崔媚婷，黃菁宇，陳娟，劉凱魯，劉承勇，聶曉偉

（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029）

精液冷凍保存在我國(guó)主要應(yīng)用于人類精子庫(kù)以及生育能力的保存。自1949年P(guān)olge 首先發(fā)現(xiàn)甘油能保護(hù)精子免受冷凍損傷以來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究者已經(jīng)建立了相對(duì)成熟的精液冷凍保存體系。全國(guó)各生殖中心對(duì)人精液冷凍保護(hù)劑的需求量很大，但國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上還沒(méi)有自行開發(fā)的人類精液冷凍保護(hù)劑應(yīng)用于臨床。

近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)精子保護(hù)劑的研究主要集中于在原有成分的基礎(chǔ)上，添加更多種類的“特殊”成分，如咖啡因、褪黑素、ATP、GSH、酶類、維生素、自由基清除劑Tempol、微量元素及泛素樣小蛋白SUMO1 等［1－4］。筆者前期的研究結(jié)果已經(jīng)證實(shí)對(duì)少弱精患者進(jìn)行精液冷凍保存，可以獲得盡可能多的處理后活動(dòng)精子總數(shù)，并應(yīng)用于宮腔內(nèi)人工授精（IUI），可以減少患者的治療費(fèi)用，讓不孕不育患者以最小的代價(jià)獲得妊娠［5］。而隨著臨床經(jīng)驗(yàn)的積累，筆者發(fā)現(xiàn)某些商品化的人類精液冷凍保存系統(tǒng)只適合于人的正常精液，對(duì)少弱精的保存效果較差。目前國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)主要集中于微量精子冷凍，對(duì)輕中度少弱精的冷凍保存研究甚少［6］。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)少弱精的新型冷凍保護(hù)劑研究包括水溶性維生素E、左旋肉堿、神經(jīng)生長(zhǎng)因子等的添加［7－9］，而針對(duì)添加中藥成分的效用研究還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

菟絲子和淫羊藿是中醫(yī)男科領(lǐng)域補(bǔ)腎益精的常用中藥，而金絲桃苷、淫羊藿苷分別是菟絲子和淫羊藿的主要有效成分。筆者前期研究結(jié)果證實(shí)在大鼠常用的精液冷凍保護(hù)液配方中添加菟絲子、淫羊藿水提液，可以提高解凍后精子活率指數(shù)［10］。將菟絲子和淫羊藿的有效成分金絲桃苷、淫羊藿苷添加到大鼠精液冷凍保存體系中，可以有效改善大鼠精液冷凍保存效果［11］。

氧化應(yīng)激（oxidative stress，OS）是由過(guò)多的自由基在體內(nèi)產(chǎn)生的一種負(fù)面作用，被認(rèn)為是導(dǎo)致衰老和疾病的重要因素。氧化還原電位（oxidationreduction potential，ORP）是用來(lái)反映水溶液中所有物質(zhì)表現(xiàn)出來(lái)的宏觀氧化－還原性。氧化還原電位越高，氧化性越強(qiáng)，電位越低，氧化性越弱。氧化還原電位是多種氧化物質(zhì)與還原物質(zhì)發(fā)生氧化還原反應(yīng)的綜合結(jié)果。這一指標(biāo)雖然不能作為某種氧化物質(zhì)與還原物質(zhì)濃度的指標(biāo)，但有助于了解水體的電化學(xué)特征，分析水體的性質(zhì)，是一項(xiàng)綜合性指標(biāo)。ORP值是反映生物體內(nèi)氧化與抗氧化作用平衡狀態(tài)的重要指標(biāo)數(shù)值，也是反映機(jī)體內(nèi)的氧化還原水平較為直接的指標(biāo)。

本研究主要針對(duì)金絲桃苷、淫羊藿苷在人少弱精冷凍保存技術(shù)中的應(yīng)用效果及對(duì)氧化應(yīng)激的影響進(jìn)行了初步探究。

1 材料與方法

1.1 一般資料與材料

1.1.1 精液標(biāo)本

所有精液標(biāo)本均來(lái)自南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科門診精液常規(guī)檢查。包括正常精液3 份，少弱精10 份。檢測(cè)方法參考WHO《人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》（第5 版）要求，每份標(biāo)本檢測(cè)3 次，數(shù)據(jù)取平均值作為最終結(jié)果。該研究通過(guò)南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，并獲得志愿者知情同意。

1.1.2 試劑與儀器

金絲桃苷（批號(hào)：110737－200415）、淫羊藿苷（批號(hào)：111521－201205）來(lái)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，其余試劑均采購(gòu)于SIGMA 公司。計(jì)算機(jī)輔助精子質(zhì)量自動(dòng)分析系統(tǒng)（清華同方），精子計(jì)數(shù)板（Markler，以色列），RedoxSYS System 自由基快速檢測(cè)分析儀（美國(guó)Aytu BioScience）。

1.2 方法

1.2.1 冷凍保護(hù)液的配置

1000 mL凈化水中添加CaCl20.2 g，KCl 0.2 g，Na2HPO40.05 g，MgCl2·6H2O 0.2 g，NaCl 8.0 g。NaHCO31.0 g，右旋葡萄糖1.0 g，用1 mol/L 的NaOH 和HCl 溶液調(diào)整pH 值至7.4，配置成無(wú)菌臺(tái)式溶液。在40 mL上述無(wú)菌臺(tái)式溶液中加入5 mL濃度為100 mg/mL的人白蛋白，0.9 g 葡萄糖和5 mL 甘油，配置成TGG 基礎(chǔ)液（WHO5 推薦少弱精專用冷凍保護(hù)劑），然后使用0.45 μm的濾器過(guò)濾。在配置好的每毫升TGG 基礎(chǔ)液中，分別加入金絲桃苷0.25、0.5、1.0 mg，淫羊藿苷0.5、1.0、2.0 mg 配置成含中藥單體的精液冷凍保護(hù)劑。

1.2.2 試驗(yàn)分組

本研究選擇基礎(chǔ)液（TGG）為對(duì)照組（Control），添加金絲桃苷0.25、0.5、1.0 mg分別設(shè)置為H－1、H－2、H－3 組，添加淫羊藿苷0.5、1.0、2.0 mg 分別設(shè)置為I－1、I－2、I－3 組。各組精液冷凍保護(hù)液在配置完成后，均用0.22 μm 的濾器過(guò)濾后備用。待樣本液化完全后，分別將正常精液和少精癥患者精液樣本按照體積1∶1和1∶2加入到已添加冷凍保護(hù)劑的冷凍管中，并混合均勻。正常組精液冷凍前濃度皆為（45.00 ±5.00）×106/mL；少精癥1∶1 混合組冷凍前精液濃度為（12.30±2.06）×106/mL；1∶2 混合組冷凍前精液濃度為（12.00±2.65）×106/mL。

1.2.3 精液冷凍與解凍

精液樣本與冷凍保檢測(cè)方法均參考WHO《人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》（第5版）要求，每份標(biāo)本檢測(cè)3 次，數(shù)據(jù)取平均值作為最終結(jié)果。充分混勻保護(hù)劑后，分別將冷凍管綁定于不同的冷凍支架上并放入4 ℃冰箱平衡1 h，取出后將冷凍支架置于裝滿液氮的自制容器上，在距離液氮面1 cm 處熏蒸10 min，隨后轉(zhuǎn)入冷凍罐保存2 周，2 周后取出液氮中的冷凍管，于37 ℃的水浴中靜置10 min。

1.2.4 檢測(cè)指標(biāo)

分別在冷凍保護(hù)劑混合前、解凍后取樣置于精子專用計(jì)數(shù)板（MAKLER 板）上，用計(jì)算機(jī)輔助精子質(zhì)量自動(dòng)分析系統(tǒng)檢測(cè)精子活力、活率、濃度等指標(biāo)。檢測(cè)方法參考WHO《人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》（第5 版）要求，每份標(biāo)本檢測(cè)3 次，數(shù)據(jù)取平均值作為最終結(jié)果。

1.2.5 氧化還原電位的檢測(cè)

精液解凍靜置后，用移液槍吸取20～40 μL 的標(biāo)本加入檢測(cè)芯片的樣品槽。開機(jī)，按“Insert Sensor”提示將芯片傳感器插入卡槽，2 min 內(nèi)加樣至芯片傳感器。樣品操有海綿吸樣的功能，樣品通過(guò)芯片內(nèi)的部微型管路就可以到達(dá)參比電極，從而開始進(jìn)行樣品的氧化還原反應(yīng)檢測(cè)。樣品檢測(cè)時(shí)間為4 min，檢測(cè)結(jié)束讀取數(shù)值?！癝tatic ORP”為氧化應(yīng)激自由基平衡值。每份標(biāo)本檢測(cè)3 次，讀取平均值作為最終結(jié)果。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)均以xˉ±s或率（%）表示；計(jì)量資料中符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)用t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗(yàn)（Mann－Whitney U－test）。P< 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 金絲桃苷、淫羊藿苷在正常精液冷凍保存中的作用

分別比較添加金絲桃苷、淫羊藿苷的冷凍保護(hù)劑在正常精液冷凍保存過(guò)程中的效果，結(jié)果見(jiàn)表1。按1∶1 比例混合的組中，H－2 和I－1 組冷凍保存效果分別在添加不同濃度的金絲桃苷和淫羊藿苷中表現(xiàn)最好，解凍后精子活率、前向活動(dòng)精子百分率、非前向活動(dòng)精子百分率均明顯高于其他添加比例組（P<0.05）。在1∶2 混合比例組中，H－2 和I－1 組冷凍保存效果分別在添加不同濃度的金絲桃苷和淫羊藿苷中表現(xiàn)最好，解凍后精子活率、前向活動(dòng)精子百分率顯著高于其他添加比例組（P<0.05）。Control、H－1、H－2、I－1 和I－2 組中，金絲桃苷和淫羊藿苷在同一添加濃度下，1∶1 和1∶2 的混合比例對(duì)比，解凍后的活率存在顯著差異（P<0.05）。

表1 添加金絲桃苷、淫羊藿苷的冷凍保護(hù)劑對(duì)正常精液冷凍保存效果比較（±s，%）

表1 添加金絲桃苷、淫羊藿苷的冷凍保護(hù)劑對(duì)正常精液冷凍保存效果比較（±s，%）

注：“△”表示不同組之間比較有顯著性差異（P<0.05）；“*”表示同組內(nèi)不同混合比例比較有顯著性差異（P<0.05）。H－1、H－3、H－3分別為添加金絲桃苷0.25、0.5、1.0 mg/mL；I－1、I－2、I－3分別為添加淫羊藿苷0.5、1.0、2.0 mg/mL。

組別對(duì)照組H－1 H－2 H－3 I－1 I－2 I－3混合比例1∶1 1∶2 1∶1 1∶2 1∶1 1∶2 1∶1 1∶2 1∶1 1∶2 1∶1 1∶2 1∶1 1∶2冷凍前總活率70.67±5.13 70.67±5.13 70.67±5.13 70.67±5.13 70.67±5.13 70.67±5.13 70.67±5.13 70.67±5.13 70.67±5.13 70.67±5.13 70.67±5.13 70.67±5.13 70.67±5.13 70.67±5.13前向運(yùn)動(dòng)精子率51.00±5.20 51.00±5.20 51.00±5.20 51.00±5.20 51.00±5.20 51.00±5.20 51.00±5.20 51.00±5.20 51.00±5.20 51.00±5.20 51.00±5.20 51.00±5.20 51.00±5.20 51.00±5.20非前向運(yùn)動(dòng)精子率19.67±3.79 19.67±3.79 19.67±3.79 19.67±3.79 19.67±3.79 19.67±3.79 19.67±3.79 19.67±3.79 19.67±3.79 19.67±3.79 19.67±3.79 19.67±3.79 19.67±3.79 19.67±3.79解凍后總活率51.00±2.65△47.33±2.08△*55.33±0.58 51.67±3.06*65.67±5.86△57.33±4.04△*54.33±2.89 54.33±3.21△63.67±5.86△55.00±4.36△*54.00±1.73 50.00±1.00*48.67±0.58 47.00±1.73前向運(yùn)動(dòng)精子率39.00±1.73△33.00±1.73△39.67±1.53 37.00±3.61 45.33±3.51△43.33±5.77△39.00±3.61 42.00±5.29 44.67±2.89△41.33±5.77△39.67±1.53 37.67±2.52 36.67±3.21 36.33±3.06非前向運(yùn)動(dòng)精子率12.67±2.52△14.33±1.53 15.67±1.15 14.67±1.53 20.33±3.06△14.00±1.73 15.33±1.15 12.33±2.08 19.00±4.58△13.67±1.53 14.33±2.52 12.33±2.08 12.00±2.65 10.67±2.19

2.2 金絲桃苷、淫羊藿苷在少弱精患者精液冷凍保存中的作用

分別比較添加金絲桃苷、淫羊藿苷的冷凍保護(hù)劑對(duì)少弱精患者精液冷凍保存的效果，結(jié)果如表2 所示。在1∶1 混合比例組中，H－2 和I－1 組冷凍保存效果分別在添加不同濃度的金絲桃苷和淫羊藿苷中效果最好，解凍后精子活率、前向活動(dòng)精子百分率、非前向活動(dòng)精子百分率均顯著高于其他添加比例組（P<0.05）。在1∶2 混合比例組中，H－2 和I－1 組冷凍保存效果分別在添加不同濃度的金絲桃苷和淫羊藿苷中表現(xiàn)最好，解凍后精子活率、前向活動(dòng)精子百分率高于其他添加比例組，但差異并不顯著（P>0.05）。H－2、H－3、I－1 和I－3 組中，淫羊藿苷和金絲桃苷在同一添加濃度下，1∶1 與1∶2 的混合比例相比較，解凍后的活率存在顯著差異（P<0.05）。

表2 添加金絲桃苷、淫羊藿苷的冷凍保護(hù)劑對(duì)少精癥精液冷凍保存效果比較（±s，%）

表2 添加金絲桃苷、淫羊藿苷的冷凍保護(hù)劑對(duì)少精癥精液冷凍保存效果比較（±s，%）

注：“△”表示不同組之間比較有顯著性差異（P<0.05）；“*”表示同組內(nèi)不同混合比例比較有顯著性差異（P<0.05）。H－1、H－3、H－3分別為添加金絲桃苷0.25、0.5、1.0 mg/mL；I－1、I－2、I－3分別為添加淫羊藿苷0.5、1.0、2.0 mg/mL。

組別對(duì)照組H－1 H－2 H－3混合比例1∶1 1∶2 1∶1 1∶2 1∶1 1∶2 1∶1 1∶2 1∶1冷凍前總活率61.90±6.12 62.67±2.52 61.90±6.12 62.67±2.52 61.90±6.12 62.67±2.52 61.90±6.12 62.67±2.52 61.90±6.12前向運(yùn)動(dòng)精子率43.20±5.98 47.67±8.08 43.20±5.98 47.67±8.08 43.20±5.98 47.67±8.08 43.20±5.98 47.67±8.08 43.20±5.98非前向運(yùn)動(dòng)精子率18.70±5.93 15.00±8.19 18.70±5.93 15.00±8.19 18.70±5.93 15.00±8.19 18.70±5.93 15.00±8.19 18.70±5.93總活率29.60±4.14△28.00±3.46 33.90±4.61△33.33±1.53 38.40±6.22△34.67±7.57*35.60±5.42△32.00±7.00*36.50±4.28△I－1 I－2 I－3 1∶2 1∶1 1∶2 1∶1 1∶2 62.67±2.52 61.90±6.12 62.67±2.52 61.90±6.12 62.67±2.52 47.67±8.08 43.20±5.98 47.67±8.08 43.20±5.98 47.67±8.08 15.00±8.19 18.70±5.93 15.00±8.19 18.70±5.93 15.00±8.19解凍后38.00±1.00*33.00±4.08 33.33±1.53 27.90±4.20 22.33±10.69*前向運(yùn)動(dòng)精子率19.60±3.75△19.67±3.21 23.30±4.08 24.67±3.06 25.40±5.03△24.00±.21 24.60±4.81△24.33±6.43 25.50±4.20△27.00±3.61 23.10±3.87 24.00±4.00 19.20±4.34 24.67±7.51非前向運(yùn)動(dòng)精子率10.00±2.40△8.33±0.58 11.60±2.88 8.67±2.08 13.00±2.83△10.67±1.15 11.00±2.36 7.67±0.58 11.00±1.94 11.00±3.00 9.90±2.47 9.33±3.21 8.70±1.89 7.67±3.21

2.3 金絲桃苷、淫羊藿苷在保護(hù)精液氧化還原電位中的效果

與對(duì)照組相比，少弱精癥患者的精液氧化還原電位顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05）；與對(duì)照組相比，加入金絲桃苷、淫羊藿苷冷凍保護(hù)劑后的精液氧化還原電位顯著降低（P< 0.05）。見(jiàn)表3。

表3 少弱精冷凍前后氧化還原電位比較（±s，mV106sperm）

表3 少弱精冷凍前后氧化還原電位比較（±s，mV106sperm）

注：“△”表示不同組之間比較有顯著性差異（P<0.05）。

組別對(duì)照組少弱精組（冷凍前）少弱精組（解凍后）氧化還原電位39.92±7.58△83.74±26.54△29.02±12.39△

3 討論

冷凍后的精子能夠刺激精液產(chǎn)生過(guò)量的活性氧（ROS）、并且精液（漿）的總抗氧化能力會(huì)被削弱，從而使精子處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，因此損傷了精子的功能［12］。作為體內(nèi)重要的非酶類抗氧化劑，維生素E 和左旋肉堿（L－carnitine）可以對(duì)抗ROS 對(duì)精子質(zhì)膜的氧化損傷，起到穩(wěn)定保護(hù)精子細(xì)胞結(jié)構(gòu)及活力的作用。添加一定濃度水溶性維生素E或左旋肉堿的精液冷凍保護(hù)液，可以減少精子凍融過(guò)程中產(chǎn)生的過(guò)量ROS，并減輕ROS 對(duì)精子質(zhì)膜的氧化應(yīng)激損傷，提高凍融后的精子活力［7－8］。

眾多臨床研究表明，中醫(yī)藥在治療少弱精癥中有一定療效，可以明顯改善患者精子質(zhì)量。研究發(fā)現(xiàn)菟絲子的水煎劑能明顯促進(jìn)人精子的運(yùn)動(dòng)功能和膜功能，可能在治療男性不育中有益，并可能有助于提高人工授精的成功率［13］。研究發(fā)現(xiàn)，在豬和牛顆粒凍精研究中，中藥提取液在冷凍－解凍過(guò)程中可以有效保護(hù)精子，提高精子的生存質(zhì)量和受精潛能；研究表明，淫羊藿、菟絲子等中藥本身含有的各種化學(xué)物質(zhì)相互協(xié)同，可能改變了精子細(xì)胞膜中磷脂和膽固醇的含量或比例，通過(guò)溶解磷脂而使精子膜具有一定的流動(dòng)性，盡可能地保護(hù)膜脂的有效性，從而改善精子細(xì)胞的通透性，防止冷凍時(shí)精子遭受的低溫?fù)p傷［14］。金絲桃苷、淫羊藿苷分別作為補(bǔ)腎中藥菟絲子和淫羊藿的有效成分，均具有抗氧化功能。

本研究結(jié)果顯示：在正常精液冷凍保存過(guò)程中，添加0.5 mg/mL 金絲桃苷的冷凍保護(hù)劑解凍后活率最高，添加0.5 mg/mL 淫羊藿苷的冷凍保護(hù)劑解凍后活率次之。與1∶2 混合比例冷凍相比，精液和冷凍保護(hù)劑解凍后按1∶1 比例混合效果較好。在少弱精冷凍保存過(guò)程中，添加0.5 mg/mL 金絲桃苷的冷凍保護(hù)劑和添加0.5 mg/mL 淫羊藿苷的冷凍保護(hù)劑解凍后活率最好，精液和冷凍保護(hù)劑按1∶1比例混合較1∶2的混合比例冷凍效果好。在TGG 冷凍保護(hù)劑中添加0.5 mg/mL金絲桃苷，精液和冷凍保護(hù)劑按1∶1 比例混合后，應(yīng)用快速冷凍和快速解凍法，可以有效地提高少精癥患者精液冷凍保存效果。

ORP值是反應(yīng)生物體內(nèi)氧化與抗氧化作用平衡狀態(tài)的重要指標(biāo)，可用于評(píng)估臨床疾病的嚴(yán)重程度，目前的證據(jù)已經(jīng)證實(shí)了ORP 與卒中、關(guān)節(jié)炎、肝病、腎病、心血管疾病等疾病的密切關(guān)系。一項(xiàng)研究顯示，男性不育患者中有80%ROS水平顯著升高。ROS水平對(duì)精子的生理功能起著關(guān)鍵作用，精漿中高水平的ROS 能誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，進(jìn)而降低精子活力、活率、受精潛能及增加DNA 碎片率（DFI）。因此高水平的ROS 是男性不育的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［15］。2016年，美國(guó)ASHOK AGARWAL 教授首次創(chuàng)新性地應(yīng)用Aytu MiOXSYS 體外診斷精液分析儀，完整準(zhǔn)確評(píng)估了由于氧化應(yīng)激造成的DNA 損傷，證實(shí)了ORP與精子活率和形態(tài)學(xué)的相關(guān)性，證明ORP 是一種評(píng)價(jià)精液氧化應(yīng)激狀態(tài)的可靠有效指標(biāo)［16－17］。本研究證明，在常用的基礎(chǔ)精液冷凍保護(hù)劑中按一定比例添加金絲桃苷、淫羊藿苷，可以有效改善精液氧化應(yīng)激狀態(tài)，降低氧化應(yīng)激損傷，對(duì)精子有較好的保護(hù)作用。

該研究首次在常用的基礎(chǔ)精液冷凍保護(hù)劑中添加了中藥單體金絲桃苷和淫羊藿苷，并篩選了中藥單體與基礎(chǔ)精液冷凍保護(hù)劑的最佳配比關(guān)系，配合快速冷凍和快速解凍方法，可以有效地改善少精癥精液冷凍保存效果，為少弱精癥冷凍后精子質(zhì)量下降提供了潛在的解決方案。今后將進(jìn)一步研究含有中藥單體的冷凍液對(duì)冷凍后精子遷移能力、DNA 碎片、ROS 濃度、MDA濃度的影響，以及其抗氧化保護(hù)作用機(jī)制。