杜昱彤， 曲柏宏*， 李潤(rùn)文

(1.延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133000；2.梅河口市園藝特產(chǎn)工作站，吉林 梅河口 135000)

梨是我國栽培的重要果樹之一,栽培面積和產(chǎn)量位居世界第1位。我國是梨屬植物最主要的原產(chǎn)地之一，梨的原種起源于第3紀(jì)的我國西部或西南部山區(qū)，現(xiàn)已命名的梨屬植物種、變種和類型有900個(gè)以上，但基本種可能有20個(gè)[1]。在豐富的梨屬種質(zhì)資源中，有13個(gè)種和1 600多個(gè)梨品種起源于我國[2]。梨屬種質(zhì)資源按果皮顏色劃分為綠皮梨、褐皮梨和紅皮梨3種類型，其中，紅色是花青苷積累的結(jié)果，而褐色是由于木栓層覆蓋果面而形成的[3]。在我國白梨、秋子梨大多為綠皮梨類型，砂梨主要為綠皮梨類型和褐皮梨類型，而新疆梨和西洋梨主要為綠皮梨類型和紅皮梨類型[4]。在我國現(xiàn)存的紅皮梨品種較少，其中，著色鮮艷、品質(zhì)優(yōu)良、果形大的品種就更為少見。

大量研究表明，果皮紅色取決于花青苷的含量和組成，花青苷受各種環(huán)境因素的影響，其生物合成受結(jié)構(gòu)基因、調(diào)控基因和轉(zhuǎn)錄因子的共同調(diào)控[5]。隨著對(duì)梨果實(shí)著色基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等分子機(jī)制研究的不斷深入，關(guān)于梨果皮著色相關(guān)基因的克隆、差異表達(dá)、轉(zhuǎn)化驗(yàn)證等報(bào)道越來越多，使得利用分子手段進(jìn)行紅皮梨種質(zhì)改良成為可能[6]。而我國關(guān)于紅皮梨種質(zhì)資源相關(guān)的研究主要集中在云南地區(qū)的紅皮梨品種，以及新疆庫爾勒香梨等品種，對(duì)蘋果梨等特色梨品種的相關(guān)研究報(bào)道較少。該文主要綜述了我國紅皮梨種質(zhì)資源，總結(jié)了國內(nèi)關(guān)于梨果實(shí)著色機(jī)制方面的相關(guān)研究進(jìn)展，探討我國紅皮梨種質(zhì)資源與果實(shí)著色研究方面存在的問題，以期為今后揭示梨果實(shí)著色機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 我國紅皮梨種質(zhì)資源與育種

1.1 我國紅皮梨資源

我國的紅皮梨資源主要分布在西南地區(qū)的云南及四川，以砂梨系統(tǒng)為主；少部分分布在華北和東北，以白梨和秋子梨系統(tǒng)為主[7]。其中，西南地區(qū)的云南省地處低緯度、高海拔地區(qū)，熱量資源豐富、光照充足，果實(shí)成熟期晝夜溫差大，十分有利于紅皮梨的著色，且擁有極其豐富的紅皮梨資源，包括火把梨、巍山紅雪梨、紅水扁梨、硯山紅香酥梨、巍寶梨、彌渡香酥梨等品種，這些品種著色面積可達(dá)到1/2或3/4以上，性狀穩(wěn)定，是我國優(yōu)質(zhì)的紅皮梨種質(zhì)資源[8]。在我國北方地區(qū)也有少量紅皮梨資源分布，如新疆的庫爾勒香梨、鞍山的南果梨以及延邊的蘋果梨等品種，這些品種在北方地區(qū)種植，由于受到不定的環(huán)境因素限制，著色不均且普遍著色效果不好，不能夠充分展現(xiàn)出紅皮梨的特點(diǎn)，從而限制了其發(fā)展。紅皮梨因其外觀鮮艷漂亮，深受消費(fèi)者的喜歡，但我國的紅皮梨種質(zhì)資源相對(duì)較少，因此，開展紅皮梨種質(zhì)資源創(chuàng)新與新品種選育成為目前國內(nèi)梨研究領(lǐng)域的重點(diǎn)之一。

1.2 我國紅皮梨育種

近些年來，我國科研工作者培育出許多品質(zhì)優(yōu)良的紅皮梨新品種。通過對(duì)引進(jìn)的西洋梨品種與我國固有的紅皮梨品種進(jìn)行雜交選育，培育出了具有西洋梨優(yōu)點(diǎn)且適合在我國種植的新品種，如中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所以“八月紅”和“紅香酥”進(jìn)行人工授粉雜交，選育出的紅皮梨新品種“華艷”[9]和“華蜜”[10]；以“八月紅”作母本、“酥梨”作父本雜交培育的白梨、砂梨和西洋梨的雜交種“紅寶石”，抗寒且抗病性強(qiáng)，適合在華北北部、西北地區(qū)及東北三省種植[11]；用“幸水”和“火把梨”雜交選育出了“紅酥脆”、“滿天紅”和“美人酥”一系列新品種[12]。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所用“庫爾勒香梨”作為母本、鄭州“鵝梨”作為父本，先后培育出“紅香酥”[13]和“紅香蜜”[14]等品質(zhì)優(yōu)良的紅皮梨新品種。山西省果樹研究所用“庫爾勒香梨”和“雪花梨”進(jìn)行雜交，選育出內(nèi)在品質(zhì)很好的紅皮梨品種“玉露香”[15]。吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所從“南果梨”與“晉酥梨”的雜交組合中選育出抗寒紅皮梨新品種“寒紅梨”[16]。沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)以“南果梨”與“蘋果梨”雜交選育出色澤鮮紅、品質(zhì)極佳、抗寒豐產(chǎn)、抗病性強(qiáng)的南蘋梨[17]。

研究發(fā)現(xiàn)，蘋果梨在自然生長(zhǎng)條件下，果實(shí)底色為綠色，在陽面能夠著紅色，而對(duì)其果實(shí)進(jìn)行套袋處理，在采收前期進(jìn)行解袋，果實(shí)表面著色效果更好[18]，并可以改善蘋果梨內(nèi)在品質(zhì)，從而提高果實(shí)的商品價(jià)值[19]。蘋果梨作為能夠大面積著色的特殊梨品種，具有獨(dú)特的果實(shí)品質(zhì)和育種價(jià)值。以其作為骨干親本對(duì)我國梨育種貢獻(xiàn)率最大，以其為親本育成了34個(gè)F1代品種(表1)，其中，包括5個(gè)芽變品種和3個(gè)實(shí)生品種以及26個(gè)雜交品種；由這些品種又衍生出了34個(gè)F2代及F3代品種(表2)，構(gòu)成了梨育種第1大族系——蘋果梨族系[20]。在以“蘋果梨”為親本育成的1代品種和衍生的多代品種中，“蘋果梨”ד碭山酥梨”雜交后代“碩豐”的果實(shí)著色近于全紅；以“早酥”為親本衍生的“紅早酥”、“早酥紅”、“八月紅”、“紅寶石”等品種色澤鮮艷，已經(jīng)在全國多地進(jìn)行廣泛栽培，大多數(shù)為品質(zhì)佳、果大、耐貯藏，且抗寒、抗病蟲害能力強(qiáng)的優(yōu)良品種，具有較高的紅皮梨育種價(jià)值以及廣闊的推廣應(yīng)用前景。

表1 以蘋果梨為親本育成的F1代品種

表2 以蘋果梨為親本育成的F2代和F3代品種

2 梨果實(shí)著色機(jī)理研究進(jìn)展

2.1 梨果皮中花青苷含量與組分

果實(shí)的色澤是衡量外觀品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)，但果實(shí)的色澤發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的生理過程。研究發(fā)現(xiàn)，梨果實(shí)的顏色主要是由葉綠素、類胡蘿卜素和花青素的含量來共同決定的，其中，花青苷的積累使梨的果皮表現(xiàn)出紅色，葉綠素、類胡蘿卜素的積累使梨果皮分別表現(xiàn)出綠色和黃褐色，其中花青苷對(duì)果實(shí)著色的影響作用最大[21]。

花青苷是花青素與含糖苷鍵的糖類結(jié)合形成的一種黃酮多酚類化合物，又名花色苷、花色素苷，廣泛存在于花、果實(shí)、莖、葉和根細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，是一類次生代謝產(chǎn)物，種類繁多，具有組織、種質(zhì)和物種特異性，屬于苯丙烷類次生代謝產(chǎn)物[22]，其合成的時(shí)期和合成的量決定果實(shí)的著色程度[23]。自然界中普遍存在的花青素種類有天竺葵素、矢車菊素、芍藥素、飛燕草素、錦葵素和矮牽牛素等6種[24]?；ㄇ嗨厥翘烊坏目寡趸瘎?，具有抗癌性、保護(hù)心血管、抑菌、降低肥胖及II型糖尿病的發(fā)病率等藥理作用，同時(shí)它能保護(hù)人體免受自由基等有害物質(zhì)的侵害[25]。花青素主要以糖苷類形式存在，增加了它的穩(wěn)定性和水溶性。普遍存在的有3-單糖苷、3-雙糖苷、3,5-雙糖苷和3,7-雙糖苷4種類型，梨果實(shí)中最普遍的是矢車菊色素-3-葡萄糖苷[6]。

花青苷在不同果實(shí)中的組成成分并不相同，肖長(zhǎng)城等[26]在37個(gè)紅皮梨品種中研究發(fā)現(xiàn)，白梨、秋子梨、西洋梨果皮中以矢車菊素-3-半乳糖苷和芍藥素-3-半乳糖苷為主，而砂梨中花色素苷組分主要為矢車菊素-3-半乳糖苷和矢車菊素-3-葡萄糖苷。王甜元等[27]利用高效液相色譜法對(duì)蘋果梨果皮花色苷組分及含量進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)蘋果梨果皮中花青苷的主要組分為矢車菊素-3-O-半乳糖苷，其含量高達(dá)總含量的90%，芍藥素-3-O-半乳糖苷含量最低。王龍等[28]研究發(fā)現(xiàn)，“紅香酥”梨果皮花青苷合成與積累高峰出現(xiàn)在果實(shí)發(fā)育后期，期間含量有所下降，在接近果實(shí)成熟時(shí)花青苷含量急劇增加，成熟時(shí)達(dá)到最高峰。

2.2 梨果實(shí)著色與花青苷合成的影響因素

花青苷的生物合成也受多種因素的影響，其調(diào)控機(jī)制較為復(fù)雜。迄今為止的研究結(jié)果表明，影響花青苷生物合成的主要因素包括：環(huán)境因素、植物激素、轉(zhuǎn)錄因子和表觀遺傳修飾?；ㄇ嘬丈锖铣杉せ钍苡绊懸蛩卣{(diào)控機(jī)制如圖1所示，MYB轉(zhuǎn)錄因子的特點(diǎn)是高度保守的MYB結(jié)構(gòu)域，MYB蛋白通常與bHLH轉(zhuǎn)錄因子和WDR蛋白相互作用以調(diào)節(jié)花青苷的生物合成。植物激素，如：茉莉酸(JA)、赤霉素(GA)、脫落酸(ABA)、乙烯等內(nèi)在因素，以及光照、溫度、肥力等外在環(huán)境因素，都會(huì)對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄激活和花青苷的生物合成、積累和轉(zhuǎn)運(yùn)產(chǎn)生高度影響。發(fā)育過程中環(huán)境因素可誘導(dǎo)MYB轉(zhuǎn)錄因子的形成，然后激活WDR和bHLH轉(zhuǎn)錄因子，從而形成MBW復(fù)合體，而MBW復(fù)合體由MRE(MYB識(shí)別元件)和BRE(bHLH識(shí)別元件)組成，它們與靶基因的啟動(dòng)子結(jié)合，最終靶基因的轉(zhuǎn)錄激活促進(jìn)花青苷的生物合成。但不同植物物種的花青苷代謝途徑及相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄在不同條件下的變化也相應(yīng)不同。

任小云等[29]研究發(fā)現(xiàn)，就改善果實(shí)著色效果而言，最適宜“玉露香”梨的果袋種類為外層袋為條紋黃色單光，內(nèi)層袋為黑色加蠟的木漿紙的果袋，最佳解袋期為采前3周。蔡忠民等[30]研究發(fā)現(xiàn)，套袋可以使“南果梨”果實(shí)著色指數(shù)提高，果點(diǎn)變小，果面光滑，底色變白；且顯著影響了其后熟程度，降低了單果重量和維生素C含量；采用內(nèi)黑外灰內(nèi)外疏水雙層果袋可顯著提高“南果梨”著色指數(shù)；在落花后60 d套袋，采前10 d解袋最好。劉冰雁[31]利用不同種類的果袋對(duì)蘋果梨進(jìn)行套袋處理，然后通過對(duì)處理后的蘋果梨果皮中的葉綠素、花青苷的含量以及果實(shí)品質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，篩選出最適宜蘋果梨的果袋種類，結(jié)果表明，外層袋為黃褐色紙，內(nèi)層袋為紅色蠟紙的雙層果袋對(duì)蘋果梨果實(shí)著色效果最佳，并且單位面積內(nèi)果點(diǎn)個(gè)數(shù)也明顯減少。李偉等[32]分別在蘋果梨盛花后的5個(gè)時(shí)期進(jìn)行套袋處理，測(cè)定了不同套袋期蘋果梨果皮葉綠素、類胡蘿卜素及花青素的含量，結(jié)果表明，套袋時(shí)間越早果皮中葉綠素含量越低。楊林先等[33]對(duì)套袋蘋果梨進(jìn)行了不同時(shí)期解袋試驗(yàn)，并對(duì)果皮葉綠素、類胡蘿卜素、花青素的含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，不同時(shí)期解袋均影響果實(shí)的著色效果，解袋時(shí)期過早或過晚果實(shí)著色均較慢，采收前10～15 d解袋，果實(shí)上色快，且著色艷麗，這段期間果皮中葉綠素含量較低，花青素、類胡蘿卜素含量最高，且顯著優(yōu)于其他處理和對(duì)照，為蘋果梨的最佳解袋時(shí)期。張曉東等[34]對(duì)云南紅梨果實(shí)進(jìn)行套袋處理并探討光照對(duì)其著色和果實(shí)品質(zhì)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，云南紅梨果皮著色指數(shù)與光照時(shí)間和光照質(zhì)量有關(guān)，自然光、桔黃色光和白色光是誘導(dǎo)果皮花色苷合成的主要色光，其中，自然光對(duì)果皮著色影響最大；套袋果實(shí)在摘除果袋后接受光照，果皮內(nèi)的光受體受光誘導(dǎo)后促進(jìn)花青苷合成途徑結(jié)構(gòu)基因的大量表達(dá)，使果皮中的花青苷迅速合成并積累，使果實(shí)著色面積增加，提高了其商品價(jià)值。鄔濛[35]發(fā)現(xiàn)高溫高光處理使“早酥梨”果皮變紅，并通過轉(zhuǎn)錄組篩選出其中調(diào)控花青苷合成的光響應(yīng)基因PbCOP1.1、PbPIF3.1和PbZAT12，研究表明PbCOP1.1負(fù)調(diào)控花青苷積累，PbPIF3.1和PbZAT12正調(diào)控花青苷積累。趙芫[36]研究了乙烯利、乙烯抑制劑和茉莉酸甲酯對(duì)紅梨品種“紅早酥”果皮著色的影響，發(fā)現(xiàn)乙烯利處理通過抑制紅早酥梨果皮中花青苷的積累以及提高其他黃色黃酮類化合物的含量誘導(dǎo)果皮變黃且不著紅色；乙烯抑制劑通過促進(jìn)花青苷的積累而使“紅早酥”梨果皮變紅，茉莉酸甲酯能夠協(xié)同乙烯利進(jìn)一步促進(jìn)黃色黃酮類物質(zhì)的積累使果皮顯著變黃，也能夠協(xié)同乙烯抑制劑使果皮中積累更多花青苷而變得更紅。肖長(zhǎng)城等[37]研究發(fā)現(xiàn)，在“云紅梨2號(hào)”果實(shí)著色初期，套袋和外源ALA處理均有明顯的促進(jìn)果皮著色的效果，且兩者共同處理促進(jìn)作用更為顯著。Bai等[38]研究發(fā)現(xiàn)，PpBBX16是光誘導(dǎo)花青素積累的正調(diào)節(jié)因子，但其本身不能直接誘導(dǎo)花青苷生物合成相關(guān)基因的表達(dá)，需要與PpHY5共同作用才能調(diào)節(jié)花青苷生物合成相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)花青苷的合成。白金月[39]通過白天遮光夜晚照燈的方式打破蘋果梨光周期、改變其光照時(shí)長(zhǎng)，并對(duì)不同光處理下的蘋果梨進(jìn)行qRT-PCR鑒定，發(fā)現(xiàn)遮光處理后PbMyb4-like1、PbbHLH130-like等基因明顯上調(diào)表達(dá)，WDR基因明顯下調(diào)，而花青苷含量顯著減少，果實(shí)著色不良，分析這可能是由于在光的調(diào)控下改變光周期從而改變基因的表達(dá)量，進(jìn)而影響蘋果梨花青苷合成與著色。因此，環(huán)境因素(例如光、溫度等)以及植物激素對(duì)花青苷的生物合成和梨果實(shí)的顏色形成具有重要的調(diào)節(jié)作用。

2.3 梨果實(shí)著色與花青苷生物合成的調(diào)控

花青苷生物合成過程如圖2所示，是通過莽草酸途徑經(jīng)苯丙氨酸支路完成，此過程包含許多步驟,并由不同酶催化[40]。

花青苷的生物合成包括3個(gè)階段，第1階段由苯丙氨酸到香豆酰CoA，受苯丙氨酸解氨酶(PAL)調(diào)控，肉桂酸羥化酶(C4H)和4-香豆酰CoA連接酶(4CL)參與這個(gè)過程；第2階段從香豆酰CoA到二氫黃酮醇，這一過程由查爾酮合成酶(CHS)、查爾酮異構(gòu)酶(CHI)、黃烷酮-3-羥化酶(F3H)、類黃烷酮-3'-羥化酶(F3'H)或類黃酮-3',5'-羥化酶(F3'5'H)和二氫黃酮醇還原酶(DFR)等參與完成;第3階段是花青苷的合成，由花青素合成酶(ANS)和類黃酮-3-O-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(UFGT)共同完成[41]。

控制植物花青苷代謝的基因分為2大類,一類是以上直接編碼花青苷代謝生物合成酶類的結(jié)構(gòu)基因，另一類是通過控制結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)從而控制花青苷生成的調(diào)節(jié)基因[42]。調(diào)節(jié)基因主要包括MYB轉(zhuǎn)錄因子、bHLH轉(zhuǎn)錄因子與WD40蛋白形成的蛋白復(fù)合體等。

2.3.1 梨果實(shí)花青苷合成結(jié)構(gòu)基因研究

花青苷合成途徑中的結(jié)構(gòu)基因有PAL、CHS、CHI、F3H、F3'H、DFR、ANS和UFGT等，這些結(jié)構(gòu)基因相互協(xié)作，最終完成從花青苷合成前體苯丙氨酸到各種主要色素的合成和轉(zhuǎn)化過程。近年來，國內(nèi)外對(duì)園藝植物中果實(shí)的花青苷合成結(jié)構(gòu)基因已進(jìn)行了較多研究報(bào)道，國內(nèi)諸多學(xué)者已經(jīng)從許多梨品種中克隆出CHS、CHI、F3H、DFR、ANS和UFGT等結(jié)構(gòu)基因，并進(jìn)行基因表達(dá)分析。Yu等[43]在2個(gè)品種的紅皮梨套袋果實(shí)中均檢測(cè)到PpPAL、PpCHI、PpCHS、PpDFR、PpF3H、PpANS和PpUFGT7種花青苷生物合成結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，所有這些基因在果實(shí)解袋后均顯著上調(diào)，并在去除袋子后的幾天達(dá)到峰值，研究結(jié)果表明，這些基因均與花青苷的積累呈正相關(guān)，在去除袋子后通過光照誘導(dǎo)PyMYB10積累，從而促進(jìn)花青苷生物合成結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)花青苷的積累。張雪等[44]認(rèn)為，花青苷生物合成酶在不同的紅皮梨品種中作用并不相同，研究發(fā)現(xiàn)CHI是“早白蜜”花青苷合成的關(guān)鍵酶，而對(duì)于中晚熟品種“中熟32”和“云紅梨1號(hào)”PAL與CHI只參與花青苷的合成啟動(dòng)。黃春輝[45]對(duì)砂梨進(jìn)行套袋處理，發(fā)現(xiàn)在去袋后通過曝光誘導(dǎo)了UFGT等與花青苷合成相關(guān)酶的活性，從而促進(jìn)花青苷快速積累，且在去袋后10 d左右達(dá)到高峰。Yang等[46]檢測(cè)了7種花青苷生物合成結(jié)構(gòu)基因以及3個(gè)相關(guān)的調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，表明ANS和UFGT是紅皮梨花青苷生物合成的決定性基因，它們的不同表達(dá)導(dǎo)致了西方梨和東方梨之間的著色差異。有研究表明，果皮由綠色到紅色的表型變化是UFGT控制調(diào)節(jié)基因的表達(dá)發(fā)生作用的結(jié)果，認(rèn)為UFGT基因是花青苷合成途徑中的最關(guān)鍵的基因，它負(fù)責(zé)將糖基連接到不穩(wěn)定的花青素上，從而使花青素變成穩(wěn)定的花青苷[47-48]。黃春輝等[49]對(duì)2個(gè)不同遺傳背景的紅皮砂梨品種在其著色過程中色素的變化與相關(guān)酶活性進(jìn)行了探究,發(fā)現(xiàn)在果實(shí)著色初始期,PAL和UFGT活性相繼達(dá)到最高值，之后隨著花青苷的快速合成,PAL活性急劇下降,但UFGT活性一直保持在很高的水平，認(rèn)為紅皮砂梨花青苷的合成積累主要是在果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育后期，PAL與花青苷合成的啟動(dòng)有關(guān)，而UFGT與花青苷的積聚密切相關(guān)，因此，UFGT基因的研究對(duì)于花青苷合成的研究十分重要。在“紅早酥”梨中PbUFGT基因序列中含有MYB、bHLH的連接位點(diǎn)，說明PbUFGT基因可以由MYB、bHLH轉(zhuǎn)錄因子控制，與其聯(lián)合控制花青苷生成[50]。而在“巴梨”紅色芽變品種“紅巴梨”幼果期果皮中UFGT表達(dá)量約為“巴梨”的2倍，但在果實(shí)成熟期其表達(dá)量低于“巴梨”，并且發(fā)現(xiàn)該基因在“紅巴梨”果肉中不表達(dá)[51]，因此，對(duì)于UFGT與花青苷合成的關(guān)系仍需要進(jìn)一步深入研究。作者所在課題組近年來采用同源克隆及實(shí)時(shí)熒光定量PCR的試驗(yàn)方法，從蘋果梨中成功克隆了PAL、CHS、CHI、DFR、ANS和F3H等結(jié)構(gòu)基因，并對(duì)其在蘋果梨解袋前后果實(shí)著色過程中的表達(dá)特性及與花青苷積累的關(guān)系進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)這些基因的表達(dá)量與果實(shí)著色及花青苷含量關(guān)系密切，表明這些結(jié)構(gòu)基因?qū)麑?shí)花色素苷積累具有促進(jìn)作用[52-57]。

2.3.2 梨果實(shí)花青苷合成調(diào)節(jié)基因

國內(nèi)關(guān)于梨果實(shí)著色調(diào)節(jié)基因的研究在MYB轉(zhuǎn)錄因子家族報(bào)道相對(duì)較多。根據(jù)MYB蛋白所含R基序數(shù)目的不同將MYB轉(zhuǎn)錄因子家族分為4類(R1-MYB、R2R3-MYB、R1R2R3-MYB和R4-MYB)，其中R2R3-MYB家族最為龐大，大多MYB家族基因跟花青苷積累呈正相關(guān)，并且已經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，R2R3型MYB基因跟花青苷生物合成密切相關(guān)[58]。冉昆等[59]利用RT-PCR和RACE技術(shù)對(duì)“杜梨”MYB家族基因進(jìn)行克隆，獲得了2個(gè)杜梨MYB基因Pb3RMYB和Pb4RMYB，分別屬于3RMYB和4R-MYB亞家族。錢敏杰[60]在梨的“滿天紅”和“凱斯凱德”兩個(gè)品種中研究發(fā)現(xiàn)，PpMYB10的表達(dá)水平可以受套袋處理及采收后紫外光、可見光處理的影響，并發(fā)現(xiàn)MYB10不同啟動(dòng)子區(qū)段的DNA甲基化程度都會(huì)影響MYB10的表達(dá)活性，進(jìn)而影響梨果實(shí)外觀顯色情況。Feng等[61]從亞洲梨“奧冠”中分離出R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子基因PyMYB10，序列分析表明，PyMYB10基因是調(diào)控紅肉蘋果中花青苷生物合成的MdMYB10基因的直系同源基因，經(jīng)在基因組水平上鑒定發(fā)現(xiàn)PyMYB10具有3個(gè)外顯子，其上游序列包含參與光反應(yīng)的順式作用調(diào)控元件的核心序列。通過對(duì)果實(shí)進(jìn)行套袋解袋處理發(fā)現(xiàn)光可以誘導(dǎo)PyMYB10的表達(dá)從而促進(jìn)花青苷的生物合成，并且過表達(dá)PyMYB10的轉(zhuǎn)基因擬南芥植物在未成熟的種子中表現(xiàn)出異位色素沉著，該研究表明，PyMYB10在調(diào)節(jié)花青苷生物合成中發(fā)揮重要作用，且PyMYB10的過表達(dá)足以誘導(dǎo)花青苷的積累。孫莎莎[62]從“奧冠梨”果皮中分離PyMYB10基因時(shí)，得到另一個(gè)花青苷調(diào)控基因PyMYB10.1，通過酵母雙雜交、雙分子熒光互補(bǔ)以及煙草瞬時(shí)表達(dá)分析表明，PyMYB10.1和PyMYB10為同源基因，均可響應(yīng)光照與MeJA信號(hào)，可以通過與bHLHs互作共同激活花青苷結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)花青苷合成。鹿艷新等[63]以延邊“蘋果梨”果實(shí)為試材，采用同源克隆的試驗(yàn)方法,研究了果實(shí)著色過程的轉(zhuǎn)錄基因PyMYB114，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，通過同源性分析表明，PyMYB114基因與白梨的MYB114基因核酸序列的相似性高達(dá)99%，系統(tǒng)進(jìn)化樹表明，PyMYB114編碼的氨基酸和白梨的MYB114編碼的氨基酸在進(jìn)化上親緣關(guān)系最近。劉冰雁[31]成功構(gòu)建了PbMyb4-like1、PbMyb4-like2、PbMYB1R1、PbWDR基因的過表達(dá)載體，通過凍融法導(dǎo)入到農(nóng)桿菌GV3101中，在番茄中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，試驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)入pRI-PbMYB1R1過表達(dá)載體的番茄果實(shí)花青苷含量顯著高于對(duì)照和其他處理。

bHLH是具有堿性-螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)的一大類基因,其成員主要有c-MYC、MADL、MAX、MIXL和MNT基因。bHLH轉(zhuǎn)錄因子能夠與某些跟花青苷合成有關(guān)的關(guān)鍵基因相結(jié)合，以促進(jìn)花青苷的產(chǎn)生與累積。孟富宣等[64]利用生物信息學(xué)方法對(duì)云南紅皮梨bHLH基因進(jìn)行分析，對(duì)不同植物間bHLH基因氨基酸序列的同源性比對(duì),并且對(duì)該基因編碼的蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和功能等進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。結(jié)果表明，該蛋白屬于親水性蛋白,其二級(jí)結(jié)構(gòu)中的主要結(jié)構(gòu)元件是α-螺旋和無規(guī)則卷曲,并散布于整個(gè)蛋白。有研究表明在花青苷的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中MYB和bHLH常作為復(fù)合物起作用，如張士偉[50]在“紅早酥”梨上利用克隆得到PbUFGT基因，并且發(fā)現(xiàn)MYB與bHLH轉(zhuǎn)錄因子均能與PbUFGT基因啟動(dòng)子結(jié)合，共同調(diào)控PbUFGT基因的表達(dá)。崔道雷[65]通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，云南紅梨的PyMYB、PybHLH和PyWD40 3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，作用于結(jié)構(gòu)基因PyANS、PyDFR和PyUFGT，兩兩相互作用，共同促進(jìn)花青苷的積累。Yao等[66]克隆得到PyMYB114，通過在煙草葉片、草莓和梨果實(shí)中的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化發(fā)現(xiàn)其與PyERF3、PybHLH3相互作用共同調(diào)控梨花青苷生物合成。孟義淳[67]在蘋果梨果實(shí)中克隆得到PbbHLH130、PbMYC2基因，并利用qRT-PCR方法測(cè)定自然生長(zhǎng)條件下的蘋果梨與套袋后不同時(shí)期解袋的蘋果梨中上述基因的差異表達(dá)，發(fā)現(xiàn)PbbHLH130、PbMYC2與花青苷的積累呈顯著正相關(guān)，推測(cè)其為花青苷合成過程中重要基因。

WD40蛋白家族的成員具有4～10個(gè)隨機(jī)的WD重復(fù)結(jié)構(gòu)域，每個(gè)結(jié)構(gòu)域包含約40個(gè)以色氨酸(W)和天冬氨酸(D)結(jié)尾的氨基酸序列。WD40蛋白質(zhì)本身沒有催化功能，但可以與多種蛋白質(zhì)可逆地相互作用，從而為組裝大型蛋白質(zhì)復(fù)合物提供平臺(tái)或鏈接。許多研究表明，花青苷合成途徑主要受植物中的多種三元MBW(MYB-bHLH-WD40)復(fù)合物調(diào)控。其他轉(zhuǎn)錄因子，例如WRKY、ERF、NAC和bZIP也可以協(xié)調(diào)或參與花青苷合成的調(diào)節(jié)，從而豐富了花青苷的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)[68]，但目前國內(nèi)缺少這些轉(zhuǎn)錄因子與紅梨花青苷積累關(guān)系的相關(guān)研究報(bào)道。

2.3.3 轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在梨果實(shí)著色研究中的應(yīng)用

轉(zhuǎn)錄組學(xué)能夠在整體水平上研究細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄情況及調(diào)控規(guī)律，其研究對(duì)象是植物細(xì)胞在特定功能狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄出的所有RNA的總和，包括多聚腺苷酸信使RNA(m RNA)、前體m RNA(pre-m RNA)和非編碼RNA(noncoding RNA)[69]。轉(zhuǎn)錄組是連接基因組遺傳信息與生物功能的蛋白質(zhì)組的必然紐帶，也是生物體最重要的調(diào)控方式。目前，利用分子生物學(xué)及生物工程技術(shù)手段進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，能夠在較短的時(shí)間里了解果樹細(xì)胞中基因的轉(zhuǎn)錄情況及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律，可以進(jìn)一步解析果樹各種性狀，同時(shí)也可以為培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和抗逆的果樹新品種奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)[70]。

近年來，轉(zhuǎn)錄組分析在梨果實(shí)發(fā)育、抗性研究、品種鑒定等方面取得了一些進(jìn)展，其中，齊丹[71]對(duì)4個(gè)綏中地方梨品種及秋白梨的8個(gè)可能變異單株進(jìn)行了EST-SSR鑒定分析，對(duì)7號(hào)單株進(jìn)行了親本鑒定，認(rèn)為秋白梨是其親本之一，同時(shí)可排除綏中謝花甜、水紅霄和洋紅霄為其親本；王西成等[72]發(fā)現(xiàn)，“1293條梨”的EST序列中含有SSR位點(diǎn)的序列為82條，SSR位點(diǎn)92個(gè)，二核苷酸、三核苷酸和六核苷酸重復(fù)是最主要的SSR類型，分別占48.91%、17.39%和17.39%；劉漢婷[73]以“早酥”梨及其紅色芽變“紅早酥”為材料，利用花托和葉片轉(zhuǎn)錄組分析，篩選得到在白梨中尚未有研究報(bào)道的編碼GST轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因PbGSTF12和編碼MATE轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因PbTT12；韋云[74]以“南果梨”及其紅色芽變“南紅梨”果皮為試驗(yàn)材料進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分析發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)基因PuUFGT和調(diào)控基因PuMYB10、PuMYB12基因的表達(dá)在2個(gè)品種中表達(dá)差異明顯且與“南果梨”和“南紅梨”果皮花青苷合成變化一致；為確定引起“南果梨”和“南紅梨”果皮著色差異，又在轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中獲得了9個(gè)蛋白激酶相關(guān)基因，對(duì)這9個(gè)基因在“南果梨”和“南紅梨”果皮不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其中2個(gè)基因在“南紅梨”中比在“南果梨”中表達(dá)量高，初步推測(cè)這2個(gè)基因可能在“南果梨”和“南紅梨”果實(shí)著色差異中起作用；楊雅楠[75]利用Illumina測(cè)序平臺(tái)對(duì)“早紅考密斯”及其綠色芽變品種各3個(gè)發(fā)育時(shí)期果實(shí)的果皮進(jìn)行數(shù)字化表達(dá)譜測(cè)序，并比較不同發(fā)育時(shí)期“早紅考密斯”及其綠色芽變品種之間的轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)除了已知的MYB家族以外，還出現(xiàn)了AP2、WRKY和MADS等3個(gè)新的轉(zhuǎn)錄因子家族，與花色素苷生物合成有一定的相關(guān)性；劉冰雁[31]通過Illumina測(cè)序平臺(tái)對(duì)蘋果梨果實(shí)解袋后3個(gè)發(fā)育時(shí)期果皮進(jìn)行測(cè)序，比較不同發(fā)育時(shí)期之間測(cè)序數(shù)據(jù)，共獲得91.36Gb Clean Data，各樣品的Reads與參考基因組的比對(duì)效率為65.14%～66.92%。其中，差異基因表達(dá)共有1 371個(gè)，575個(gè)上調(diào)差異表達(dá)，796個(gè)下調(diào)差異表達(dá)；并通過比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)和基因表達(dá)分析，確定了幾個(gè)與花青苷生物合成相關(guān)的關(guān)鍵基因，包括MYB類、bHLH類、WDR和DFR等。

3 問題與展望

我國豐富的梨種質(zhì)資源為紅皮梨育種工作奠定了良好材料基礎(chǔ)，但較中國豐富的梨種質(zhì)資源而言，紅皮梨品種育種的利用率相對(duì)較低，還有一部分已經(jīng)育成的紅皮梨品種果實(shí)品質(zhì)較差，性狀不穩(wěn)定且不耐貯藏，此外一些品種只適合生長(zhǎng)在部分地區(qū)，缺少能夠使這些紅皮梨大面積著色的自然環(huán)境條件。因此，未來在對(duì)我國固有的紅皮梨種質(zhì)資源進(jìn)行保存的同時(shí)，也要對(duì)已培育出的紅皮梨品種進(jìn)行遺傳改良選育，并充分挖掘我國紅皮梨種質(zhì)資源的優(yōu)異性狀，選育出更多的紅色性狀穩(wěn)定、抗性強(qiáng)、耐貯藏、豐產(chǎn)性好的優(yōu)質(zhì)品種。

在當(dāng)前大數(shù)據(jù)背景下，基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)的綜合分析將為果實(shí)花青苷調(diào)節(jié)模型和代謝途徑的未知部分提供新的思路，并為揭示果實(shí)色澤和其內(nèi)在品質(zhì)之間的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。花青苷合成代謝是一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，盡管在蘋果、獼猴桃和草莓等其他園藝植物中已經(jīng)開展了較多有關(guān)花青苷合成代謝與調(diào)控等方面的研究工作，但不同果樹花青苷合成過程中關(guān)鍵酶基因的表達(dá)涉及多種調(diào)控因子，且調(diào)控因子調(diào)控的關(guān)鍵酶基因也不盡一致，當(dāng)前的研究成果還不足以揭示紅皮梨花青苷生物合成代謝的全貌。在已經(jīng)發(fā)表的一系列與梨果實(shí)著色相關(guān)的報(bào)道中，大部分局限于對(duì)西洋梨以及個(gè)別砂梨品種的研究，而關(guān)于白梨、秋子梨和新疆梨種類中的庫爾勒香梨、蘋果梨等紅皮梨品種研究還不深入。關(guān)于紅皮梨性狀遺傳規(guī)律、著色機(jī)制研究以及可輔助紅皮梨育種的實(shí)用分子手段等方面尚存在較多問題，今后我國紅皮梨的研究重點(diǎn)應(yīng)該放在對(duì)現(xiàn)有的紅皮梨資源進(jìn)行收集、保存以及農(nóng)藝性狀和遺傳多樣性研究；篩選優(yōu)良紅皮梨品種，充分利用蘋果梨、庫爾勒香梨等特色梨品種以及選育出的紅皮梨新品種的果實(shí)特點(diǎn)進(jìn)行雜交并選育出優(yōu)質(zhì)紅皮梨品種；深入開展紅皮梨花青苷合成相關(guān)基因的克隆、表達(dá)和功能分析以及轉(zhuǎn)錄組、基因組、蛋白組學(xué)研究工作，加強(qiáng)連鎖分析、基因定位發(fā)掘與基因表達(dá)、功能驗(yàn)證相結(jié)合的綜合研究，以尋找出關(guān)鍵基因并結(jié)合生物技術(shù)手段培育紅皮梨新品種；加強(qiáng)紅皮梨花青苷積累水平影響因素研究，探究影響紅皮梨花色苷代謝的環(huán)境因子和調(diào)控措施，研發(fā)紅皮梨外觀品質(zhì)提升栽培管理綜合配套技術(shù)，進(jìn)行大規(guī)模紅皮梨商業(yè)化開發(fā)，從而為推動(dòng)我國紅皮梨資源利用、紅皮梨育種及產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供技術(shù)支撐。