升高(P<0.05)；與熏煙聯(lián)合攻毒組(12PFU)相比，假熏煙聯(lián)合攻毒組(12PFU)在病毒感染7 d后小鼠氣道灌洗液中ROS明顯升高(P<0.01)。見(jiàn)表4。

表4 ROS的產(chǎn)生 (1 000個(gè)細(xì)胞·s)

2.3 熏煙聯(lián)合病毒感染對(duì)小鼠灌洗液蛋白濃度的影響 與假熏煙假攻毒組相比，在病毒感染3 d后，假熏煙攻毒組(6PFU、12PFU、24PFU)小鼠氣道灌洗液蛋白濃度明顯升高(P<0.01)；熏煙聯(lián)合攻毒組(6PFU、12PFU、24PFU)小鼠氣道灌洗液蛋白濃度明顯升高(P<0.01)。

在病毒感染5 d后，假熏煙攻毒組 (6PFU、12PFU、24PFU)小鼠氣道灌洗液蛋白濃度明顯升高(P<0.01)；熏煙聯(lián)合攻毒組(6PFU、12PFU、24PFU)小鼠氣道灌洗液蛋白濃度明顯升高(P<0.01)。

在病毒感染7 d后，假熏煙攻毒組(6PFU、12PFU、24PFU)小鼠氣道灌洗液蛋白濃度明顯升高(P<0.05,P<0.01)；熏煙聯(lián)合攻毒組(24PFU)小鼠氣道灌洗液蛋白濃度明顯升高(P<0.01)。見(jiàn)表5。

表5 灌洗液蛋白濃度表達(dá)量

3 討論

本研究主要是觀察香煙煙霧短期(4 d)暴露對(duì)流感病毒感染小鼠氣道灌洗液免疫細(xì)胞數(shù)量，產(chǎn)生ROS的能力以及灌洗液蛋白濃度的影響。研究中的香煙煙霧的產(chǎn)生方法，模擬人類吸煙的頻率和速度，并且造成和人類吸煙者相似的CoHb水平，從而說(shuō)明此種暴露方式下的小鼠香煙暴露程度和人類具有相似的水平[4]。不同于以往病毒性肺炎所需的病毒誘導(dǎo)滴度，COPD中病毒感染盡管可誘導(dǎo)一定程度的氣道炎癥，但可能并沒(méi)有造成嚴(yán)重的肺損傷。因此本實(shí)驗(yàn)選用了較低的病毒滴度進(jìn)行感染[5-6]。

病毒作為病原體入侵氣道上皮細(xì)胞，氣道上皮細(xì)胞可表達(dá)多種模式識(shí)別分子以識(shí)別病原體，從而激活信號(hào)通路并釋放抗病毒物質(zhì)及炎癥因子，同時(shí)又會(huì)迅速募集附近免疫細(xì)胞到達(dá)受損、感染部位，對(duì)病原體進(jìn)行殺傷和清除快速引起機(jī)體免疫反應(yīng)[7-8]。研究表明，H1N1流感毒株感染導(dǎo)致假熏煙小鼠和熏煙小鼠氣道細(xì)胞總數(shù)及分類計(jì)數(shù)在感染初期(第3天)呈滴度依賴性升高。然而，24PFU H1N1流感病毒在假熏煙小鼠氣道內(nèi)誘導(dǎo)的免疫細(xì)胞的總數(shù)和分類計(jì)數(shù)略高于熏煙小鼠(P>0.05)。隨著感染時(shí)間的推移，盡管24PFU H1N1流感病毒導(dǎo)致假熏煙小鼠氣道灌洗液細(xì)胞總數(shù)逐漸升高，但與第3天相比，第7天小鼠氣道中性粒細(xì)胞數(shù)量下降，而巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯增多，說(shuō)明氣道炎癥逐漸由急性期向慢性期恢復(fù)期過(guò)度。然而在熏煙小鼠體內(nèi)，流感病毒(24PFU)感染后第5天細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)達(dá)到高峰，且峰值水平與假熏煙小鼠第3天水平相似。流感病毒(12PFU)感染后第7天，假熏煙小鼠氣道細(xì)胞總數(shù)達(dá)到峰值，而熏煙小鼠氣道數(shù)量則維持在相對(duì)較低水平， 說(shuō)明熏煙導(dǎo)致氣道免疫細(xì)胞募集的延遲， 因此香煙暴露可能導(dǎo)致宿主抗病毒防御功能的異常。與本研究相似，Hsu等[5]研究表明，香煙暴露降低了機(jī)體對(duì)流感病毒感染的應(yīng)答，如γ干擾素、腫瘤壞死因子-α、干擾素誘導(dǎo)蛋白10(IP-10)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)等細(xì)胞因子的分泌。Wu 等[9]研究表明，吸煙者的氣道上皮細(xì)胞抗病毒應(yīng)答受損。另一方面，有研究表明，香煙煙霧直接通過(guò)影響病毒的復(fù)制從而限制了病毒復(fù)制的程度[10]，因此病毒在體內(nèi)復(fù)制異常也可能是香煙暴露導(dǎo)致氣道免疫細(xì)胞數(shù)量變化的原因。

ROS作為活性氧物質(zhì)具有強(qiáng)氧化作用，因而是吞噬細(xì)胞(中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞)殺死入侵微生物的主要武器，因此免疫細(xì)胞應(yīng)激能力的下降或反應(yīng)延遲可能會(huì)增加繼發(fā)細(xì)菌等微生物感染的可能性[11]。對(duì)慢性肉芽腫疾病患者研究發(fā)現(xiàn)其機(jī)體內(nèi)活性氧生成活力低下，白細(xì)胞不能有效地引起呼吸爆發(fā)從而使這類患者易受真菌等微生物的感染而威脅生命[12]?？梢?jiàn)由吞噬細(xì)胞所產(chǎn)生的ROS是宿主防御入侵病原體所必需的。本次研究表明, 氣道免疫細(xì)胞ROS的產(chǎn)生速率的變化與氣道灌洗液細(xì)胞數(shù)量的變化趨勢(shì)一致。即流感病毒(24PFU)導(dǎo)致假熏煙小鼠氣道免疫細(xì)胞ROS產(chǎn)生速率高峰在第3天， 而熏煙小鼠氣道免疫細(xì)胞ROS產(chǎn)生速率高峰在第5天。說(shuō)明香煙暴露延遲氣道免疫細(xì)胞的功能達(dá)到高峰的時(shí)間。有研究表明，香煙暴露導(dǎo)致吞噬細(xì)胞的細(xì)菌清除能力下降[13]，從而進(jìn)一步說(shuō)明香煙會(huì)使免疫反應(yīng)和免疫細(xì)胞的功能減退或反應(yīng)遲鈍，可能是后面細(xì)菌介入并導(dǎo)致真正的COPD急性加重的原因[14]。盡管如此，大量研究仍然表明，香煙煙霧的暴露，促進(jìn)流感病毒感染小鼠ROS的產(chǎn)生[11,15]，這可能與特定時(shí)間點(diǎn)以及病毒特性的差異有關(guān)。

氣道灌洗液蛋白主要包括氣道免疫細(xì)胞及上皮細(xì)胞所分泌的炎癥介質(zhì)、酶、黏蛋白等。本次實(shí)驗(yàn)中小鼠氣道灌洗液蛋白含量在病毒感染后3、5、7 d，各組小鼠氣道灌洗液蛋白含量均明顯升高，且熏煙聯(lián)合攻毒組與假熏煙聯(lián)合攻毒組小鼠灌洗液蛋白含量在各時(shí)點(diǎn)無(wú)明顯差異。說(shuō)明香煙煙霧暴露雖會(huì)引起流感感染小鼠氣道免疫細(xì)胞募集以及殺傷力高峰的延遲，但并沒(méi)有改變氣道炎癥介質(zhì)等分泌蛋白的總體水平。研究表明，香煙煙霧可引起或加重與氧化應(yīng)激和炎癥相關(guān)的多種肺部疾病，并可影響流感病毒導(dǎo)致的細(xì)胞因子的表達(dá)[16-17]，與本研究并不一致，原因可能在于灌洗液中蛋白總體水平與細(xì)胞因子分泌的水平不一致。