高海軍,龐華勝,張 妍,霍樂樂,姜 斌,莫筱瑾,雒艷萍,張 颋,,景 濤,徐 斌,馬興銘,胡 薇

多房棘球蚴病(Alveolar echinococcosis,AE)是由多房棘球絳蟲幼蟲(多房棘球蚴)寄居于人或哺乳動(dòng)物引起的一種人獸共患寄生蟲病[1]。AE主要分布于北半球,高流行區(qū)集聚于中亞及我國(guó)西北部,嚴(yán)重威脅著人體健康及畜牧業(yè)發(fā)展,被視為“蟲癌”[2]。多房棘球蚴具有獨(dú)特的組織器官趨向性,肝臟寄生占97%以上,呈類癌樣侵襲生長(zhǎng),可通過血液或淋巴液向肺腦等器官播散[3]。若未得到合理治療,AE患者10～15年生存率僅為10%左右[4-5]。目前,AE的臨床治療策略主要包括病灶切除、肝臟移植和藥物化療。目前,阿苯達(dá)唑(Albendazole,ABZ)作為臨床上最主要的棘球蚴病治療藥物,是通過抑制微管聚合和能量代謝進(jìn)而發(fā)揮其抑蟲作用[6]。由于AE患者術(shù)后易出現(xiàn)復(fù)發(fā),ABZ口服吸收效果不佳及長(zhǎng)期服用產(chǎn)生的毒副作用明顯等[7],因此,尋找新型AE治療藥物成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。

白藜蘆醇(Resveratrol,RES)是一種含芪類結(jié)構(gòu)的非黃酮多酚化合物,廣泛存在于葡萄科、百合科、豆科等植物中[8]。已有研究證實(shí),RES具有抗炎、抗腫瘤、抗纖維化和抗血管生成等多種生物功能[9],還具有殺蟲(如血吸蟲[10]、利什曼原蟲[11]和錐蟲[12])作用。因此,本研究將探討RES體外對(duì)多房棘球蚴原頭節(jié)和微囊生長(zhǎng)的作用,旨在為AE的臨床用藥提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及倫理 清潔級(jí)雄性長(zhǎng)爪沙鼠(Merionesunguiculatus)(體重約75 g)由首都醫(yī)科大學(xué)友情贈(zèng)送。本實(shí)驗(yàn)研究經(jīng)蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)和中國(guó)疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所倫理委員會(huì)同意(授權(quán)號(hào):SCX-gan-2009-0004和IPD-2021-27)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

1.2.1 細(xì)胞及寄生蟲來源 永生化肝癌細(xì)胞(Hep G2細(xì)胞系)由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所保存;多房棘球蚴原頭節(jié)來自蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院的泡球蚴感染的長(zhǎng)爪沙鼠。

1.2.2 試劑與儀器 二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO),阿苯達(dá)唑亞砜(Albendazole sulfoxide,ABZ-SO),白藜蘆醇(Resveratrol,RES)購自阿拉丁化學(xué)試劑公司;基礎(chǔ)培養(yǎng)液(Dulbecco’s modified eagle’s medium,DMEM)、胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)和青霉素-鏈霉素(Penicillin-streptomycin,P-S)等購自南京維森特生物技術(shù)有限公司和臺(tái)盼藍(lán)染液購買自北京索萊寶科技有限公司,堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase activity,ALP)活性檢測(cè)試劑盒購自武漢賽維爾生物科技有限公司;多功能酶標(biāo)檢測(cè)儀由美國(guó)Bio Tek公司生產(chǎn),倒置光學(xué)顯微鏡由日本Olympus公司生產(chǎn),掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡由日本電子株式會(huì)社生產(chǎn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 多房棘球蚴原頭節(jié)和微囊的分離培養(yǎng) 原頭節(jié)分離培養(yǎng)步驟參照文獻(xiàn)[7],即感染泡球蚴14個(gè)月的長(zhǎng)爪沙鼠經(jīng)乙醚麻醉后脫頸處死,置入75%乙醇浸泡10 min,無菌分離泡球蚴組織并將其轉(zhuǎn)移至含20%P-S的無菌磷酸緩沖鹽溶液(Phosphate buffer saline,PBS),用組織剪去除泡球蚴表面殘留的宿主血管與結(jié)締組織,用含1%P-S的PBS漂洗3～4遍,將其剪碎充分釋放原頭節(jié),經(jīng)200μm和40μm無菌過濾后收集原頭節(jié),再用新鮮DMEM(含1%P-S)漂洗直至其存活率＞98%,最后用含1%P-S的DMEM將其充分重懸,置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)備用。

在完全培養(yǎng)體系(89% DMEM＋10% FBS＋1%P-S)中,待飼養(yǎng)細(xì)胞Hep G2長(zhǎng)滿至平皿的85%左右,將原頭節(jié)緩緩加入(1 000 PSCs/皿)平皿繼續(xù)培養(yǎng),每隔3～4 d用PBS漂洗并置入新鮮培養(yǎng)體系中繼續(xù)培養(yǎng),約4周原頭節(jié)將發(fā)育成微囊,收集微囊備用。

1.3.2 原頭節(jié)和微囊的體外作用 將原頭節(jié)種入24孔 板(100 PSCs/孔),設(shè) 置PBS組、DMSO組(DMSO終濃度為0.1%)即溶媒對(duì)照組、ABZ-SO作用組(ABZ-SO終濃度為40μmol/L)即陽性對(duì)照組,RES作用組(RES終濃度分別為5、10、20、40、80、100、200和400μmol/L),每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔,每24 h觀察其形態(tài)變化并記錄存活率,持續(xù)觀察1周。培養(yǎng)至第6 d,吸取各孔培養(yǎng)上清液100μL進(jìn)行ALP活性檢測(cè)。另外,收取PBS、DMSO、ABZSO和RES組原頭節(jié),采用0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色觀察其形態(tài)變化;部分原頭節(jié)經(jīng)PBS漂洗3～4遍后,固定于4%戊二醛中,采用掃描和透射電子顯微鏡觀察其超微結(jié)構(gòu)變化。

將收集的微囊種入24孔板(4個(gè)/孔),設(shè)置PBS組、DMSO組(DMSO終濃度為0.1%)即溶媒對(duì)照組、ABZ-SO作用組(ABZ-SO終濃度為40 μmol/L)即陽性對(duì)照組,RES作用組(RES終濃度為40μmol/L),每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,每24 h觀察其活力和形態(tài)變化,持續(xù)觀察2周。2周后,收集培養(yǎng)上清并檢測(cè)其ALP活性。

1.3.3 堿性磷酸酶活性檢測(cè) 取原頭節(jié)或微囊培養(yǎng)上清(30μL)、檢測(cè)緩沖液(20μL)和顯色底物(50 μL)進(jìn)行混勻,后置于37℃孵育15 min后,加入終止液(100μL)終止反應(yīng),測(cè)定A405nm值,參照試劑盒說明書建立標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算ALP活性。

1.3.4 掃描和透射電鏡觀察 掃描電鏡制樣操作步驟參照文獻(xiàn)[2],即收集的原頭節(jié)用PBS漂洗3～4遍,置于4%戊二醛固定4 h,用1%鋨酸室溫避光進(jìn)行后固定,經(jīng)梯度乙醇和乙酸異戊酯脫水,真空干燥及噴金后置于掃描電子顯微鏡下觀察。透射電鏡制樣操作步驟參照文獻(xiàn)[13],即原頭節(jié)經(jīng)4%戊二醛固定后用無菌PBS洗滌3～4遍,再經(jīng)1%鋨酸進(jìn)行后固定、梯度濃度丙酮脫水,再經(jīng)Epon812環(huán)氧樹脂包埋后切片,鉛鈾電子染色,在透射電鏡下觀察并拍照。

2 結(jié) 果

2.1 白藜蘆醇體外對(duì)多房棘球蚴原頭節(jié)的作用效果 光學(xué)顯微鏡觀察顯示,5～400μmol/L RES體外持續(xù)作用7 d,原頭節(jié)死亡率呈劑量、時(shí)間依賴性升高,其中,400和200μmol/L RES體外分別作用至第1和3 d,原頭節(jié)死亡率均達(dá)100%。當(dāng)RES濃度降至100、80和40μmol/L時(shí),原頭節(jié)死亡率分別在第4、5和6 d達(dá)到100%,20μmol/L RES作用至第7 d原頭節(jié)全部死亡。而10和5μmol/L RES作用至第7 d,原頭節(jié)死亡率僅為(23.75±4.24)%和(20.75±2.83)%。截至第7 d,40μmol/L ABZSO作用組原頭節(jié)死亡率為(13.25±1.41)%,DMSO組為(6±0.71)%(圖1)。

圖1 白藜蘆醇體外對(duì)多房棘球絳蟲原頭節(jié)的作用效果Fig.1 Effect of RES on E.multilocularis PSCs in vitro

化學(xué)發(fā)光法顯示,不同濃度的RES作用至第6 d,PSCs培養(yǎng)上清中ALP活性呈劑量依賴性增高(F＝36.94,P＜0.001)。在PBS組中,ALP活性為(1.86±0.11)U/L,與DMSO組(1.97±0.18)間 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t＝0.775,P＝0.468)。與DMSO組比較,400和200μmol/L RES組中ALP活性明顯增高,分別為(6.13±0.22)U/L(t＝17.35,P＜0.001)和(59.93±0.27)U/L(t＝13.57,P＜0.001)。當(dāng)RES濃度降至100、80、40和20μmol/L時(shí),上清中ALP活性分別為3.73±0.32,3.35±0.54,2.95±0.10和2.72±0.24 U/L,與DMSO組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t＝5.253,P＝0.002;t＝2.509,P＝0.046;t＝7.066,P＝0.000和t＝2.94,P＝0.026),但10和5μmol/L RES作用后,ALP活性為(1.95±0.14)和(2.0±0.13)U/L,與DMSO組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t＝0.116,P＝0.911和t＝0.013,P＝0.990)(圖2)。

圖2 白藜蘆醇體外對(duì)多房棘球蚴原頭節(jié)ALP活性的影響Fig.2 Changes of ALP activity in E.multilocularis PSCs after treatment with RES in vitro

2.2 白藜蘆醇體外對(duì)多房棘球蚴原頭節(jié)形態(tài)的影響 光鏡顯示,作用至第6 d時(shí),PBS和DMSO組原頭節(jié)結(jié)構(gòu)完整,透光性良好,大量鈣顆粒排列整齊,而40～400μmol/L RES組中原頭節(jié)活力喪失、透光性降低,并被0.4%臺(tái)盼藍(lán)染成藍(lán)色,蟲體表皮發(fā)生大面積潰爛,培養(yǎng)液中有大量小鉤散落,且小鉤數(shù)量隨藥物濃度升高而增高。然而,10和5μmol/L RES、40μmol/L ABZ-SO、DMSO和PBS組中均未觀察到有明顯散落的小鉤且原頭節(jié)均未能被臺(tái)盼藍(lán)著色(圖3)。

圖3 白藜蘆醇體外作用后多房棘球蚴原頭節(jié)的形態(tài)變化Fig.3 Morphological changes of E.multilocularis PSCs after treatment with RES in vitro

掃描電鏡觀察顯示,在PBS和DMSO組中,頂突外翻原頭節(jié)的小鉤排列整齊,腹部吸盤結(jié)構(gòu)完整,體表被覆有大量微絨毛。40μmol/L ABZ-SO作用后,原頭節(jié)除體表產(chǎn)生空泡外,體壁無其它顯著變化,排泄孔結(jié)構(gòu)清晰;而40μmol/L RES作用后,原頭節(jié)頂突、吸盤和體壁等基本結(jié)構(gòu)完全被破壞殆盡。透射電鏡觀察表明,PBS和DMSO組中原頭節(jié)體壁超微結(jié)構(gòu)完整,例如合胞體層被覆大量向外生長(zhǎng)的微絨毛,并被一層過碘酸雪夫染色陽性(Periodic acid-Schiff stain,PAS)物質(zhì)包繞,內(nèi)部可見纖維束、肌肉束和圓形或橢圓形的實(shí)質(zhì)細(xì)胞等。40μmol/L ABZ-SO治療組中,原頭節(jié)合胞體層和PAS物質(zhì)層變薄、微絨毛變短變少,而RES作用后,原頭節(jié)基本結(jié)構(gòu)完全被破壞,包括合胞體層、PAS物質(zhì)和微絨毛明顯缺失,實(shí)質(zhì)細(xì)胞皺縮,胞漿內(nèi)可見大量空泡與凋亡小體(圖4)。

圖4 白藜蘆醇體外作用后多房棘球蚴原頭節(jié)超微結(jié)構(gòu)的變化Fig.4 Ultrastructural alterations in E.multilocularis PSCs after treatment with RES in vitro

2.3 白藜蘆醇體外對(duì)多房棘球蚴微囊的作用效果光鏡顯示,DMSO組多房棘球蚴微囊的角質(zhì)層和生發(fā)層結(jié)構(gòu)完整,透光性良好,內(nèi)有大量新生原頭蚴。40μmol/L ABZ-SO作用2周后,微囊發(fā)育較DMSO組遲緩,角質(zhì)層和生發(fā)層形態(tài)未發(fā)生顯著變化,但40μmol/L RES作用后,微囊透光性明顯降低,微囊生發(fā)層皺縮并與角質(zhì)層分離(圖5)。

化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)表明,40μmol/L ABZ-SO體外作用后,培養(yǎng)上清中ALP活性為(2.29±0.14)U/L,與DMSO組(2.08±0.09)U/L間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t＝1.271,P＝0.273),而40μmol/L RES作用后ALP活性增高,為(2.74±0.15)U/L(t＝3.83,P＝0.019)(圖5)。

圖5 白藜蘆醇體外對(duì)多房棘球蚴微囊的作用效果Fig.5 Effect of RES on E.multilocularis microcysts in vitro

3 討 論

多房棘球蚴好寄生于人類和高原鼠兔等中間宿主的肝臟(占97%以上),嚴(yán)重威脅著人體健康與畜牧業(yè)發(fā)展[4,14]。目前,AE患者經(jīng)臨床藥物ABZ治療后復(fù)發(fā)率高,ABZ口服吸收差且長(zhǎng)期服用副作用嚴(yán)重等,嚴(yán)重限制了其藥效的進(jìn)一步發(fā)揮[15-16]。因此,尋找新型有效的殺蟲藥物來預(yù)防和治療多房棘球蚴病成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。

RES常被認(rèn)為是一個(gè)多靶點(diǎn)化合物,具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗病毒和抗寄生蟲等多種生物學(xué)作用[9,12]。報(bào)道顯示,RES能通過下調(diào)表皮生長(zhǎng)因子受體(Epidermal growth factor receptor,EGFR)和胰島素樣生長(zhǎng)因子(Insulin-like growth factor,IGF-1)等多個(gè)信號(hào)抑制癌細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移[8-9]。另外,RES可促進(jìn)過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活物1-α的表達(dá)進(jìn)而緩解血吸蟲感染引起的小鼠肝臟纖維化[10],還能下調(diào)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(Transforming growth factor-beta1,TGF-β1)信號(hào)表達(dá)改善博來霉素誘導(dǎo)的大鼠肺臟纖維化[17]。肝纖維化是AE致病的關(guān)鍵環(huán)節(jié),且上述的信號(hào)通路在多房棘球蚴的免疫逃逸、侵襲性增殖與轉(zhuǎn)移過程中均起著重要作用[14,18]。因此,本實(shí)驗(yàn)探討了RES體外對(duì)多房棘球蚴PSCs和微囊生長(zhǎng)發(fā)育的影響,希望為RES在AE治療中的應(yīng)用提供依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),RES體外對(duì)多房棘球蚴原頭節(jié)具有明顯的抑制作用,且呈時(shí)間、劑量依賴性。RES(400μmol/L)作用24 h后原頭節(jié)死亡率可達(dá)100%,當(dāng)RES濃度降至40μmol/L時(shí),原頭節(jié)在第6 d全部死亡,但在等條件下,ABZ-SO(40μmol/L)作用后原頭節(jié)死亡率僅為(13.25±2.83)%,可見,等量的RES殺蟲效果明顯優(yōu)于ABZ-SO。另外,ALP含量常被認(rèn)為判斷多房棘球蚴受損傷程度的重要指標(biāo)[16],本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),多房棘球蚴原頭節(jié)培養(yǎng)上清中ALP活性隨著RES作用濃度的增高而升高,且等濃度的RES作用后上清中ALP活性較ABZ-SO高,進(jìn)一步支持了RES殺蟲效果比ABZSO更佳。此外,原頭節(jié)表皮與其營(yíng)養(yǎng)攝取(葡萄糖等)和免疫逃逸等密切相關(guān)[14],而本實(shí)驗(yàn)中,RES能破壞其表皮結(jié)構(gòu),因此,RES殺蟲作用可能與IGF-1信號(hào)通路下調(diào)有關(guān),有待深入研究。

在多房棘球絳蟲生活史中,原頭節(jié)具有雙向發(fā)育的潛能,即在終末宿主內(nèi)進(jìn)行有性繁殖向成蟲發(fā)育,在中間宿主內(nèi)進(jìn)行無性類腫瘤樣侵襲性增殖[19]。原頭節(jié)寄居于人類肝臟的早期,以單個(gè)囊泡(微囊)形式存在,即外層為薄的角質(zhì)層和內(nèi)被覆的生發(fā)層(含大量的貯糖細(xì)胞、貯脂細(xì)胞和未分化或分化的實(shí)質(zhì)細(xì)胞等),并向外以出芽方式呈侵襲性生長(zhǎng),其內(nèi)部可新生大量的原頭蚴,進(jìn)而形成典型的多囊結(jié)構(gòu)[4,19]。本實(shí)驗(yàn)體外模擬了多房棘球絳蟲原頭節(jié)的早期發(fā)育過程,即在含飼養(yǎng)細(xì)胞(HepG2)的體系中培養(yǎng)至第4周,原頭節(jié)發(fā)育成含角質(zhì)層和生發(fā)層的單微囊,待第6周微囊內(nèi)有大量新生原頭蚴,與Wang的發(fā)現(xiàn)類似[4]。ABZ-SO作為ABZ殺蟲的活性成分,作用2周后微囊的生長(zhǎng)發(fā)育受到抑制(體積縮小和發(fā)育遲緩等),進(jìn)一步佐證了ABZ可限制多房棘球蚴的出芽生長(zhǎng)[20]。已有研究表明,RES可抑制TGF-β1的表達(dá)發(fā)揮抗纖維化作用[17],而TGF-β1信號(hào)通路在原頭節(jié)的增殖與微囊的發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用[20-21]。本實(shí)驗(yàn)研究表明,RES體外作用后,微囊活性完全喪失,即生發(fā)層皺縮且與角質(zhì)層分離,其是否與TGF-β1表達(dá)下調(diào)相關(guān),仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

RES具有毒副作用小、安全性高的特性,即HK-2和L02細(xì)胞分別經(jīng)RES作用72 h,IC50均大于150μmol/L[22],而 本 研 究 中RES對(duì)PSCs的IC50僅約為80μmol/L,且40μmol/L RES的殺蟲率也較等濃度的ABZ-SO高,顯示RES有一定的成藥潛力,但仍需進(jìn)一步開展體內(nèi)殺蟲效果和細(xì)胞毒性等研究。

綜上所述,白藜蘆醇體外對(duì)多房棘球絳蟲原頭節(jié)表現(xiàn)出顯著的殺蟲作用,對(duì)微囊生長(zhǎng)發(fā)育也具有明顯的抑制作用,是潛在的AE治療藥物。

利益沖突:無

引用本文格式:高海軍,龐華勝,張妍,等.白黎蘆醇體外對(duì)多房棘球蚴原頭節(jié)和微囊的作用研究[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2021,37(12):1057-1063.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2021.00.157