王雪芹，陽 濤

(1 水產健康養(yǎng)殖四川省重點實驗室，四川 成都 610041；2通威股份有限公司動物保健研究所，四川 成都 610041)

隨著人們對鮮活水產品需求的日漸增大[1]，水產動物運輸量也不斷增大，運輸過程中環(huán)境脅迫所引起的水產動物應激反應問題日漸突出，尤其是長時間運輸造成水體的溶氧不斷消耗，會引起魚類強烈的應激反應甚至死亡。適宜的溶氧水平對魚類的生物活動會起到積極作用，當水體低氧時，會造成機體血液生化指標的變化，引起魚類應激反應[2-3]。

應激作用下，魚類機體大量分泌皮質醇(COR)，可調節(jié)糖原、脂肪和蛋白質的代謝[4-6]，加速糖異生，為機體提供能量，對抗應激[7-8]。因此血清COR和葡萄糖(GLU)含量常被作為檢測魚體應激的敏感指標[9]。低氧環(huán)境下，魚體血液攝取和攜帶氧氣的能力會發(fā)生改變，引起血紅蛋白(Hb)和高鐵血紅蛋白(MetHb)等指標的變化[10]；體內熱休克蛋白70(Hsp70)基因的表達量會顯著上調[11]，同時，機體超氧化物歧化酶(SOD)等的活力上升，用以清除過量的活性氧自由基(ROS)[14]，維持正常的生理活動。因此，研究血液相關生化指標的變化，綜合評價魚類在持續(xù)低氧狀態(tài)下的應激水平，對水產動物運輸策略有重大的理論和實踐指導意義。

鯽魚(Carassiusauratus)是中國主要的淡水經濟魚類之一，可作為低氧應激研究的理想魚類對象[15]。本研究在急性低氧條件下，研究鯽魚血液生化指標的變化，以期為鯽魚的科學養(yǎng)殖和運輸提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料

鯽魚購買自成都市新津縣金華鎮(zhèn)養(yǎng)殖戶塘口，魚體質量為(54.24±5.65)g，體長為(14.82±0.41)cm，為同一批次，且健康無病。鯽魚購進后，使用1%食鹽水浸浴5 min，然后將100尾鯽魚暫養(yǎng)于規(guī)格為150 cm×60 cm×70 cm的玻璃缸中(養(yǎng)殖用水體積500 L)。暫養(yǎng)期間保持水體溫度(20.0±0.5)℃，水中溶氧>5 mg/L，pH 7.2～7.6，氨氮≤0.1 mg/L，每天上午使用曝氣自來水換水一次，每次換水量約為養(yǎng)殖水體的1/2。每天投喂飼料兩次，時間分別為9：00和16：30，投飼率約1.5%，飼料為通威飼料152#，2.0 mm粒徑膨化料。暫養(yǎng)10 d后待試驗魚狀態(tài)及攝食穩(wěn)定后開始進行低氧應激試驗。試驗開始前禁食24 h。

1.2 試驗設計

挑選體質健康，質量均勻的鯽魚25尾，放置在150 L的玻璃缸中。低氧水平的設置參考相關文獻[16-18]的研究，溶氧設置為0.6 mg/L。試驗前，完成常氧組(記為0 h，即對照組)的取樣，隨機取5尾，此時的溶氧含量為6.54 mg/L，水溫為20.1℃。隨后往魚缸中持續(xù)注入氮氣，并開始計時，待溶氧下降到0.6 mg/L左右后，調節(jié)氮氣和空氣的注入流量來穩(wěn)定水中的溶氧。分別在試驗進行到3 h、6 h、12 h和24 h時進行采樣。每個時間點從缸中隨機取樣5尾。低氧脅迫期間水體溶氧(0.61±0.23)mg/L，水溫(20.1±0.3)℃。整個試驗期間每1 h用哈希溶氧測定儀對水體溶氧進行監(jiān)測一次。重復試驗3次。

1.3 血液采集

取樣時將魚迅速撈起并立即投入200 mg/L MS-222(間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽，Sigma)中快速深度麻醉，用1 mL注射器尾靜脈采血。其中一部分新鮮血液吸入提前準備好的肝素抗凝管中，用于血液血紅蛋白和高鐵血紅蛋白的測定。剩余血液放入無菌離心管中4℃靜置待其血清析出，4 000 r/min，離心10 min制備血清，血清置于-80℃中保存，用于其他生化指標測定。

1.4 生化指標的測定

血液及血清生化指標測定使用多功能酶標儀(型號：Bio Tek Epoch)和紫外分光光度計(型號：MAPADA UV-1100)，試劑盒采購自南京建成生物工程研究所。檢測指標包括血紅蛋白(Hb)和高鐵血紅蛋白(MetHb)；血清激素指標皮質醇(COR)；血清生化指標葡萄糖(GLU)；血清功能性蛋白指標熱休克蛋白70(Hsp70)；抗氧化指標超氧化物歧化酶(SOD)。

1.5 數據分析

數據以平均值±標準差(Mean±SD)表示，試驗結果用 SPSS 17.0 軟件進行單因素方差分析(ANOVA)，當差異顯著時(P<0.05)，進行Ducan多重比較。

2 結果

2.1 Hb和MetHb的含量

急性低氧應激對Hb含量的影響見圖1 A。在急性低氧應激過程中，Hb含量呈現先下降后上升的變化趨勢，低氧應激3 h、6 h時，Hb含量與0 h均無顯著性差異(P>0.05)，12 h時Hb含量顯著降低(P<0.05)，24 h時，Hb含量又恢復至0 h水平。

由圖1 B可知，急性低氧應激過程中，MetHb含量呈現先微微上升，后快速下降的變化趨勢。低氧應激3 h、6 h，MetHb含量與0 h均無顯著性差異(P>0.05)，12 h和24 h的MetHb含量較0 h顯著下降，24 h的MetHb含量與0 h有極顯著差異(P<0.01)。

圖1 急性低氧應激對鯽魚血紅蛋白(A)和高鐵血紅蛋白(B)含量的影響Fig.1 Effects of acute hypoxia stress on hemoglobin(A)and methemoglobin(B)concentrations in Carassius auratus

2.2 血清COR和GLU含量

急性低氧應激對血清COR含量的影響見圖2 A。COR含量變化受低氧應激影響顯著，在低氧應激過程中，COR含量在應激3 h時含量顯著性升高(P<0.05)，3 h后便開始迅速下降，應激6 h時COR含量降低至0 h水平，12 h和24 h的COR含量繼續(xù)降低，且這兩個時間點與0 h存在顯著性差異(P<0.05)。

由圖2 B可知，GLU含量隨著低氧應激時間的延長呈現先升高后降低的變化趨勢。低氧應激過程中，GLU含量快速升高，3 h、6 h、12 h、24 h時，GLU 含量全部高于0 h水平，且存在顯著性差異(P<0.05)，12 h時GLU含量達到最高峰。24 h時含量降低至6 h的含量水平，與0 h血糖含量相比仍然存在極顯著差異(P<0.01)。

圖2 急性低氧應激對鯽魚血清皮質醇激素(A)和葡萄糖(B)含量的影響Fig.2 Effects of acute hypoxia stress on serum cortisol(A)and glucose(B)concentrations in carassius auratus

2.3 Hsp70含量

急性低氧應激對血清Hsp70含量的影響見圖3 A。血清Hsp70含量隨著低氧應激時間的延長呈現明顯的先升高后降低的變化趨勢。應激3 h血清Hsp70含量顯著性升高(P<0.05)，6 h含量達到最高峰，之后呈現下降趨勢，應激12 h血清Hsp70含量降至3 h含量水平，之后Hsp70含量繼續(xù)下降，24 h時Hsp70含量顯著低于0 h水平(P<0.05)。

圖3 急性低氧應激對鯽魚血清熱休克蛋白70含量(A)和超氧化物歧化酶活力(B)的影響Fig.3 Effects of acute hypoxia stress on serum heat shock protein70(A)concentrations and superoxide dismutase activity(B)in Carassius auratus

2.4 血清SOD酶活力

由圖3B可知，鯽魚血清SOD活力在急性低氧3～12 h持續(xù)緩慢升高，24 h又有所下降，總體呈現先升后降的變化趨勢，但各個時間點上SOD酶活力的變化差異不顯著(P>0.05)。

3 討論

3.1 急性低氧應激對Hb和MetHb的影響

本研究結果顯示，低氧應激12 h鯽魚血清Hb含量較應激前水平降低約25%，24 h又恢復到應激前水平。這與王曉雯[19]的研究結果基本一致，西伯利亞鱘魚(Acipenserbaerii)Hb含量在低氧處理3 h含量降低31.3%。Hb含量代表機體攜帶和運輸氧氣的能力。鯽魚的Hb在低氧應激后呈現先降低后升高的變化趨勢，可能是隨著氧氣的消耗及機體缺氧程度的增加，血紅蛋白含量下降，以降低血氧親和力，使更多的氧氣供其他身體組織使用，后期機體逐漸由有氧呼吸轉為無氧呼吸方式，因此Hb含量又恢復至應激前水平。另有研究發(fā)現試驗魚血液Hb含量與溶氧水平呈負相關，張曦等[20]研究發(fā)現鯽魚幼魚在急性低氧條件下處理3 h，Hb含量增加58%。董曉煜等[21]、黃國強等[22]也得到類似結論。此類研究認為血紅蛋白與氧氣結合的程度受到PO2的影響，當PO2較低，血紅蛋白與氧結合能力降低，機體血紅蛋白的增加可以補償由于水體溶氧較低造成的機體缺氧[23]。

MetHb是Hb的氧化產物，不能攜帶氧。本研究中，隨著低氧時間的延長，試驗魚缺氧的程度不斷加強，MetHb含量降低，意味著血紅蛋白更多的是以可與氧結合的形式存在于血液中，更加有利于機體對氧氣的充分利用，這可能與機體自身的防御性機制有關。一般研究顯示，MetHb含量受水體亞硝酸鹽含量影響較大，而有關低氧對其含量影響的研究較少[24]。

3.2 急性低氧應激對血清COR和GLU含量的影響

本研究結果顯示，鯽魚血清COR在低氧應激后呈現短時間內快速大量分泌，用以促進葡萄糖的大量產生，為機體供能。另有大量研究發(fā)現，運輸應激[25]、擁擠應激[26]、溫度應激[27]、氨氮應激[28]都會使試驗魚血清COR含量在一定時間內迅速升高。低氧處理后期COR含量又迅速降低，這可能與COR的負反饋調節(jié)有關。

鯽魚在急性低氧應激后，血清GLU含量快速升高，與齊明等[3]、陳德舉等[29]、黃建盛等[30]、劉旭佳等[31]、王慧娟等[32]的研究結果一致。說明急性低氧脅迫導致魚體出現應激性血糖升高，為機體提供能量并應對和適應應激脅迫，是一種機體自我保護機制的體現。隨著能量的大量消耗，應激反應后期，GLU水平就隨之下降。這也與試驗過程中觀察到的試驗魚狀態(tài)相吻合，隨著低氧時間的延長，能量消耗嚴重，試驗魚活力減弱，出現靜止不動，昏迷，失衡等情況。除了低氧應激，魚類受到的其他大多數應激也伴隨著血糖的升高，如水溫變化[33]、氨氮脅迫[34]、擁擠脅迫[35]和干露脅迫[36]等。

3.3 急性低氧應激對血清Hsp70含量的影響

本研究中，鯽魚在急性低氧應激后血清Hsp70含量先顯著性升高，24 h時又大幅度下降。王曉陽[37]研究發(fā)現，低氧條件下，鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)的心臟、腦、肝臟、脾等不同組織中，Hsp70基因表達在不同時間點均有不同程度的上調。崔彥婷等[38]、王曉雯等[39]研究高溫應激后試驗魚肝臟Hsp70基因表達呈現先升高后降低的變化趨勢，與本研究結果一致。HSPs表達被認為是生物細胞抵抗有害刺激，維持內環(huán)境穩(wěn)定最原始的機制之一，當然，如果應激強度過大，造成細胞的膜結構損傷和蛋白質結構改變，就會使HSPs的表達合成降低[11]。

3.4 急性低氧應激對血清SOD活力的影響

本研究中，鯽魚血清SOD活力總體呈現先升后降的變化趨勢，但各個時間點酶活力均稍高于應激前水平。這與陳世喜等[40]和王維政等[41]對試驗魚在低氧環(huán)境下肝臟SOD活力的研究結果一致。熊向英等[42]研究同樣顯示，鯔魚(Mugilcephalus)血漿中的總超氧化物歧化酶(T-SOD)活力在低氧條件下有所升高。但在有些情況下，低氧應激會導致抗氧化相關酶活性被抑制，如王曉雯等[19]和郭志雄等[43]研究發(fā)現，低氧處理后試驗魚肝臟SOD活力明顯降低，認為低氧應激后肝臟中產生了過多的活性氧自由基(ROS)，從而抑制了酶活性。另有研究發(fā)現[44-45]，低氧處理后，不同組織中的SOD活性變化趨勢不同，這可能與不同組織在受到脅迫后的損傷程度不同，或是組織內SOD酶活對環(huán)境因子的敏感程度和調節(jié)機制不同導致。

4 結論

急性低氧應激條件下，鯽魚的血液生化指標Hb、MetHb、COR、GLU、Hsp70會隨著應激時間的延長和低氧程度的增加產生顯著性的變化，暗示低氧應激對水產動物激素分泌、血細胞水平、能量利用和機體抗應激相關酶的活力等方面產生重要影響。因此，在水產動物運輸過程中，注重水體溶氧監(jiān)測及其他水質指標的調控，謹防由于低氧引起的魚類應激反應的發(fā)生，降低運輸損傷、提高運輸存活率。此外，Hb、COR、GLU、Hsp70等指標在用于水產動物機體應激水平的評價方面具有重要指導意義。

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