高會霞,李雅楠,劉玉珍,黃 穎,許 怡,張 志,郭 云,盧建華,李 力,王瑜玲,江 平,戴二黑

2019新型冠狀病毒肺炎是新發(fā)急性呼吸道傳染病,目前仍在全球范圍內(nèi)大流行。我國的疫情已基本得到控制,目前監(jiān)測重點是疑似和高危人群的篩查以及境外輸入病例,及早發(fā)現(xiàn)、及時控制傳染源是疫情防控的關(guān)鍵。病毒核酸檢測是最早應(yīng)用于確診新型冠狀病毒感染的實驗室檢測方法[1-2]。但是,由于核酸檢測采樣等問題容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果,抗體檢測是核酸檢測的有效補充。基于特異性免疫球蛋白M(Ig M)和免疫球蛋白G(IgG)抗體的血清免疫學檢測是臨床實驗室常用的病原體感染檢測方法[3]。國家衛(wèi)生健康委發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第8版)》中將抗體血清學檢測納入確診病例輔助診斷標準。但是,由于抗體免疫學檢測性能與檢測原理密切相關(guān),不同檢測原理、不同工藝方法的檢測試劑檢測性能具有較大的差異,因此,深入評價和了解不同原理抗體檢測試劑的性能,針對新冠疑似病例建立一套包含抗體檢測的高效排查策略,快速準確的識別可能的感染人群、減少因核酸檢測陰性而漏檢,從而更好的控制傳染源,也是疫情防控工作重點之一。本研究以隔離點76例被隔離觀察的核酸檢測陰性的疑似病例為研究對象,以隔離期不同時間點血清微量病毒中和抗體試驗以及3種基于不同原理開發(fā)的新冠抗體檢測方法,結(jié)合影像學等檢查,綜合判斷疑似病例中確診病例和排除病例的可能性,提出一套對疑似病例快速排查的抗體檢測策略和方案。

1 材料與方法

1.1 研 究 對 象 本 研 究 選 取2020年4月1日 至2020年5月28日期間,因隔離點檢測2019-nCo V血清Ig M特異性抗體陽性,轉(zhuǎn)入石家莊市第五醫(yī)院進行隔離觀察的76例新冠疑似病例為研究對象。疑似病例的一般臨床資料、流行病學資料和輔助檢查資料通過電子病歷系統(tǒng)獲得。本研究遵守國際協(xié)調(diào)理事會臨床試驗規(guī)范和赫爾辛基宣言,經(jīng)石家莊市第五醫(yī)院醫(yī)學倫理管理委員會批準實施(批準號:2020006)。

1.2 標本收集 在新冠疑似病例入院隔離的第1、7、14 d采集病例空腹靜脈血5 m L,置于干燥的無抗凝劑的真空負壓采血管內(nèi),室溫靜置30 min,2 500 r/min離心10 min,收集血清于無菌螺口塑料管中。同期采集患者鼻咽拭子標本,將拭子頭浸入含病毒保存液的專用樣本保存管中,棄去尾部,旋緊管蓋。所有樣本采集均嚴格按照要求進行。

1.3 2019-nCo V血清學檢測 磁微?；瘜W發(fā)光法(CMIA法)2019-nCo V總抗體檢測使用新型冠狀病毒(2019-nCo V)抗體檢測試劑盒(廈門萬泰凱瑞生物技術(shù)有限公司,國械注準20203400198);直接化學發(fā)光法(CLIA法)2019-nCo V Ig M/IgG抗體檢測使用新型冠狀病毒2019-nCo V Ig M抗體檢測試劑盒(國械注準20203400769)和新型冠狀病毒2019-nCoV IgG抗體檢測試劑盒(國械注準20203400770)(深圳亞輝龍生物科技股份有限公司);膠體金法(GICA法)2019-nCo V Ig M/IgG抗體檢測使用新型冠狀病毒(2019-nCo V)Ig M/IgG抗體檢測試劑盒(唐山英諾特生物技術(shù)有限公司,國械注準20203400177)。所有操作步驟均嚴格按照廠家說明書進行。

微量病毒中和抗體試驗:先進行假病毒包裝和假病毒滴定,然后將患者血清倍比稀釋,濃度梯度為1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1 280、1∶2 560,并加入到96孔細胞培養(yǎng)板,每孔加入50μL 2019-nCo V假病毒顆?；靹?置于37℃細胞培養(yǎng)箱中孵育1 h,每孔加入100μL h ACE2-hela細胞懸液(5×105個/m L),5% CO2培養(yǎng)48 h。與此同時,分別設(shè)置血清對照組、病毒對照組和正常細胞對照組。棄去培養(yǎng)基,每孔加入50μL熒光素酶檢測試劑,室溫避光孵育2 min。反應(yīng)結(jié)束后,用移液器將反應(yīng)孔中的液體反復吹吸6～8次,使細胞充分裂解,從每孔中吸出35μL液體,加入對應(yīng)96孔化學發(fā)光檢測板中,置于化學發(fā)光檢測儀中,測定熒光值。計算中和抑制率(Inhibition dilution,ID),抑制率＝[1－(樣品孔的發(fā)光強度均值－正常細胞對照孔發(fā)光強度均值)/(病毒對照孔的發(fā)光強度VC均值－正常細胞對照值孔發(fā)光強度均值)]×100%。利用Graphpad prism軟件計算ID50。ID50對應(yīng)的血清稀釋度即為該血清的中和抗體效價。當中和抗體效價≥1∶20即為陽性反應(yīng),＜1∶20為陰性反應(yīng)。

1.4 2019-nCo V核酸檢測 采用熒光RT-PCR技術(shù),核酸提取、擴增試劑盒和全自動核酸提取儀來自中山大學達安基因股份有限公司,7500型熒光PCR儀購自美國Thermo Fisher公司。所有操作步驟均嚴格按照廠家說明書進行。

1.5 類風濕因子檢測 采用類風濕因子(rheumatoid factors,RF)測定試劑盒(膠乳凝集法)(上海捷門生物技術(shù)有限公司)。所有操作步驟均嚴格按照廠家說明書進行。

1.6 統(tǒng)計學方法 資料比較采用卡方檢驗或Fisher確切概率檢驗,不同檢測方法的比較采用配對四格表χ2檢驗。所有假設(shè)檢驗均為雙側(cè)檢驗,檢驗水準α＝0.05。

2 結(jié) 果

2.1 研究對象基本信息 在76例疑似病例中,男性43例(57.1%),女性33例(42.9%)。患者平均年齡為40.3歲,其中40～60歲占比最大,為46.8%,其次為20～40歲,占39.0%。54例(71.1%)患者無合并癥,22例(28.9%)患者存在合并癥,其中以過敏性疾病(10.5%)和自身免疫性疾病(3.9%)最多見。流行病學調(diào)查結(jié)果顯示,50例(65.8%)患者近期有武漢地區(qū)旅居史,9例(11.8%)為境外回國人員,3例(3.9%)為新冠感染者密切接觸者,共62例病例有明確的流行病學史。所有病例Ig M抗體初次檢測陽性,并有發(fā)熱、乏力、咳嗽等新冠肺炎相關(guān)臨床表現(xiàn);其中73例病例早期白細胞總數(shù)正?；蚪档?75例病例淋巴細胞計數(shù)正?；驕p少;經(jīng)CT檢查73例無影像學改變,3例有多發(fā)條索等新冠肺炎影像學特征。76例病例符合《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第八版)》中疑似病例判斷標準(表1)。

表1 新冠疑似病例一般資料及流行病學資料(n＝76)Tab.1 Characteristics of IgM antibody positive suspected cases

在76例疑似病例中,類風濕因子均呈陰性反應(yīng),3例(3.9%)出現(xiàn)白細胞升高,4例(5.2%)C反應(yīng)蛋白(C reaction protein,CRP)升高,1例(1.3%)降鈣素原(Procalcitonin,PCT)升高,所有病例入院第1、7、14 d鼻咽拭子核酸檢測結(jié)果均為陰性。

2.2 疑似病例中3例判定為確診病例 通過CT檢查、臨床癥狀、微量病毒中和抗體試驗以及3種不同抗體檢測試劑檢測結(jié)果,76例疑似病例中,有3例病例CT檢查出現(xiàn)多發(fā)條索等影像學改變,中和抗體在入院隔離第1 d和第14 d均為陽性,CLIA檢測IgG和CMIA檢測總抗體在第1、7、14 d均為陽性(表2),均有武漢地區(qū)旅居史。病例1 GICA試劑檢測出現(xiàn)IgG陰轉(zhuǎn)陽的現(xiàn)象,是確診病例的標志;病例2和病例3 IgG抗體CLIA試劑檢測值從隔離第1 d至第14 d分別上升2.16倍和3.15倍,雖然未達到急性感染期4倍升高的標準,但是在病毒感染的中晚期IgG水平也呈持續(xù)上升的狀態(tài),并且由于中和抗體檢測持續(xù)強陽性,因此,即使這3例疑似病例在隔離過程中核酸檢測持續(xù)陰性,綜合CT檢查結(jié)果、流行病學史、中和抗體和3種抗體檢測結(jié)果,這3例疑似病例判斷為確診病例。這3例病例中有2例CLIA法和GICA法檢測Ig M陰性、IgG陽性,1例CLIA法Ig M弱陽性、IgG陽性,提示這3例病例可能在入院前已經(jīng)處于病毒感染后期,所以核酸檢測一直呈陰性。

表2 3例確診病例的血清抗體檢測結(jié)果Tab.2 Serum antibody test results of 3 confirmed cases

2.3 疑似病例中73例判定為排除病例 76例病例中,除上述3例判定為確診病例外,其余73例病例經(jīng)CT檢查無影像學改變,血清中和抗體檢測在入院第1 d和第14 d均為陰性,核酸持續(xù)陰性,綜合抗體檢測結(jié)果判定為排除病例。這73例情況具體如下:①40例疑似病例入院所有時間點、所有試劑檢測Ig M、IgG、總抗體均為陰性,判斷為排除病例,入院前Ig M初次檢測為假陽性。②30例疑似病例入院后一個以上時間點、一個以上試劑出現(xiàn)Ig M檢測陽性,但所有時間點兩種試劑IgG檢測陰性,總抗體陰性,由于14 d內(nèi)沒有IgG轉(zhuǎn)換,同時中和抗體持續(xù)陰性,因此判定為排除病例,入院前Ig M初次檢測以及入院后Ig M檢測為假陽性。③3例疑似病例不同抗體試劑檢測結(jié)果不一致(表3)。3例疑似病例中,病例5和病例6兩個廠家試劑在不同時間點Ig M均檢測為陰性,沒有出現(xiàn)Ig M和IgG同時陽性,病例5 CLIA、GICA和中和抗體檢測結(jié)果均為陰性,病例6 CLIA法雖在第7 d和14 d IgG檢測為陽性,但檢測結(jié)果均在陽性判定值(10 AU/m L)附近,為弱陽性,IgG檢測值無明顯升高,同時GICA法IgG檢測為陰性,中和抗體也檢測為陰性。雖然病例4入院第1 d和7 d GICA法試劑檢測Ig M和IgG同為陽性,但入院第14 d同為陰性,由于通常IgG持續(xù)時間長,一般不會在短時間內(nèi)陰轉(zhuǎn),且不同時間點總抗體和中和抗體檢測均為陰性,并且CLIA法檢測IgG陽性值均在陽性判斷值(10 AU/m L)附近。因此,結(jié)合CT檢查和核酸陰性結(jié)果,綜合判定這3例病例抗體檢測為假陽性,疑似病例為排除病例。

表3 3例排除病例的血清抗體檢測結(jié)果Tab.3 Serum antibody test results of 3 excluded cases

2.4 3種不同原理的抗體試劑檢測結(jié)果比較 在3例確診病例中,CLIA法Ig M或IgG檢測以及CMIA法總抗體檢測在入院后的第1、7和14 d共9次檢測均為陽性,檢出為9/9(＋/＋);GICA法Ig M或Ig G檢測其中1例入院第1 d為陰性,其他8次檢測均為陽性,檢出為8/9(＋/＋),CLIA法和CMIA法檢出性能優(yōu)于GICA法。

在73例排除病例入院第1 d的檢測中,CMIA總抗體檢測陰性71例,特異性97.26%;CLIA和GICA法Ig M/IgG檢測同時陰性均為54例,特異性均為73.97%。

在73例排除病例入院第14 d的檢測中,CMIA總抗體檢測陰性71例,特異性97.26%;CLIA和GICA法Ig M/IgG檢測同時陰性分別為55例和65例,特異性分別為75.34%和89.04%(表4)。

表4 3種不同原理抗體檢測試劑與臨床診斷結(jié)果比較Tab.4 Comparison of three different principles of antibody detection reagents and clinical diagnosis results

3 討 論

目前,2019新型冠狀病毒肺炎仍在全球范圍內(nèi)大流行。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計,截至2021年2月12日,全球2019新型冠狀病毒感染確診病例超過1億人,累計死亡病例達237萬。龐大的感染人群和超強的傳染性對全球醫(yī)療衛(wèi)生系統(tǒng)帶來巨大壓力和新的挑戰(zhàn)。我國的疫情防控取得階段性重要成果,目前的監(jiān)測重點是高風險人群以及入境人員篩查,及早發(fā)現(xiàn)、及時控制傳染源是疫情防控的關(guān)鍵。病毒核酸檢測是最早應(yīng)用于確診新型冠狀病毒感染的實驗室檢測方法。核酸檢測具有快速、靈敏等優(yōu)點。但是,核酸檢測對實驗室和人員的要求較高,并且會受到病程、標本采集、檢測過程、檢測試劑等多因素影響,往往需要多次采樣才能達到確診目的[4-5]。據(jù)統(tǒng)計,新型冠狀病毒肺炎確診病例的核酸檢測陽性率在30%～50%之間[6],且不同實驗室檢測結(jié)果存在差異。在《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第8版)》的診斷標準中,將“血清學檢測”作為確診依據(jù),即疑似病例“新型冠狀病毒特異性Ig M抗體和IgG陽性”或“新型冠狀病毒特異性IgG抗體由陰性轉(zhuǎn)為陽性或恢復期較急性期4倍及以上升高”也可確診[7],并將Ig M抗體陽性并具有相關(guān)臨床癥狀或流行病學史作為疑似病例的診斷標準。很多隔離點采用膠體金法Ig M檢測試劑進行疑似病例篩查,由于隔離點一般是基層檢驗人員,大部分采用的膠體金檢測法,不同廠家試劑盒的檢驗性能存在一定的差異并且膠體金Ig M檢測普遍特異性不高,結(jié)果判讀依靠肉眼觀察反應(yīng)條帶顯色,受檢測人員個人能力和主觀因素影響較大,容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果,對Ig M初檢陽性的疑似病例統(tǒng)一轉(zhuǎn)入定點醫(yī)院隔離觀察,使定點醫(yī)院有限的醫(yī)療資源難以合理分配,并對Ig M陽性疑似病例個人和社會產(chǎn)生巨大心理壓力。

本研究以76例因2019-nCo V Ig M抗體陽性轉(zhuǎn)入定點醫(yī)院進行隔離觀察的疑似病例為研究對象,綜合臨床癥狀、CT檢查、中和抗體檢測以及3種不同原理抗體檢測試劑對疑似病例是否是確診或排除病例進行判定,并探討不同血清學抗體檢測方法的準確性,提出抗體檢測在疑似病例排查中的應(yīng)用策略。研究發(fā)現(xiàn),76例疑似病例中,通過綜合分析只有3例可以判斷為確診病例,其余73例均判斷為排除病例。值得注意的是,疑似病例入院第1 d采用統(tǒng)一的抗體檢測試劑復查結(jié)果顯示,70%以上的患者血清學檢測呈Ig M/IgG雙陰性或總抗體陰性,提示這76例患者在隔離點進行的2019-nCo V Ig M抗體入院前檢測中存在較大比例的假陽性。由于試劑本身陽性判斷值原因,或者體內(nèi)存在干擾物質(zhì)(類風濕因子、嗜異性抗體、補體、溶菌酶等),或者標本原因(標本溶血、標本被細菌污染、標本貯存時間過長、標本凝固不全等),抗體檢測可能會出現(xiàn)假陽性。本研究對76例疑似病例進行了血清類風濕因子檢測,結(jié)果均為陰性,可排除類風濕因子對結(jié)果的干擾,提示可能是隔離點Ig M初檢使用的試劑采用的膠體金方法學、間接法檢測原理等其他因素導致隔離點Ig M抗體檢測呈陽性反應(yīng)。

對比3種不同原理市售抗體試劑與臨床綜合判斷結(jié)果顯示,CMIA法檢測總抗體和CLIA法檢測Ig M/IgG法對確診病例的檢出能力最好,對3例確診病例不同時間點采集的樣本均能檢出,CMIA法檢測總抗體和CLIA法檢測Ig M/IgG對73例排除病例的檢測特異性分別為97.26%和73.97%,CLIA法檢測Ig M/IgG對3例確診病例不同時間點采集的9份樣本可檢出8份,對73例排除病例的檢測特異性為73.97%,Ig M/IgG單獨檢測的特異性顯著低于CMIA法檢測總抗體,假陽性反應(yīng)大部分為Ig M檢測。從方法學上分析,總抗體檢測采用的是雙抗原夾心法,而Ig M/IgG單獨檢測的原理為捕獲法和間接法,雙抗原夾心法檢測過程中只有抗體分子的兩個Fab臂分別結(jié)合到包被抗原和標記抗原才能被檢出,能夠降低雜蛋白的非特異性干擾。另外,從被檢測物分析,總抗體檢測能夠同時檢測Ig M、IgG和Ig A等多種抗體類型,能夠明顯提高檢測的靈敏度。在對重點人群開展抗體檢測排查疑似病例時,由于雙抗原夾心法檢測總抗體具有高靈敏度和特異性,并且只需要檢測一個測試,出結(jié)果快速準確。因此,先檢測總抗體,出現(xiàn)陽性結(jié)果時再檢測Ig M/IgG,將有效避免Ig M檢測假陽性高的問題,最大化提高排查效率。

2019-nCo V核酸檢測存在一定的假陰性率,血清抗體檢測假陽性率高。如何將核酸檢測和血清學檢測有效結(jié)合起來,做到準確篩查、精準防控,成為影響新冠肺炎疫情防控工作值得關(guān)注的問題?；诖?我們提出針對疑似病例和高危人群的2019-nCo V感染篩查路徑(圖1):針對重點人群篩查,應(yīng)首先進行2019-nCo V核酸檢測,若核酸檢測陽性,收住入院隔離;若核酸檢測陰性,則檢測血清總抗體。若血清總抗體陽性,則需要進行至少2次以上連續(xù)核酸檢測(采樣時間至少間隔24 h),若核酸陽性,收住入院隔離;若核酸陰性,進行血清學Ig M/IgG抗體檢測。若Ig M抗體陽性,無論IgG抗體陰性或陽性,提示急性期或感染期;若Ig M抗體陰性,IgG抗體陽性,應(yīng)觀察IgG抗體滴度變化,如出現(xiàn)4倍及以上升高,則為急性感染;如滴度升高小于4倍,則為既往感染。若血清總抗體陰性,排除新冠感染,必要時選擇另外一種試劑復檢。

圖1 新型冠狀病毒感染高危人群臨床篩查策略Fig.1 Clinical screening strategies for people at high risk of new coronavirus infection

利益沖突:無

引用本文格式:高會霞,李雅楠,劉玉珍,等.新型冠狀病毒抗體檢測在疑似病例排查中的應(yīng)用研究[J].中國人獸共患病學報,2021,37(12):1102-1107,1134.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2021.00.160