文艷蘋,汪皓秋,于新芬,張國忠,周銀燕,錢 昕

登革熱(Dengue fever,DF)是由登革病毒(Dengue virus,DENV)經(jīng)伊蚊叮咬而引起傳播的急性傳染病[1]。DENV最早起源于亞洲或非洲的非人靈長類動物,大約于500～1 000年前進入城鎮(zhèn)循環(huán),分別獨立進化形成4種血清型(DENV-1～DENV-4)[2]。4種血清型均可引起登革熱流行,血清型間氨基酸序列相似性約為65%[3]。

登革熱是全球分布最廣、蔓延最快、發(fā)病人數(shù)最多的蟲媒病毒病。每年東南亞、美洲及環(huán)太平洋等地區(qū)有近500萬人感染登革熱[4],50萬人因此住院治療,2萬人死于該病。我國不是登革熱自然疫源地,疫情主要是由國外輸入病例引起本地季節(jié)性流行。流行范圍逐步從南方、西南省份擴大到東南沿海[5-7],甚至中、北部省份[8]。2019年全球登革熱疫情更為嚴峻,東南亞多個國家的疫情規(guī)模較2018年同期呈顯著上升[9-12],境外輸入風險加大。本研究對2019年杭州登革熱的流行特征、可能來源和分子型別進行分析,以期掌握登革熱的分布規(guī)律和流行趨勢,為制定防控策略提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標本來源與病例資料 醫(yī)療機構采集登革熱疑似病例的非抗凝血液標本,送轄區(qū)CDC進行實驗室檢測。根據(jù)中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準(WS 216-2018)對病例進行診斷和流行病學資料收集。流行病學數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進行分析。

1.2 實驗室診斷 對患者急性期血液標本進行DENV核酸檢測。采用天隆NP968核酸提取儀抽提病毒RNA,用于RT-PCR擴增,所用試劑為登革病毒通用型核酸檢測試劑盒(熒光PCR法)(江蘇碩世生物技術股份有限公司)。DENV RNA檢測為陽性時,再采用登革病毒核酸分型檢測試劑盒(熒光PCR法)(江蘇碩世生物技術股份有限公司)進行型別鑒定?；颊甙l(fā)病時間超過5 d時,則進行Ig M或IgG抗體檢測,試劑為登革熱Ig M抗體檢測ELISA試劑盒或登革熱Ig G抗體檢測ELISA試劑盒(澳大利亞Panbio公司)。實驗步驟參照試劑盒說明書。

1.3 E基因擴增及序列測定 根據(jù)分型結(jié)果,選擇對應的E基因擴增引物[6]。采用大連Ta KaRa公司PrimeScript One Step RT-PCR Kit試 劑 盒(PR055A)進行一步法擴增。RT-PCR循環(huán)條件如下:50℃逆轉(zhuǎn)錄30 min,95℃滅活酶及預變性15 min;94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸90 s,擴增40個循環(huán);72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物測序送北京擎科新業(yè)生物技術有限公司完成。

1.4 序列分析 利用BLASTn檢索NCBI和Virus Pathogen Resource(ViPR)數(shù)據(jù)庫(http://www.viprbrc.org)中參考毒株。使用Clustal X 1.8軟件進行核苷酸序列比對。經(jīng)MEGA-X軟件分析,確定本研究核苷酸序列矩陣的最佳替換模型為TN93＋G,選用鄰接法(neighbor-joining,NJ)構建系統(tǒng)進化樹,Bootstrap值設為1000。選取杭州DENV-1基因IV型本地流行病毒和ViPR中同型毒株的E基因序列,利用Beast軟件計算核苷酸的進化速率和最近共同祖先(the most recent common ancestor,t MRCA)。計算采用relaxed clock exponential分子鐘和coalescent Bayesian skyline方法,共運行1.0×108代,每10 000代進行抽樣。用Tracer分析Beast抽樣產(chǎn)生的數(shù)據(jù)。

2 結(jié) 果

2.1 登革熱流行情況 經(jīng)DENV核酸和Ig M檢測,2019年杭州市共確診登革熱病例212例,其中輸入性病例158例,本地病例54例。輸入性病例全年均有檢出,以6～10月居多(117例)。輸入性病例各區(qū)(縣、市)都有報告,以主城區(qū)及其近郊市區(qū)檢出數(shù)量居多。輸入來源地包括東南亞(129例)、南亞(11例)、非洲、美洲等一些國家及我國南方省份(10例)。本地病例發(fā)病時間集中在7～11月,10個區(qū)(縣、市)均有檢出,其中下城區(qū)(16/54)、江干區(qū)(10/54)、上城區(qū)(7/54)、臨安區(qū)(6/54)病例較多。

輸入性病例患者的年齡范圍為4～69歲,中位數(shù)為37歲,主要集中在21～50歲的青壯年,占輸入性病例的77%(121/158);男性88例,女性70例,男女比例為1.26∶1。本地病例患者的年齡范圍為1～85歲,中位 數(shù) 為39.5歲,多 為20歲 以 上 成人(50/54),年齡層分布較均衡;男性26例,女性28例,男女比例為1∶1.08。

212例登革熱病例中,178例為DENV通用型核酸陽性,65例為Ig M抗體陽性,其中31例Ig M和核酸檢測均為陽性;3類檢測(僅檢測核酸、僅檢測Ig M抗體、Ig M和核酸均檢測)的樣本采集時間距離發(fā)病時間分別為0～5 d、5～13 d和4～10 d,中位數(shù)分別為2 d、7 d和5 d。IgG抗體檢測均為陰性,DENV分型結(jié)果見表1。

表1 杭州市2019年DENV實驗室檢測結(jié)果Tab.1 Detection results of DENV in Hangzhou,2019

2.2 DENV-1的E基因核苷酸序列分析 對DENV-1陽性樣本進行E基因序列測定,共獲得101條序列(1 485 bp)。經(jīng)序列相似性比對和型別分析,發(fā)現(xiàn)基因I型病毒序列69條,基因IV型病毒序列30條,基因V型病毒序列2條。基因I、IV和V型病毒序列間的核苷酸一致性分別為96.0%～100%、99.9%～100%、98.3%。輸入性DENV-1病毒多為基因I型(63/82)和V型(2/82),而本地病例多由基因I型(6/45)和IV型(26/45)病毒引起?；騃型相關的本地病例共報告5起,其中1起為聚集性發(fā)病(3例),另4起均只有1例病例?；騃V型相關的本地病例共報告14起,其中3起為聚集性發(fā)病(8例、8例、7例),另11起均只有1例病例。杭州DENV-1病毒的E蛋白毒力位點和糖基化位點多數(shù)與報道一致[13],僅發(fā)生E156(I)和E366(S)位點變異。

根據(jù)E基因序列一致性和樣本采集時間,選取32條本地病毒序列、12條輸入性病毒序列,以及從ViPR下載的不同國家、地區(qū)的DENV-1毒株序列,構建NJ進化樹。結(jié)果顯示,基因I型本地病毒HZ366、HZ398、HZ654、HZ582、HZ630分布于不同簇中(圖1),分別與2019年廣州流行株19XN29810f、19XN16197、19XN15076、19XN50601以及2019年南昌流行株JX146/2019最相似,核苷酸序列一致性分別為99.9%、100%、99.7%、99.9%和100%?；騃V型本地病毒序列聚攏成簇,與2015年菲律賓株Philippines/1508a Tw和2015年浙江流行株ZJ/29/XS/15最接近,核苷酸序列一致性分別為99.4%～99.5%和99.3%～99.4%。

圖1 2019年杭州DENV-1 E基因核苷酸進化樹Fig.1 Phylogenetic tree based on the E gene of DENV-1 in Hangzhou,2019

由于基因IV型本地病毒的E基因序列高度同源,為分析溯源,選取Event A、Event C的代表性病毒序列,以及從ViPR下載的30株同型毒株(分離自1974－2016年間)序列,進行t MRCA分析。結(jié)果表明,基因IV型病毒的E基因核苷酸平均堿基替代率為9.204×10－4(95%HPD:6.179×10－4～1.243×10－3)替代/位點,Event A和Event C病毒的t MRCA出現(xiàn)在2017年5月(95%HPD:2015年8月至2019年7月)。

2.3 DENV-2的E基因核苷酸序列分析 對DENV-2陽性樣本進行E基因序列測定,共獲得25條序列(1 485 bp)。經(jīng)序列相似性比對和型別分析,發(fā)現(xiàn)Cosmopolitan基因型病毒序列20條,Asian I基因型病毒序列5條,病毒序列間的核苷酸一致性分別是97.8%～99.8%和92.6%～100%。下載不同國家、地區(qū)DENV-2的E基因序列,構建NJ進化樹。結(jié)果顯示本地病毒HZ464、HZ470與2019年杭州輸入性病毒HZ415聚攏成簇(圖2),分布于Cosmopolitan基因型分支,三者序列相似性為100%。其次與2018年泰國株Th18-012DV2最相似,為99.7%。杭州DENV-2病毒的E蛋白毒力位點和糖基化位點保守,僅發(fā)現(xiàn)對應Cosmopolitan基因型的E71(A)和E390(S)位點變異[13-14]。

圖2 2019年杭州DENV-2 E基因核苷酸進化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on the E gene of DENV-2 in Hangzhou,2019

2.4 DENV-3、DENV-4的E基因核苷酸序列分析

12例DENV-3陽性樣本均為輸入性病例,經(jīng)RTPCR擴增和序列測定后,共獲得10條E基因序列(1 479 bp),核苷酸序列一致性為92.6%～100%。基于E基因構建的NJ進化樹中,10條序列分布于基因Ⅰ型和基因Ⅲ型兩大分支中(圖3),其中6例基因Ⅰ型病毒分別與2015－2016年間的菲律賓株、2017年緬甸株聚攏成簇,與病例輸入地相符。另4例基因Ⅲ型病毒多與輸入地周邊地區(qū)的毒株序列較相似。杭州DENV-3病毒的E蛋白僅糖基化位點發(fā)生E153-155(N-E-T)突變。

圖3 2019年杭州DENV-3 E基因核苷酸進化樹Fig.3 Phylogenetic tree based on the E gene of DENV-3 in Hangzhou,2019

對5例輸入性DENV-4病毒進行E基因測序,共獲得4條序列(1 485 bp),核苷酸序列一致性為92.4%～100%?；贓基因構建的NJ進化樹中,HZ461、HZ462與2016－2017年印度株聚攏成簇(圖4),為基因Ⅰ型。HZ150、HZ160與2019年印尼株聚攏成簇,為基因Ⅱ型。DENV-4病毒的E蛋白僅毒力位點發(fā)生E401(M)突變[15]。

圖4 2019年杭州DENV-4 E基因核苷酸進化樹Fig.4 Phylogenetic tree based on the E gene of DENV-4 in Hangzhou,2019

3 討 論

2019年東南亞國家登革熱肆虐[9-12,16],尼泊爾和孟加拉更是遭遇了史上最嚴重的疫情[9,12],病例數(shù)高達1.4萬人和10萬人。疫情多以一種血清型病毒流行為主,同時混雜少量其他血清型病毒。老撾、巴基斯坦、尼泊爾等國以DENV-2流行為主[10-12],孟加拉以DENV-3流行為主[9],而印尼爪哇地區(qū)則以DENV-4流行為主[16]。受東南亞疫情影響,2019年杭州輸入性病例數(shù)量增幅明顯,為2018年的3倍,輸入地多為東南亞國家,型別以DENV-1為主。引起杭州本地流行的DENV-1基因I型病毒與2019年廣州、南昌等地的流行株序列高度相似。與此同時,2019年江西省樟樹市暴發(fā)了由DENV-1引起的本地流行[17]。這說明雖然近年東南亞的流行毒株在逐年更替、變化,但DENV-1仍占較大比例,是引起我國登革熱本地流行的重要型別。

杭州輸入性DENV-1病毒中,雖然基因IV型僅占2.5%(4/158),但大多數(shù)本地病例均由該型引起。3起由DENV-1基因IV型病毒引起的聚集性疫情(Event A、B、C)病例數(shù)占本地病例數(shù)的42.6%(23/54),對應的發(fā)病日期分別為7月24日至8月11日、9月25日至10月19日、9月5日至9月22日。序列分析發(fā)現(xiàn)Event A與Event B病毒的E基因序列100%相似,且8－9月間還另有8例本地病例的E基因序列與這兩起事件的序列相同,家庭住址多在Event A、B所在區(qū)。但這8例病例相互之間以及與Event A、B之間均未發(fā)現(xiàn)流行病學關聯(lián)。究竟是短時間內(nèi)輸入了多例E基因序列完全一致的病毒而引起的散在流行,還是由于登革熱傳播途徑隱蔽,未找到病例間的流行病學關聯(lián),這可能需要借助具有更快進化速率的基因序列或全基因組序列進行分析。然而,為適應媒介生物和動物宿主間的傳播循環(huán),DENV基因組多受凈化選擇的壓力,序列保守[18]。目前,DENV進化分析多采用E基因或pr M/M-E區(qū)基因片段。M蛋白為包膜蛋白,E蛋白為糖蛋白,主要介導病毒與細胞膜融合,與病毒的宿主選擇和毒力相關[2]。我們在分析基因IV型病毒序列時發(fā)現(xiàn),NS2A、NS2B、NS4A、NS4B等基因的序列變異大于E基因,基于以上基因構建系統(tǒng)進化樹也許能提供更精準的信息。

DENV-1基因IV型病毒的E基因堿基替換速率為每年6.179×10－4～1.243×10－3替代/位點,略大于DENV-1的進化速率(2.54×10－4～6.54×10－4替代/位點)[19],這可能與DENV-1各基因型進化速率存在差異有關[1]。根據(jù)此速率推算,Event A和Event C病 毒 的t MRCA應 出 現(xiàn) 在2017年5月(95%HPD:2015年8月至2019年7月)。鑒于2019年杭州登革熱本地病例數(shù)少,Event A病毒短時間內(nèi)發(fā)生突變的概率低,推測Event A和Event C為不同輸入病例引起的本地傳播。且2019年由泰國、菲律賓等地輸入杭州的病毒與Event A-C病毒的E基因序列高度相似,說明該型病毒在東南亞分布較廣,存在較大輸入風險。

雖然DENV基因組多受凈化選擇的壓力,但部分位于B細胞或T細胞表位的氨基酸位點卻受微弱的正向選擇壓力[20],影響毒株系的分化[21]。E390位點位于E蛋白中決定細胞嗜性的結(jié)構域Ⅲ,該位點發(fā)生突變,會影響病毒的神經(jīng)毒力,是決定病毒毒力的重要位點之一[22]。在DENV-2部分基因型中,E390位點呈型特異性,如Asia I基因型中該位點多為N[23],American基因型中均發(fā)生N→D突變[24],而Cosmopolitan基因型多發(fā)生N→S的突變[18]。

受蚊媒分布影響,DENV流行呈區(qū)域化的特點[1]。東南亞、南美洲的某些地區(qū)作為特定DENV型別擴散中心[25-27],向外輸出病例。而距離是影響DENV傳播的顯著因素之一[28],流行毒株系的更替、演變往往借助人類活動向周邊地區(qū)擴散[29-31]。2019年輸入杭州的DENV-3基因Ⅰ型和DENV-4病毒表現(xiàn)出明顯的地域性,而DENV-3基因Ⅲ型病毒則與新加坡、馬來西亞、緬甸、柬埔寨等地病毒序列相近,呈較大范圍擴散。疫源地DENV毒株系的更替往往會造成較大規(guī)模的疫情[32],增強病例的輸出能力。加強病毒擴散核心區(qū)的型別監(jiān)測,能給周邊地區(qū)提出預警,以便采取有效的防控措施。

綜上所述,受東南亞登革熱疫情影響,2019年杭州登革熱病例數(shù)量增幅明顯,呈型別多樣化、本地病例溯源復雜的特點。加強DENV分子流行特征研究,及時發(fā)現(xiàn)本地病例關聯(lián),確定疫點和傳播來源,對疾病防控顯得尤為重要。

利益沖突:無

引用本文格式:文艷蘋,汪皓秋,于新芬,等.杭州市2019年登革病毒分子流行病學研究[J].中國人獸共患病學報,2021,37(12):1096-1101.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2021.00.156