林帥軍，楊忠杰，榮曉哲，杜躍亮，王瑞，于曉濤

（漯河市第一人民醫(yī)院，河南 漯河 462005）

在全球范圍內(nèi)有超過200 萬人是慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）患者［1］。尿毒癥（uremia）是指與慢性腎臟?。–KD）患者全身器官功能障礙相關(guān)的各種臨床綜合征，導(dǎo)致許多蛋白質(zhì)結(jié)合和水溶性代謝物（稱為尿毒癥溶質(zhì)）在血漿中積聚、多器官功能障礙和腸道菌群失調(diào)等［2］。

目前尿毒癥的主要治療手段是腎移植或血液透析，由于腎源稀少，大部分患者選擇透析治療。血液透析可清除慢性腎衰竭患者體內(nèi)毒素，使患者生存質(zhì)量顯著提升，但是長時(shí)間的血液透析不僅會出現(xiàn)并發(fā)癥，還會影響患者的預(yù)后［3］。但是血液透析對于凈化患者體內(nèi)內(nèi)源及外源性毒素的具有較好效果，但并不能改善患者的腎功能［4］，而中醫(yī)藥不僅可改善患者的生存質(zhì)量，調(diào)節(jié)腎臟血液循環(huán)，提高腎小球?yàn)V過率，并且提高了患者的腎功能，因此可被用于輔助治療慢性腎衰竭患者［5］。

近年來基因芯片技術(shù)與高通量技術(shù)可測量人類基因組內(nèi)多個(gè)基因的表達(dá)變化，被廣泛應(yīng)用于疾病過程和生物功能障礙的分子途徑的闡明以及藥物治療靶點(diǎn)的篩選［6－7］。本研究利用基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫（GEO）檢索尿毒癥基因芯片，對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析并篩選尿毒癥組與正常組的差異表達(dá)基因，通過構(gòu)建差異基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)而發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵基因，對關(guān)鍵基因進(jìn)行GO 功能分析和KEGG 通路分析，明確關(guān)鍵基因主要涉及通路，依托Coremine Medical 數(shù)據(jù)庫篩選以關(guān)鍵基因?yàn)榘悬c(diǎn)的潛在治療中藥，以期為尿毒癥的分子機(jī)制及潛在治療中藥提供新研究思路及理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)提取

從基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下載編號為GSE37171 的基因片段原始數(shù)據(jù)［8］。該數(shù)據(jù)集包括年齡在18至75歲之間、臨床穩(wěn)定等待腎移植、未接受免疫抑制藥物治療的5 期腎病患者75 個(gè)和40 個(gè)正常人外周血的基因芯片數(shù)據(jù)，該片段平臺為GPL570［HG－U133_Plus_2］Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array。

1.2 數(shù)據(jù)處理

基于R 語言（https：//www.r－project.org/）“l(fā)immar”包對尿毒癥患者外周血和正常人外周血樣品中每個(gè)探針進(jìn)行數(shù)據(jù)歸一化，對于一個(gè)基因?qū)?yīng)多個(gè)探針的，合并多個(gè)探針并取其平均值，對樣本標(biāo)準(zhǔn)化的結(jié)果采用箱式圖和主成分分析圖查看。

1.3 差異基因

通過R 語言中與GPL570 平臺相對應(yīng)“hgu133plus 2. db”包將探針轉(zhuǎn)換成基因名稱，并且以log2（fold change）的絕對值> 1 和調(diào)整的P< 0.05 為篩選標(biāo)準(zhǔn)，篩選差異表達(dá)基因（DEGs），負(fù)數(shù)代表下調(diào)，正數(shù)代表上調(diào)，利用R語言“ggpubr”和“pheatmap”包制作差異表達(dá)基因的火山圖和熱圖。

1.4 篩選關(guān)鍵基因

利用String數(shù)據(jù)庫［9］（https：//string－db.org/）以medium confidence>0.4為篩選條件對DEGs進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用（PPI）分析，利用Cytoscape 軟件（version3.7.2）的CytoHubba 插件對PPI 互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行差異基因篩選以獲得關(guān)鍵基因，具有高degree 的蛋白更傾向于是關(guān)鍵蛋白，因此以degree 對節(jié)點(diǎn)進(jìn)行排名綜合篩選關(guān)鍵基因。

1.5 關(guān)鍵基因的功能注釋

利用DAVID 數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）對關(guān)鍵基因進(jìn)行基因功能富集分析。使用kobas 數(shù)據(jù)庫（http：//kobas.cbi.pku.edu.cn/）［10］以P< 0.05 作為顯著性富集篩選標(biāo)準(zhǔn)對關(guān)鍵基因進(jìn)行KEGG 通路富集分析。

1.6 基于Coremine Medical數(shù)據(jù)庫的中藥篩選

將關(guān)鍵基因?qū)隒oremine Medical 數(shù)據(jù)庫（http：//www.coremine.com/）中，基因和對應(yīng)藥物映射以P<0.05篩選具有潛在治療作用的中藥。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)預(yù)處理

對GSE37171 的基因片段原始數(shù)據(jù)過濾后最終獲取20864 個(gè)基因表達(dá)水平數(shù)據(jù)。樣本標(biāo)準(zhǔn)化箱式圖結(jié)果顯示腎病患者和正常人外周血樣本中位數(shù)在一個(gè)水平線上，說明樣本間歸一化程度好，見圖1A。PCA 圖顯示uremia 和正常組外周血樣本表達(dá)基本能夠區(qū)分，見圖1B。

圖1 GSE37171數(shù)據(jù)質(zhì)量分析

2.2 差異基因結(jié)果

對GSE37171 的基因片段原始數(shù)據(jù)探針轉(zhuǎn)化后，以log2（Fold change）的絕對值> 1 和調(diào)整的P< 0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)，總共得出571 個(gè)差異表達(dá)基因，其中包括526 個(gè)上調(diào)基因和45 個(gè)下調(diào)基因，差異表達(dá)基因的火山圖見圖2；下調(diào)和上調(diào)最顯著40 個(gè)基因的聚類熱圖見圖3。

圖2 DEGs火山圖

圖3 DEGs聚類熱圖

2.3 差異表達(dá)基因的PPI 網(wǎng)絡(luò)模塊分析及關(guān)鍵基因篩選

基于STRING 數(shù)據(jù)庫的PPI分析得到了uremia組顯著差異基因的PPI網(wǎng)絡(luò)，總共543個(gè)節(jié)點(diǎn)，1 258個(gè)互作關(guān)系?；贑ytoscape的CytoHubba插件對PPI網(wǎng)絡(luò)各個(gè)節(jié)點(diǎn)基因進(jìn)行評分排序，得到網(wǎng)絡(luò)中的核心節(jié)點(diǎn)基因。使用Degree 算法計(jì)算出的15 個(gè)關(guān)鍵基因?yàn)镋P300、UBE2D1、SIRT1、PPP2CA、RANBP2、SMARCA5、DHX15、TLR4、UBE2E2、SRSF2、UBE2E1、RBBP4、DDX5、YWHAZ和CDKN1B，數(shù)據(jù)見表1，關(guān)鍵基因模塊見圖4。

圖4 關(guān)鍵基因互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)

表1 差異表達(dá)基因中Degree排名前15的基因

2.4 關(guān)鍵基因GO功能富集和KEGG通路分析

使用DAVID 對關(guān)鍵基因進(jìn)行GO 分析。GO 分析結(jié)果顯示差異基因主要參與的生物過程（BP）為K48蛋白連接泛素化、細(xì)胞對熱反應(yīng)的調(diào)節(jié)、細(xì)胞生長的負(fù)調(diào)控、ISG15－蛋白結(jié)合、RNA 拼接；細(xì)胞成分（CC）：核漿、核、NURF 復(fù)合體、染色質(zhì)沉默復(fù)雜、ESC/E（Z）復(fù)合體；分子功能（MF）：蛋白結(jié)合、泛素結(jié)合酶活性、ISG15轉(zhuǎn)移酶活性、組蛋白結(jié)合、ATP結(jié)合。見圖5。

圖5 關(guān)鍵基因的GO 富集分析

Kobas富集分析（P<0.05）共篩選出15條通路，涉及PI3K－Akt 信號通路、HIF－1 信號通路、細(xì)胞周期、FoxO 信號通路、剪接體、泛素介導(dǎo)的蛋白水解途徑、乙型肝炎、小分子核糖核酸在癌癥、人類乳頭瘤病毒感染、TGF－beta信號通路、胰高糖素信號通路、AMPK信號通路、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、Hippo信號通路和細(xì)胞衰老等，通路見圖6。

圖6 關(guān)鍵基因KEGG 富集通路圖

2.5 關(guān)鍵基因治療中藥預(yù)測結(jié)果

將10 個(gè)關(guān)鍵基因映射到Coremine Medical 數(shù)據(jù)庫，以P< 0.05 為條件篩選治療Uremia 的潛在中藥，得到黃芪、鉤藤、黃芩、人參、積雪草等多味中藥，見表2。

表2 關(guān)鍵基因相關(guān)中藥預(yù)測表

3 討論

3.1 尿毒癥患者和健康人之間的差異表達(dá)基因

尿毒癥預(yù)后差、花費(fèi)高，目前糖皮質(zhì)激素、免疫抑制藥物及透析治療尚存在不良并發(fā)癥，而中醫(yī)藥在辨證論治的基礎(chǔ)上，整體調(diào)治慢性腎病已取得明顯的療效。各種慢性腎病的病理基礎(chǔ)是腎小球硬化、腎間質(zhì)纖維化和腎動脈硬化，而在慢性腎病發(fā)展過程中，腎組織的炎癥反應(yīng)及其相關(guān)的組織損傷是導(dǎo)致其進(jìn)展至終末期腎病尿毒癥的重要因素。

研究顯示健康和疾病中的腎功能中EP300的靶基因可作為未來實(shí)驗(yàn)研究的靶基因，以闡明將差異DNA甲基化與腎功能聯(lián)系起來的潛在基因調(diào)控機(jī)制［11］。沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1，SIRT1）表達(dá)受到抑制，可造成小鼠腎小球系膜細(xì)胞凋亡。研究表明，SIRT1 通過調(diào)節(jié)腎臟細(xì)胞的氧化應(yīng)激狀態(tài)，抑制腎臟細(xì)胞凋亡和腎臟炎癥反應(yīng)，從而緩解糖尿病腎?。?2］。Toll 樣受體4（Toll‐like receptors，TLR4）屬Toll 樣受體家族，是一種膜型模式識別受體，TLR4活化后可誘導(dǎo)IL－6、IL－8 等多種炎性因子基因并促進(jìn)趨化因子分泌、巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化及氧化應(yīng)激，是腎纖維化的重要介質(zhì)［13－14］。

3.2 關(guān)鍵表達(dá)基因的功能與缺氧和炎癥信號通路密切相關(guān)

腎纖維化是具有多種病因的進(jìn)行性慢性腎病的常見病理標(biāo)志。作為終末期腎病的最終共同途徑，缺氧在腎纖維化發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用［15］。研究顯示缺氧誘導(dǎo)的腎纖維化中的EMT與PI3K/Akt通路的激活關(guān)系密切，抑制PI3K激活通過減弱ECM 的積累，而抑制Akt導(dǎo)致梗阻性腎病中肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物的減少［16－17］。

缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）是腎臟疾病各種病理生理過程中缺氧適應(yīng)反應(yīng)的主要介質(zhì)，HIF 可直接誘導(dǎo)缺氧腎小管上皮細(xì)胞中基質(zhì)調(diào)節(jié)因子的表達(dá)，例如膠原蛋白I、纖溶酶原激活劑抑制劑1（PAI1）、內(nèi)皮素－1（ET－1）、結(jié)締組織生長因子（CTGF）、基質(zhì)金屬肽酶2（MMP－2）和金屬蛋白酶1 組織抑制劑（TIMP1），可增加間質(zhì)膠原蛋白的產(chǎn)生并減少ECM的降解［18－19］。

3.3 相關(guān)中藥可能是尿毒癥預(yù)防及治療的潛在藥物

研究顯示黃芩苷可以通過抑制miR－141過表達(dá)，促進(jìn)Sirt1表達(dá)水平上升以緩解高糖小鼠腎小球系膜細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而治療糖尿病腎?。?0］。研究顯示漢黃芩素能夠通過抑制糖尿病腎病大鼠腎組織TLR4蛋白表達(dá)水平，減輕大鼠腎組織氧化應(yīng)激損傷及炎癥反應(yīng)，進(jìn)而恢復(fù)腎小球形態(tài)及功能，顯著改善糖尿病腎病的腎功能［21］。益腎膠囊（黃芪、當(dāng)歸等組成）可上調(diào)SOCS－3而抑制TLR4 與IL－6 表達(dá)，從而降低糖尿病腎病的炎癥反應(yīng)［22］。中藥可通過調(diào)控炎性因子及其信號通路而干預(yù)慢性腎病的發(fā)展，后期通過科學(xué)完整的藥物篩選平臺必將產(chǎn)生安全有效的治療慢性腎病的中藥制劑。

通過對尿毒癥基因芯片的數(shù)據(jù)挖掘及生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)尿毒癥的差異表達(dá)基因，篩選得到15個(gè)關(guān)鍵基因，分析得到關(guān)鍵基因主要參與的信號通路及其功能，發(fā)現(xiàn)黃芪、鉤藤、黃芩、人參、積雪草等可能是其潛在的治療中藥。所篩選的關(guān)鍵基因及中藥可為后續(xù)尿毒癥分子機(jī)制及其治療藥物的研究研究提供理論依據(jù)，未來需進(jìn)一步通過實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證關(guān)鍵基因及相關(guān)中藥的治療作用。