孫德鵬， 徐瀚然， 韓春姬， 汪庭瑞， 李官浩， 牟柏德*

(1.延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院；2.延邊大學(xué) 食品研究中心；3.延邊大陽參業(yè)有限公司：吉林 延吉 133000)

靈芝屬多孔菌科真菌赤芝，是一種珍貴的藥材。靈芝中含有許多對(duì)人體有益的功能性營(yíng)養(yǎng)成分[1]，如多糖類、三萜類化合物、礦物質(zhì)等，具有促進(jìn)血液循環(huán)、提高免疫力、改善肝功能等作用[2-4]。已報(bào)道的200多種靈芝多糖分為α型和β型[5]，單糖間通過苷鍵結(jié)合的形式?jīng)Q定了靈芝多糖的藥理活性。許多研究表明，靈芝多糖還具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用[6]，能夠抑制核酸的合成，誘導(dǎo)其調(diào)亡，并能調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力來發(fā)揮作用[7-8]。酶法提取能使靈芝中的多糖與細(xì)胞中果膠、半纖維素等分離開[9-11]，以提高多糖的提取率。為此，該試驗(yàn)以靈芝為原料，復(fù)合酶法提取多糖，并優(yōu)化最佳工藝參數(shù)。

果凍是一種利用增稠劑與水為原料制作的休閑食品，深受廣大青年人的青睞。在果凍的制作中，靈芝子實(shí)體多糖具有一定的凝膠性，當(dāng)波美度達(dá)到65%時(shí)冷卻凝固。靈芝多糖尚未以增稠劑的用途添加至果凍中，這不僅能夠減少明膠的使用量，還能增加產(chǎn)品的穩(wěn)定性和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。該試驗(yàn)以靈芝為原料，利用質(zhì)構(gòu)測(cè)定、味覺系統(tǒng)以及感官分析對(duì)食用明膠、山楂大棗浸膏等添加量進(jìn)行優(yōu)化，為現(xiàn)代休閑食品行業(yè)提供新思路，以及后續(xù)的靈芝飲料、果凍等的研究和生產(chǎn)提供參考和依據(jù)[12]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

長(zhǎng)白山林下靈芝(購于延邊大陽參業(yè)有限公司)；纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶(購于河南萬邦科技有限公司)；葡萄糖、苯酚、無水乙醇、硫酸均為分析純(購于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；冰糖、明膠、低聚果糖、β-環(huán)糊精均為食品級(jí)(購于延吉市西市場(chǎng))；山楂大棗提取液由延邊大學(xué)食品研究中心研制。

酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(南京華東電子醫(yī)療裝備有限公司)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州翔天實(shí)驗(yàn)儀器廠)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海豫明儀器有限公司)；冷凍離心機(jī)(德國HERMLE公司)；味覺分析系統(tǒng)(日本Insent公司)；質(zhì)構(gòu)分析儀(美國ISENSO公司)。

1.2 方法

1.2.1 復(fù)合酶法提取靈芝多糖工藝優(yōu)化

1) 樣品預(yù)處理

將靈芝干燥至恒重，粉碎后過篩，密封保存待用。

2) 多糖提取方法

根據(jù)丁霄霄等[13]人的試驗(yàn)方法修改如下：稱取靈芝樣品10.0 g置于容器中，按照料液比1∶20(g∶mL)加入蒸餾水浸泡1 h后，稱取一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的果膠酶、纖維素酶和木瓜蛋白酶(相對(duì)底物濃度)加入浸泡液中，50 ℃水浴酶解80 min后，95 ℃下滅酶提取120 min，趁熱抽濾至澄清，濾液減壓濃縮至50 mL，加入4倍體積無水乙醇，于4 ℃醇沉10 h。5000 r/min離心10 min取沉淀溶解，蒸餾水定容至100 mL。

3) 多糖含量測(cè)定

多糖含量以苯酚-濃硫酸法測(cè)定，參照屈小玄等[14-15]人的方法并加以改動(dòng)：以葡萄糖對(duì)照品含量c為橫坐標(biāo)(μg)，492 nm波長(zhǎng)處測(cè)得吸光度A為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性方程 A=2.411 9c+0.037 3，相關(guān)系數(shù)R2=0.995 6。取1 mL提取溶液，相同方法顯色后取200 μL滴入96孔板，測(cè)得吸光度代入方程計(jì)算出靈芝多糖的提取率。

4) 復(fù)合酶添加量的確定

①單因素實(shí)驗(yàn)：自變量分別為果膠酶(1.5%,2.0%,2.5%,3.0%和3.5%)、纖維素酶(0.5%,1.0%,1.5%,2.0%和2.5%)和木瓜蛋白酶(1.2%,1.6%,2.0%,2.4%和2.8%)，按照1.2.1 2) 的步驟，保持酶解條件為50 ℃、酶解80 min進(jìn)行試驗(yàn)，以1.2.1 3) 的方法記錄吸光度并計(jì)算出多糖得率，分析得到各種酶最佳添加量。

②正交試驗(yàn)：根據(jù)上述結(jié)果，按照表1進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，保持酶解條件不變進(jìn)行試驗(yàn)，以確定最佳復(fù)合酶配比。

表1 復(fù)合酶法提取靈芝多糖正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

5) 酶解條件的篩選

按照正交試驗(yàn)結(jié)果，選用最佳復(fù)合酶的比例，對(duì)酶解溫度及酶解時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。

①酶解時(shí)間的篩選 將酶解時(shí)間分別調(diào)節(jié)為60、70、80、90、100 min，保持酶配比、酶解溫度50 ℃不變，通過測(cè)定靈芝多糖提取率，確定最佳酶解時(shí)間；②酶解溫度的篩選 將酶解溫度分別調(diào)節(jié)為46、48、50、52和54 ℃，保持酶配比、酶解時(shí)間80 min不變，通過測(cè)定靈芝多糖提取率，確定最優(yōu)酶解溫度。

1.2.2 靈芝果凍的開發(fā)

參考賈娟等[16-17]人的方法，該試驗(yàn)將以正交設(shè)計(jì)和感官評(píng)價(jià)的方法，優(yōu)化出靈芝果凍的配方。

1) β-環(huán)糊精添加量的篩選

參考戰(zhàn)旭梅等[18-19]人的方法，采用添加β-環(huán)糊精的方法對(duì)提取液中的靈芝酸進(jìn)行包埋，以除去部分苦味和保留靈芝中特有的香味及營(yíng)養(yǎng)成分，達(dá)到試驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

準(zhǔn)確稱量100.0 g靈芝，采用1.2.1.5) 優(yōu)化后的條件對(duì)靈芝進(jìn)行提取。將提取液濃縮至1 L待用。β-環(huán)糊精的添加量設(shè)置為7.0，7.2，7.4，7.6，7.8和8.0 g/L分別加入到50 mL靈芝多糖提取液中。

樣品倒入潔凈的樣品杯中，用味覺分析系統(tǒng)(電子舌)分析酸、甜、苦、澀、鮮、咸6個(gè)基本味覺[20]。同時(shí)，由20名品嘗員按照表2評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。通過分析兩組試驗(yàn)結(jié)果確定β-環(huán)糊精的添加量。

表2 β-環(huán)糊精添加量感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

2) 口感調(diào)配及感官優(yōu)化

該試驗(yàn)將延邊大學(xué)食品研究中心研制的山楂大棗浸膏的配料添加至靈芝提取液中進(jìn)行口感調(diào)配，賦予其酸甜的口感。

通過前期試驗(yàn)初步確定了低聚果糖、冰糖以及山楂大棗浸膏的添加量，按表3進(jìn)行正交試驗(yàn)，自變量為3種輔料的配比，分別添加到β-環(huán)糊精脫苦后的靈芝提取液中，以混合液感官為指標(biāo)，按照表4由20名品嘗員進(jìn)行感官評(píng)分，確定最優(yōu)添加比例。

表3 果凍飲料輔料添加量的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

3) 明膠添加量的確定

參照吳佳南等[21-22]人的方法，按上述優(yōu)化的條件制備混合液加熱至60 ℃后，在50 mL混合液中添加不同量的軟化明膠(4%，4.5%，5%，5.5%和6%)，混合均勻，放置于4 ℃冰箱內(nèi)貯存2 h后成型制成果凍。將成品切成1 cm×1 cm×1 cm的正方體，放置于質(zhì)構(gòu)儀樣品臺(tái)，以60 mm/min的速度用探頭進(jìn)行40%形變的擠壓測(cè)定，分別記錄硬度、膠黏性以及彈性。同時(shí)按照表5標(biāo)準(zhǔn)，由20名品嘗員進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。通過分析2組數(shù)據(jù)確定食用明膠的添加量。

表5 靈芝果凍感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

1.3 數(shù)據(jù)處理

按照表1、3的正交設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)，得到的結(jié)果運(yùn)用SPSS 26.0進(jìn)行分析，并用Excel對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理后，Origin 2019軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合酶法提取靈芝多糖工藝優(yōu)化

2.1.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

由不同種類酶對(duì)提取率的影響可知(圖1)。果膠酶添加量為2.5%時(shí)多糖提取率最高，達(dá)2.22%，添加量高于2.5%時(shí)反而下降；纖維素酶添加2.0%時(shí)，靈芝多糖最高提取率達(dá)到2.92%；木瓜蛋白酶添加1.2%～2.8%時(shí)可以看出多糖提取率呈現(xiàn)先上升然后下降的趨勢(shì)，在添加量為2.0%時(shí)，提取率達(dá)到最高為2.53%。選擇三種酶的最佳用量:果膠酶2.5%、纖維素酶2.0%和木瓜蛋白酶2.0%進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.1.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表6極差分析結(jié)果可知，RA(0.37)>RB(0.23)>RC(0.20)，果膠酶的添加量對(duì)靈芝多糖提取率的影響最大。選擇最優(yōu)方案為A2B2C3，即最佳復(fù)合酶的配比為果膠酶2.5%、纖維素酶2.0%、木瓜蛋白酶2.4%，在此比例下進(jìn)行試驗(yàn)，靈芝多糖最高提取率達(dá)到3.23%。

表6 復(fù)合酶配比正交試驗(yàn)結(jié)果

2.1.3 酶解條件的篩選

1) 酶解時(shí)間的篩選

由酶解時(shí)間對(duì)靈芝多糖提取率的影響可知(圖2)。隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖提取率在80 min時(shí)最高，隨后呈下降趨勢(shì)。

2) 酶解溫度的篩選

由酶解溫度對(duì)靈芝多糖提取率的影響可以看出(圖3)。隨著溫度的升高，多糖類物質(zhì)能夠更好地從細(xì)胞壁釋放，48 ℃時(shí)靈芝多糖提取率達(dá)到最大值,為3.26%。

2.2 靈芝果凍的開發(fā)

2.2.1 β-環(huán)糊精添加量的確定

由β-環(huán)糊精添加量對(duì)靈芝提取液感官品質(zhì)的影響可知(圖4，5)。味覺分析系統(tǒng)顯示，與對(duì)照組相比，靈芝提取液的苦味隨著添加量的增加而下降，但酸味以及酸味后味明顯提高。當(dāng)β-環(huán)糊精的添加量為7.6 g/L時(shí)，靈芝提取液的風(fēng)味最佳，苦味適中，既適當(dāng)?shù)匮谏w，又不會(huì)降低靈芝特有風(fēng)味。因此，根據(jù)味覺系統(tǒng)和感官分析，較適宜的β-環(huán)糊精的添加量為7.6 g/L。

2.2.2 口感調(diào)配及感官優(yōu)化結(jié)果

低聚果糖、冰糖及山楂大棗浸膏3種輔料的添加量對(duì)靈芝提取液感官評(píng)價(jià)的影響見表7。由表7極差分析結(jié)果可知，極差RB(13.3)>RC(8.3)>RA(1.3)，因此改變冰糖使用量對(duì)靈芝提取液口感的影響最大。以K值最佳選擇最優(yōu)方案為A2B2C3，評(píng)分最佳為92分，此時(shí)混合液口感豐富，滋味協(xié)調(diào)，酸甜可口。即低聚果糖添加量0.2%，冰糖添加量8%，山楂大棗浸膏添加量5%。

表7 輔料配比感官評(píng)價(jià)正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2.3 明膠添加量的確定

由表8和圖6可以看出，隨著明膠添加量的增加，果凍的硬度、膠黏性以及彈性都呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，質(zhì)構(gòu)測(cè)定添加量4%的果凍時(shí)，極容易被壓碎，彈性較差；靈芝果凍的感官評(píng)分隨著明膠的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。因此，較適宜的明膠添加量為5%

表8 明膠添加量對(duì)果凍質(zhì)構(gòu)特性的影響

3 討論

3.1 酶添加量對(duì)靈芝多糖提取率的影響

單因素試驗(yàn)結(jié)果顯示，不同種類的蛋白酶對(duì)靈芝多糖提取率影響的差異是由于幾種酶的作用位點(diǎn)不同[23]。靈芝中的主要成分是幾丁質(zhì)、半纖維素等構(gòu)成的木素層；多糖所存在細(xì)胞壁上的果膠和纖維素等物質(zhì)，可以通過添加酶促使其破裂，利于多糖的溶出，增加其溶解度。通過分析，酶添加量增多，多糖提取率下降可能是酶濃度趨于飽和或是由于溶出物質(zhì)過多，雜質(zhì)含量升高，導(dǎo)致提取率下降。

3.2 酶解條件對(duì)多糖提取率的影響

隨著酶解時(shí)間及酶解溫度的提高，靈芝多糖提取率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。提取率降低的原因是由于酶解時(shí)間過長(zhǎng)而引起了多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[24]。并且當(dāng)超過50 ℃時(shí)，由于溫度過高導(dǎo)致酶喪失部分活性，雜質(zhì)溶出量不斷增大，活性物質(zhì)分解使多糖提取率逐漸下降。

3.3 β-環(huán)糊精添加量對(duì)靈芝提取液感官品質(zhì)的影響

由于靈芝提取液偏苦澀，適口性差，其中呈現(xiàn)苦味的主要物質(zhì)是靈芝三萜類物質(zhì)，對(duì)肝臟有一定的保護(hù)作用，所以應(yīng)該進(jìn)行保留，而不適合采用化學(xué)方法去除。結(jié)果表明隨著β-環(huán)糊精的添加，靈芝提取液苦味下降，這是由于β-環(huán)糊精是一種良好的穩(wěn)定劑和嬌味劑，能夠包埋靈芝中苦味三萜類物質(zhì)，消除異味，改善口感；但酸味以及酸味后味明顯提高可能是由于β-環(huán)糊精的物理性狀所致，其稍有果膠香氣，味微甜且?guī)嵛?。靈芝提取液的感官評(píng)分呈現(xiàn)先緩慢增加然后又稍降低的趨勢(shì)是由于一定量的β-環(huán)糊精可包埋靈芝提取液中的苦味；添加量過多又會(huì)造成風(fēng)味的不協(xié)調(diào)，使之出現(xiàn)發(fā)澀的口感，顏色變得渾濁。

3.3 β-環(huán)糊精添加量對(duì)靈芝提取液感官品質(zhì)的影響

明膠是從動(dòng)物表皮和骨骼中提取的多肽高分子聚合物[25-26]，不僅凝凍效果好而且易被人體消化。通過對(duì)果凍質(zhì)構(gòu)測(cè)定和感官評(píng)價(jià)分析，明膠添加量過少成品的凝膠性差、質(zhì)地柔軟，缺乏彈性；添加過多時(shí)，由于果凍缺乏爽滑的口感，質(zhì)地偏硬粗糙，并且組織中含有大量氣泡，感官評(píng)分不高。當(dāng)明膠的添加5%時(shí)，果凍的風(fēng)味色澤及口感最佳，爽滑細(xì)膩，富有彈性。

4 結(jié)論

靈芝多糖的復(fù)合酶法提取率要遠(yuǎn)高于單一酶提取，復(fù)合酶最佳配比為果膠酶2.5%、纖維素酶2.0%、木瓜蛋白酶2.4%；單因素試驗(yàn)優(yōu)化提取條件為：48 ℃酶解80 min，此時(shí)靈芝多糖的提取率為3.26%；β-環(huán)糊精的添加量為7.6 g/L時(shí)，提取液的風(fēng)味最佳，苦味適中；靈芝提取液中加入0.2%的低聚果糖、8%冰糖和5%山楂大棗浸膏時(shí)，滋味豐富，具有很好的感官評(píng)分；通過對(duì)果凍質(zhì)構(gòu)測(cè)定和感官評(píng)價(jià)分析，當(dāng)明膠添加量為5%時(shí)，果凍質(zhì)地光滑細(xì)膩。該配方制作的果凍色澤明亮，口感爽滑，酸甜適口，是一款健康的現(xiàn)代休閑食品。為現(xiàn)代休閑食品行業(yè)提供新思路，以及后續(xù)靈芝的研究和生產(chǎn)提供參考和依據(jù)。