喻秀峰, 周增麗, 盧旭東, 龍思琴

0 引言

酗酒已經(jīng)成為當(dāng)今世界普遍存在的嚴(yán)重社會問題, 近年來隨著經(jīng)濟的發(fā)展和人們生活方式的改變, 我國酒精制品的消費規(guī)模大幅增加[1]. 大量研究結(jié)果均證實, 肝臟是乙醇代謝和解毒的主要器官, 而長期過量攝入乙醇會引起肝損傷[1,2]. 現(xiàn)今, 隨著我國酗酒人數(shù)的不斷增加, 酒精已經(jīng)成為僅次于肝炎病毒的導(dǎo)致慢性肝病的第二大原因[3]. 酒精性肝病(alcoholic liver disease, ALD)的病程一般包括酒精性脂肪肝、脂肪性肝炎、肝纖維化和肝硬化, 若無有效的干預(yù)措施, ALD甚至?xí)l(fā)展成肝細(xì)胞癌并最終導(dǎo)致患者死亡[4].

柚皮素(naringenin, Nar)是一種具有抗炎和抗氧化作用的類黃酮天然化合物[5]. 目前研究發(fā)現(xiàn), Nar可在如對乙酰氨基酚[6]、四氯化碳[7]和高效氯氟氰菊酯[8]等因素所致急性肝損傷動物模型中發(fā)揮肝保護作用. 而, Nar對ALD中是功效以及具體作用機制尚不清楚. 本研究應(yīng)用ALD大鼠模型探討Nar對ALD是否發(fā)揮肝保護作用以及機制.

1 材料與方法

1.1 材料試劑與抗體: 柚皮素(Nar; 純度>98%)購自南京春秋生物工程有限公司; 谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase, ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase, AST)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所; 谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GPx)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)以及活性氧(reactive oxygen species, ROS)檢測試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司; Bio-Rad蛋白測定盒購自美國Bio-Rad公司; 兔源腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)和白介素-6(interleukin-6, IL-6)抗體購自美國Abcam公司; 生物素偶聯(lián)山羊抗兔IgG和辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素親和素復(fù)合物購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司; 兔源核因子(nuclear factor, NF)-κB P65、兔源p-NF-κB P65、兔源核因子紅細(xì)胞2相關(guān)因子2 (nuclear factor erythroid derived 2-related factor 2, Nrf-2)和兔源血紅素氧合酶1(heme oxygenase 1, HO-1)和兔源GAPDH抗體以及辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自萬類生物技術(shù)有限公司.

實驗動物: 40只清潔級6-7周齡SD雄性大鼠(體重185-200 g)購于浙江維通利華實驗動物技術(shù)有限公司(生產(chǎn)許可證號: SCXK(浙)2019-0001), 所有大鼠均飼養(yǎng)于維持室溫22 ℃-25 ℃、濕度50%-65%和光照/黑暗12 h/12 h循環(huán)的動物房, 大鼠可自由飲水飲食. 本研究的動物實驗操作符合動物福利倫理要求, 且獲得了麗水市人民醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn).

1.2 方法

1.2.1 動物模型建立與分組處理: 大鼠經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后, 將其隨機分為4組: 對照組, 模型組(Model組), 低劑量Nar組(Model+Nar-L組)和高劑量Nar組(Model+Nar-H組), 每組10只. 結(jié)合文獻(xiàn)[9-11]的方法, 除對照組外, 所有大鼠用10%酒精(8 mL/kg/d, 分為早晚各1次)灌胃1 wk, 用15%酒精(8 mL/kg/d, 分為早晚各1次)灌胃1 wk, 用30%酒精(8 mL/kg/d, 分為早晚各1次)灌胃1 wk, 用56%酒精(8 mL/kg/d, 分為早晚各1次)灌胃7 wk, 對照組用等體積蒸餾水灌胃10 wk. 其中, 結(jié)合文獻(xiàn)[7,8,12,13]的劑量, Model+Nar-L組與Model+Nar-H組在第4-10周分別灌胃給藥25 mg/kg/d和100 mg/kg/d Nar. 在第10周結(jié)束后, 所有大鼠用水合氯醛麻醉后, 收集血液樣本和肝組織以進行進一步檢測.

1.2.2 血清轉(zhuǎn)氨酶水平檢測: 根據(jù)試劑盒說明書的步驟, 取大鼠血清通過AU480全自動生化分析儀(Beckman Coulter, 美國)對血清中ALT和AST含量進行檢測.

1.2.3 肝組織生化檢測: 每只大鼠稱取200 mg肝組織, 在1.8 mL預(yù)冷的生理鹽水中勻漿, 1500×g離心5 min, 收集勻漿液. 取勻漿液首先按照Bio-Rad蛋白測定盒方法檢測勻漿液中蛋白濃度. 然后, 再取勻漿液, 分別按照檢測試劑盒說明書步驟, 檢測勻漿液中GPx活性、SOD活性、MDA含量和ROS生成水平. 最后, 將勻漿液中上述因子的含量按照蛋白濃度進行標(biāo)準(zhǔn)化處理.

1.2.4 組織病理學(xué)觀察: 用4%的多聚甲醛固定肝組織, 然后按照常規(guī)流程進行石蠟包埋. 將石蠟組織, 切為5 μm厚的石蠟切片, 并在脫蠟至水后, 用HE染色, 在光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn).

1.2.5 免疫組織化學(xué)染色: 取肝組織石蠟切片(5 μm厚)依次經(jīng)脫蠟、水化和3%雙氧水封閉內(nèi)源性過氧化氫酶后, 用山羊血清封閉切片20 min. 然后, 將切片在4 ℃條件下用TNF-α和IL-6抗體(1:100稀釋)孵育過夜, PBS洗切片3次, 用生物素偶聯(lián)抗兔二抗(1:100稀釋)室溫孵育45 min, PBS洗切片3次, 用辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素親和素復(fù)合物(1:200稀釋)室溫孵育30 min. PBS洗切片3次, 用DAB顯色并用蘇木精復(fù)染. 顯微鏡下觀察, 并使用Image-Pro plus系統(tǒng)對肝組織中TNF-α和IL-6的表達(dá)進行統(tǒng)計分析.

1.2.6 Western blot: 取各組肝組織, 勻漿并提取蛋白后, 行Western blot檢測肝組織中Nrf-2、HO-1和p-NF-κB P65蛋白表達(dá)情況. Nrf-2、HO-1和NF-κB P65抗體的稀釋度為1:3000, p-NF-κB P65抗體的稀釋度為1:1000, 選用GAPDH作為內(nèi)參, 以過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG為二抗(稀釋度為1:1000). 用ECL發(fā)光底物顯像后, 用Image-Pro plus系統(tǒng)對肝組織中Nrf-2、HO-1和p-NFκB P65蛋白的表達(dá)進行統(tǒng)計分析.

統(tǒng)計學(xué)處理結(jié)果表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD), 多組數(shù)據(jù)間均數(shù)的兩兩比較采用單因素方差分析事后SNK-q檢驗. 以P<0.05時, 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計意義.

2 結(jié)果

2.1 Nar減輕ALD大鼠的肝損傷如圖1所示, 與對照組比較, 模型組大鼠血清中ALT和AST活性顯著升高(P<0.001); 與模型組相比, 不同劑量Nar組大鼠血清中ALT和AST活性均降低(P<0.05, P<0.01或P<0.001), 且高劑量組更顯著(P<0.001). 這些結(jié)果說明, Nar能減輕ALD大鼠的肝損傷.

圖1 Nar對ALD大鼠血清中ALT和AST活性的影響. A: 各組大鼠血清ALT活性; B: 各組大鼠血清AST活性. Nar: 柚皮素; ALD: 酒精性肝病; ALT: 谷丙轉(zhuǎn)氨酶; AST: 谷草轉(zhuǎn)氨酶. mean±SD, n = 10, 與對照組相比, fP<0.001; 與模型組相比, aP<0.05, bP<0.01, cP<0.001.

2.2 Nar改善ALD大鼠肝臟的組織形態(tài)表現(xiàn)對照組大鼠的肝小葉結(jié)構(gòu)清晰, 肝細(xì)胞排列規(guī)則, 無變性壞死及炎細(xì)胞浸潤. 模型組大鼠的肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂, 肝細(xì)胞體積增大且存在不同程度氣球樣變和脂肪變, 部分細(xì)胞壞死, 部分匯管區(qū)可見炎細(xì)胞浸潤. 不同劑量Nar組大鼠肝組織細(xì)胞氣球樣變、脂肪變范圍以及變性壞死和炎細(xì)胞浸潤程度相對模型組有明顯改善, 且高劑量組效果更為明顯(圖2).

圖2 各組大鼠肝組織的代表性HE染色圖(100×).

2.3 Nar降低ALD大鼠肝組織的氧化應(yīng)激水平圖3A和3B結(jié)果顯示, 與對照組相比, 模型組大鼠肝組織中的抗氧化酶SOD和GPx活性均明顯降低(P<0.001); 與模型組相比, 不同劑量Nar組大鼠肝組織中SOD和GPx活性均明顯升高(P<0.05, P<0.01或P<0.001), 且高劑量組更顯著(P<0.001). 此外, 與對照組相比, 模型組大鼠肝組織中MDA含量明顯升高(P<0.001), 反映ALD大鼠體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度升高; 與模型組相比, 不同劑量Nar組大鼠肝組織中MDA含量明顯降低(P<0.01或P<0.001), 其中高劑量組效果尤為明顯(P<0.001)(圖3C). 對大鼠肝臟中ROS水平的檢測顯示, 與對照組相比, 模型組大鼠肝組織中ROS生成水平增加(P<0.001); 與模型組相比, 不同劑量Nar組大鼠肝組織中ROS生成水平明顯降低(P<0.05或P<0.01), 其中高劑量組效果尤為明顯(P<0.01)(圖3D). 以上結(jié)果說明, Nar能降低ALD大鼠肝組織的氧化應(yīng)激水平.

圖3 柚皮素(naringenin, Nar)對酒精性肝病(alcoholic liver disease, ALD)大鼠肝臟中抗氧化酶、脂質(zhì)過氧化以及活性氧生成水平的影響.

2.4 Nar對ALD大鼠肝組織中TNF-α和IL-6表達(dá)的影響免疫組織化學(xué)結(jié)果(圖4)顯示, 與對照組相比, 模型組大鼠肝組織中TNF-α和IL-6水平明顯升高(P<0.001); 與模型組相比, 不同劑量Nar組大鼠肝組織中TNF-α和IL-6水平均明顯降低(P<0.01或P<0.001), 且高劑量組更顯著(P<0.001). 以上結(jié)果說明, Nar能降低ALD大鼠肝組織的炎性反應(yīng).

圖4 Nar對ALD大鼠肝組織中TNF-α和IL-6表達(dá)的影響(200×). A: 各組大鼠肝組織代表性的TNF-α和IL-6免疫組織化學(xué)染色圖; B和C: 各組大鼠肝組織中TNF-α(B)和IL-6(C)半定量分析的統(tǒng)計結(jié)果. Nar, 柚皮素; ALD: 酒精性肝病; TNF-α: 腫瘤壞死因子-α; IL-6: 白介素-6. mean±SD, n = 10, 與對照組相比, fP<0.001; 與模型組相比, bP<0.01, cP<0.001.

2.5 Nar對ALD大鼠肝組織中Nrf-2/HO-1和NF-κB信號活性的影響Western blot結(jié)果(圖5)顯示, 與對照組相比, 模型組大鼠肝組織中Nrf-2、HO-1和p-NF-κB P65蛋白水平均明顯升高(P<0.05或P<0.001); 與模型組相比, 不同劑量Nar組大鼠肝組織中Nrf-2和HO-1蛋白水平均進一步升高(P<0.01或P<0.001), 而p-NF-κB P65蛋白水平則明顯降低(P<0.01或P<0.001), 且高劑量組更顯著(P<0.001). 以上結(jié)果說明, Nar能增強ALD大鼠肝組織中Nrf-2/HO-1信號活性和減弱NF-κB信號活性.

圖5 Nar對ALD大鼠肝組織中Nrf-2/HO-1和NF-κB信號活性的影響. A-C: Western blot檢測各組大鼠肝組織中Nrf-2和HO-1的蛋白表達(dá)情況; D-E: Western blot檢測各組大鼠肝組織中p-NF-κB P65的蛋白表達(dá)情況. Nar: 柚皮素; ALD: 酒精性肝病; 核因子紅細(xì)胞2相關(guān)因子2: Nrf-2; HO-1: 血紅素氧合酶1; NF-κB P65: 核因子-κB P65. mean±SD, n = 5, 與對照組相比, eP<0.05, fP<0.001; 與模型組相比, bP<0.01, cP<0.001.

3 討論

長期酗酒可導(dǎo)致肝損傷、肝纖維化形成, 并最終出現(xiàn)肝硬化甚至肝癌[4]. 由于ALD發(fā)生和發(fā)展的病理機制復(fù)雜, 造成目前大多用于治療慢性肝損傷的西藥對ALD未獲得令人滿意的治療效果[14]. 從天然中藥材中篩選具有低毒、肝保護、抗炎和抗氧化等生物活性的天然小分子化合物逐漸成為這類肝病治療的新方向[15,16]. Nar是一種具有抗炎和抗氧化作用的二氫黃酮類化合物[5], 其已被發(fā)現(xiàn)在各種因素所致急性肝損傷動物模型中發(fā)揮肝保護作用[6-8,13]. 而, Nar對ALD中是功效以及具體作用機制尚不清楚. 因此, 本研究通過酒精誘導(dǎo)法建立大鼠ALD模型, 并觀察Nar對ALD作用及可能機制.

本研究首先通過檢測Nar對ALD模型大鼠的肝功能和病理形態(tài)學(xué)的影響來評估其療效. AST和ALT作為評估肝臟功能的關(guān)鍵生物學(xué)指標(biāo), 能夠直接反應(yīng)肝臟損害的程度[17]. 病理形態(tài)學(xué)改變能直觀體現(xiàn)到肝損傷情況. 本研究結(jié)果顯示, ALD模型大鼠的血清ALT和AST水平顯著增加和肝臟組織形態(tài)學(xué)發(fā)生明顯改變, 而Nar處理可以降低ALT和AST水平和改善肝臟組織形態(tài)學(xué), 說明Nar是潛在的抗ALD的藥物.

本研究進一步對Nar減輕酒精導(dǎo)致的肝損傷的機制進行探索. 長期的氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)是影響肝損傷進展的主要驅(qū)動因素[18,19]. Nrf-2信號是機體氧化/還原調(diào)控系統(tǒng)最主要的信號途徑. 當(dāng)肝臟外界刺激時, Nrf-2被激活, 進一步增強Nrf-2活性可通過促進下游抗氧化基因如SOD和GPx表達(dá), 對ROS誘導(dǎo)的肝氧化損傷起到關(guān)鍵的防御作用[20,21]. SOD可通過催化自由基的歧化反應(yīng)來防止自由基與膜脂和蛋白質(zhì)間發(fā)生繼發(fā)反應(yīng)來減少對肝細(xì)胞的損傷[18]; GPx則是一種重要的過氧化物分解代謝酶, 可以清除自由基并保護細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)免受自由基損害[22]. 本研究結(jié)果表明, Nar不僅能增強ALD大鼠肝組織中Nrf-2表達(dá)以及GPx和SOD的活性還能抑制MDA含量和ROS生成水平, 從而保護大鼠肝臟使其免受酒精引起的氧化應(yīng)激損傷; 這與前人的研究結(jié)果(Nar可通過降低氧化應(yīng)激水平來達(dá)到抑制對乙酰氨基酚、高效氯氟氰菊酯和阿霉素造成的肝損傷)相符合[6,8,23]. 此外, 長期飲酒能使肝組織對炎性反應(yīng)敏感, 且高水平的促炎因子能加劇肝損傷. 已有研究[24,25]報道, 增強Nrf-2活性可進一步促進抗氧化劑HO-1的蛋白表達(dá), 以維持氧化平衡的方式抑制NF-κB信號活性, 從而抑制肝臟中的炎性反應(yīng). 我們的研究結(jié)果表明, Nar可促進酒精引起的肝組織中HO-1的蛋白表達(dá)以及降低p-NF-κB P65表達(dá)和促炎因子TNF-α和IL-6的水平; 提示, 在ALD大鼠肝組織中, Nar可能通過增強Nrf-2/HO-1信號活性并降低NF-κB活化來達(dá)到抗炎的效應(yīng).

4 結(jié)論

總之, 本研究結(jié)果表明, Nar可能通過抗氧化和抗炎的作用來預(yù)防酒精誘發(fā)的肝損傷.

文章亮點

實驗背景

長期酗酒會引起酒精性肝病(alcoholic liver disease, ALD), ALD不僅能引起肝損傷還可能導(dǎo)致肝硬化和肝細(xì)胞癌.

實驗動機

柚皮素(naringenin, Nar)已被證明其具有抗炎和抗氧化作用, 且還發(fā)現(xiàn)其具有肝保護作用. 而Nar是否能抑制ALD以及其機制并不清楚.

實驗?zāi)繕?biāo)

以ALD大鼠模型探討Nar對ALD大鼠肝損傷的影響并分析其作用機制.

實驗方法

用酒精誘導(dǎo)法建立ALD大鼠模型, 并給予Nar治療. 收集血樣和肝組織, 并用生化法、組織學(xué)法和Western blot法檢測Nar對肝損傷標(biāo)記物谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶、炎癥因子腫瘤壞死因子-α和白介素-6、氧化應(yīng)激相關(guān)標(biāo)記物谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶、丙二醛和活性氧簇、以及Nrf-2/HO-1和NF-κB信號活性的影響.

實驗結(jié)果

Nar可降低ALD大鼠的肝損傷、氧化應(yīng)激水平以及炎癥, 并能增強肝組織中Nrf-2/HO-1活性和減弱NF-κB活性.

實驗結(jié)論

Nar能通過抗氧化和抗炎途徑在ALD大鼠中發(fā)揮肝保護作用.

展望前景

Nar可能是潛在的用于ALD治療的肝保護劑.